Av Histo_Embrio Sistema Respiratório

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - MODALIDADE
MÉDICA
DISCIPLINA INTERAÇÃO CELULAR II - BMH 243 2020.2
AVALIAÇÃO HISTO/EMBRIO DE SISTEMA RESPIRATÓRIO
Profª. Manuella Lanzetti
Profª. Katia Carneiro
Trio 14
Ana Beatriz da Silva Maciel - DRE: 118166641
Glenda Domingos Mascarenhas - DRE: 119054546
Marianna Ribeiro Cabral - DRE: 119035306
Rio de Janeiro
2021
Artigo: Nmyc plays an essential role during lung development as a
dosage-sensitive regulator of progenitor cell proliferation and differentiation
Referência do artigo: Okubo, Tadashi et al. “Nmyc plays an essential role during lung
development as a dosage-sensitive regulator of progenitor cell proliferation and
differentiation.” Development (Cambridge, England) vol. 132,6 (2005): 1363-74.
doi:10.1242/dev.01678
1) Qual a temática do artigo?
O estudo “Nmyc plays an essential role during lung development as a dosage-sensitive
regulator of progenitor cell proliferation and differentiation” apresenta como temática o
destrinchamento do desenvolvimento pulmonar, através de uma avaliação dos eventos
morfogenéticos que envolvem o processo, principalmente, do equilíbrio entre a expansão de
células progenitoras indiferenciadas e as que se tornam diferenciadas. Assim, com essa
premissa, o trabalho teve como alvo principal a análise do proto-oncogene Nmyc nesse
processo, bem como análises adicionais da proteína Sox9 e ciclina D1, proporcionando um
estudo detalhado com relação ao desenvolvimento proximal-distal e à regulação da
endoderme pulmonar, explorando, principalmente, a relevância da distribuição de Nymc
nesses cenários.
2) O que o presente estudo pretende investigar?
Estudos presentes na literatura consideram o Nmyc como um dos importantes
protagonistas na regulação da embriogênese. Este é um proto-oncogene, que, em estudos
anteriores, foi extremamente relacionado à promoção do ciclo celular de células progenitoras
do sistema nervoso embrionário, por exemplo, à medida que a supressão da sua atividade se
relaciona à redução da proliferação, diferenciação celular prematura e aumento da morte
celular. Em contraste, sua superexpressão nas mesmas células promoveu a progressão do
ciclo celular, aumentando, assim, o processo proliferativo. Mais especificamente no
desenvolvimento do sistema respiratório, foi constatado que a supressão dos níveis de Nmyc
durante o processo compromete de maneira significativa a morfogênese pulmonar, se
mostrando, portanto, um atuante essencial para o desenvolvimento pulmonar adequado.
Entretanto, até o momento presente de formulação do estudo, nenhum outro trabalho tinha se
debruçado em entender melhor o papel de Nmyc e como ele poderia estar regulando a
morfogênese pulmonar.
Assim, a partir dos estudos anteriores com a embriogênese do sistema nervoso, foi
observado um potencial papel de Nmyc na relação de equilíbrio entre as células progenitoras
que estão ou não diferenciadas. Sabendo, então, que a manutenção de um equilíbrio entre a
proliferação de células progenitoras indiferenciadas e sua eventual diferenciação promovem o
desenvolvimento pulmonar de forma adequada, o presente estudo buscou avaliar o efeito
primário de Nmyc na morfogênese pulmonar, principalmente, na promoção e regulação do
equilíbrio mencionado acima. Com isso, buscou-se analisar, primeiramente, como a
expressão de Nmyc é distribuída ao longo do desenvolvimento proximal-distal pulmonar e as
possíveis implicações para tal resultado. Ademais, o grupo também buscou investigar como
níveis mais elevados ou reduzidos deste gene podem estar relacionados com o cessamento do
desenvolvimento pulmonar e com alterações no equilíbrio entre células progenitoras
indiferenciadas e diferenciadas, sendo extremamente importante para o melhor entendimento
desse processo relacionado ao desenvolvimento de patologias. Adicionalmente, pretendeu-se
avaliar as relações de domínios expandidos de Nmyc com outras proteínas, como, por
exemplo, ciclina D1 e Sox9, acrescentando ao conhecimento que vinha sendo adquirido pelos
pesquisadores.
3) Quais os principais resultados obtidos?
De uma forma geral, pode-se dizer que o artigo “Nmyc plays an essential role during lung
development as a dosage-sensitive regulator of progenitor cell proliferation and
differentiation” trouxe para a comunidade científica diversos resultados relevantes que
respondem, conectam e acrescentam ao conhecimento acerca do desenvolvimento do sistema
respiratório, em especial, à morfogênese pulmonar. Um dos principais resultados obtidos, que
inclusive confere nome ao artigo, constatou um papel extremamente essencial de Nmyc
durante o desenvolvimento pulmonar, à medida que permite a manutenção de populações de
células progenitoras proliferativas e indiferenciadas na região distal do divertículo
respiratório e suas ramificações em desenvolvimento, garantindo, assim, um equilíbrio entre a
proliferação e a diferenciação celular durante a sua morfogênese adequada. Entretanto, para
se chegar a essa conclusão, diversos outros resultados foram obtidos e analisados
cautelosamente, e serão, portanto, também discorridos a seguir para garantir uma melhor
compreensão do artigo e do seu resultado central.
No presente estudo, os pesquisadores, ao avaliarem os níveis de expressão de Nmyc no
pulmão embrionário em desenvolvimento, obtiveram um resultado que foi essencial para o
destrinchar e para o entendimento do restante do trabalho. Eles observaram que esse
proto-oncogene é expresso preferencialmente no epitélio distal pulmonar durante o processo
de morfogênese - como revelado nas análises de imunohistoquímica realizadas - e, além
disso, seus níveis de transcritos vão diminuindo significativamente ao longo do
desenvolvimento pulmonar nos diferentes períodos embrionários e, também, nas fases da
vida, sendo mais elevados em pulmões embrionários e extremamente reduzidos no pulmão de
um adulto. Em contraste, eles constataram um aumento de marcadores de diferenciação
celular epitelial - como Aqp5, Sftpc e Sftpa - conforme a progressão do desenvolvimento, o
que é extremamente consistente com o processo de organogênese e com sua maturação para
um funcionamento adequado do sistema. Entretanto, é importante lembrar nesse ponto o fato
de que, mesmo após o nascimento, o sistema respiratório, em especial os pulmões, ainda
percorre processos de maturação, sendo o último sistema a se tornar completamente
funcional.
Ademais, outro resultado encontrado - que se relaciona com a localização predominante da
expressão de Nmyc ao longo do desenvolvimento proximal-distal, mencionado acima -
consistiu na observação de níveis elevados de células marcadas com BrdU e da proteína
ciclina D1 - uma importante reguladora do ciclo celular - também em populações de células
epiteliais imaturas distais. Sendo o BrdU um nucleotídeo sintético capaz de ser incorporado
no lugar da timina durante a duplicação do material genético, técnicas utilizando anticorpos
específicos para ele são de extrema importância para a análise da fase S do ciclo celular.
Assim, foram observadas, em consonância com regiões de alta expressão de Nmyc, uma alta
proporção de células na fase S do ciclo celular, o que pode, inicialmente, indicar um maior
pool de células progenitoras distais imaturas permanecentes no ciclo celular, prevenindo que
estas saiam precocemente do programa para um estado diferenciado e comprometam, assim,
o desenvolvimento do sistema respiratório adequado.
Buscando avaliar os efeitos da superexpressão de Nmyc no desenvolvimento pulmonar, em
grupos experimentais chamados de transgênicos, foi observado pelos pesquisadores do artigo
em questão que esta alteração da expressão de Nmyc - que apresentou diferentes níveis -
compromete a morfogênese pulmonar. Apesar de determinada semelhança macroscópica com
os grupos controles, foram observadas diferenças microscópicas significativas nos grupos
induzidos a superexpressão, como, por exemplo, ausência de alvéolos primitivos delimitados
eorganizados - com suas células altamente diferenciadas - e ausência da barreira hematoaérea
eficaz. Além disso, o grupo também observou um aumento da apoptose de células epiteliais
nos pulmões com superexpressão de Nmyc.
Concomitantemente, um maior número de células em proliferação foi encontrado não só
no endoderma, mas também no mesênquima dos pulmões com superexpressão de Nmyc, em
comparação com o grupo controle selvagem, visto novamente pela incorporação de BrdU e
pela coloração com fosfohistona H3, um grande marcador da mitose. Posteriormente, isso foi
corroborado pela regulação positiva de diversos genes alvos que promovem o crescimento,
metabolismo e a proliferação celular, bem como, especificamente, a replicação de DNA e o
processamento de RNA, a partir das análises de microarray de expressão gênica em pulmões
transgênicos. Foi também observada a regulação positiva de vários genes relacionados à ação
pró-apoptótica, que explica, portanto, a presença de células epiteliais apoptóticas também nos
pulmões com superexpressão de Nmyc. Por outro lado, diversos outros genes foram regulados
negativamente nos pulmões transgênicos, como, principalmente, os que codificam proteínas
importantes dos futuros pneumócitos maduros do tipo I e II, de adesão e organização
estrutural celular. Esses últimos resultados podem estar extremamente relacionados às
diferentes morfologias e disposições celulares observadas nesses grupos em comparação aos
grupos controles, interferindo, assim, no adequado desenvolvimento e funcionalidade
pulmonar.
Em relação à análise específica dos efeitos de Nmyc aumentado no processo de
diferenciação epitelial, o estudo nos mostrou que, diferentemente do que é observado em
pulmões do tipo selvagem em estágio mais avançado do desenvolvimento - com, por
exemplo, Scgblal (marcadores de células de Clara) sendo expresso significativamente no
epitélio proximal e uma alta presença de pneumócitos do tipo II expressando elevados níveis
de Sftpc (proteína surfactante c) - pulmões transgênicos falham em apresentar tais
características localmente delimitadas. Ademais, também foi observada a ausência do fator de
transcrição Sox2 na endoderme proximal pulmonar dos grupos com níveis aumentados de
Nmyc, fator de transcrição este que, como visto em aula, é extremamente importante e
expresso nas regiões proximais do sistema pulmonar em desenvolvimento, marcando a saída
do ciclo celular e diferenciação. Por fim, marcadores de diferenciação celular epitelial, como
Aqp5, SftpA e SftpB, também tiveram sua expressão reduzida nos pulmões transgênicos, nos
permitindo concluir, em conjunto com os outros resultados, que a superexpressão de Nmyc
tende a regular negativamente a diferenciação epitelial de células progenitoras tanto
proximais quanto distais durante o desenvolvimento pulmonar.
Dando seguimento aos resultados encontrados, os pesquisadores observaram um fato
muito interessante que poderia corroborar as últimas descobertas referentes à inibição da
diferenciação celular epitelial das células progenitoras frente a altos níveis de Nmyc. Tal fato
remete à expressão de Sox9, um fator de transcrição que é bastante expresso nas células
progenitoras da região distal da estrutura pulmonar em desenvolvimento - como visto em aula
-, permitindo um pool de células indiferenciadas e proliferativas. Entretanto, nas fases mais
tardias da morfogênese pulmonar embrionária, seus níveis diminuem significativamente, o
que se relaciona com a progressão do processo de diferenciação celular adequado, importante
para a formação dos pneumócitos tipo I e II. Por outro lado, no caso dos pulmões com
superexpressão de Nmyc, o estudo mostrou uma certa manutenção da alta expressão de Sox9
ao longo do período de desenvolvimento, com grandes quantidades expandidas de proteína
Sox9 no epitélio pulmonar, contrastando com uma diminuição da expressão do marcador
específico Scgblal - apesar de ainda expresso em algumas células. Assim, o grupo relatou a
possibilidade da existência de uma relação entre Nmyc e Sox9 no desenvolvimento pulmonar,
também relacionada a uma inibição da diferenciação celular específica das células
progenitoras. Embora não tenham sido feitas análises de superexpressão e deleção de Sox9
nesse contexto, acreditamos que - com base nos conhecimentos adquiridos em aula - essa
relação de altos níveis de Nmyc e alta manutenção de Sox9 poderia estar, sim, envolvida
numa possível inibição da diferenciação celular epitelial e manutenção de células
proliferativas, comprometendo, assim, a morfogênese adequada do pulmão.
Além da avaliação dos efeitos da alta expressão de Nmyc, a exclusão condicional de Nmyc
também foi estudada. Assim, os pesquisadores observaram que tanto camundongos com a
deleção de apenas um alelo de Nmyc quanto com a deleção completa apresentaram
anormalidades no desenvolvimento pulmonar. A grande parte dos filhotes desses dois grupos
morreram ao nascimento - ou logo após - com fenótipos pulmonares extremamente anormais
e graves, com maior predominância das características graves nos animais com deleção
completa. Ademais, também foi visto nesses pulmões com deleção condicional de Nmyc um
aumento do processo apoptótico - marcado pela presença de numerosos detritos celulares -,
redução das ramificações da árvore brônquica, presença de células epiteliais irregulares e
redução do processo proliferativo celular na endoderme - comprovado novamente pela
marcação de BrdU. Ainda nessa premissa, o grupo observou uma redução no número de
células positivas para Sox9 nos pulmões mutantes condicionais, o que parece ser consistente
com os resultados anteriores da existência de uma relação entre Nmyc e Sox9 na manutenção
de células progenitoras proliferativas. Por fim, observaram que a deleção condicional de
Nmyc também levou a uma diferenciação celular precoce, o que, em conjunto com os outros
resultados acima, permite inferir que a deleção de Nmyc leva a uma redução/inibição da
proliferação celular, proporcionando ou uma diferenciação epitelial precoce ou apoptose
celular.
Logo, retomando ao que foi mencionado no início da questão, esses resultados revelam
que Nmyc é extremamente importante para a manutenção de um pool de células progenitoras
imaturas e proliferativas na região distal, que vão dar origem aos diferentes tipos de células
diferenciadas ao longo do eixo próximo-distal pulmonar. Além disso, a constatação de altos
níveis de Sox9 e ciclina D1 nessas regiões também é de suma importância e acrescentam no
entendimento geral do processo. Nmyc, portanto, leva essas células progenitoras distais a
permanecerem dentro do programa de ciclo celular, com maiores chances de proliferarem e
entrarem novamente na fase S do ciclo, impedindo que sejam interrompidas precocemente
para a geração de um estado diferenciado e, assim, comprometam o desenvolvimento
pulmonar. Então, se Nmyc sofrer uma deleção - ainda que parcial -, essas células progenitoras
vão sofrer uma parada no ciclo celular e uma diferenciação precoce ou extensa morte celular,
afetando diretamente o desenvolvimento adequado do pulmão. Entretanto, como visto na
morfogênese pulmonar dos grupos do tipo selvagem, os níveis de Nmyc reduzem ao longo do
processo de formação e maturação, o que nos permite concluir que os diferentes níveis desse
proto-oncogene são essenciais para a regulação dos processos de proliferação das células
progenitoras indiferenciadas distais e a saída destas do ciclo celular para posterior
diferenciação, garantindo um balanço ao longo do eixo proximal-distal para o adequado
desenvolvimento pulmonar.
4) Como estas novas informações se correlacionam com o conteúdo estudado em
histologia?
Com os conhecimentos adquiridos em aula sobre a histologia do sistema respiratório,
pode-se conhecer um pouco mais sobre as funções e importância desse sistema, assim como
as estruturas que o compõem e a necessidade de uma organização adequada para o seu
funcionamento. Uma das correlações pode ser evidenciada ao se analisar a deleção
condicional de Nmyc,que, com base nos resultados do estudo em questão, levou a uma
inibição da proliferação e sobrevivência celular, tendo em vista que algumas células sofreram
apoptose e saíram da camada epitelial e as sobreviventes ficaram mais suscetíveis a sofrer
uma diferenciação precoce. Desse modo, nos pulmões com deleção total ou parcial de Nmyc,
foram observadas - até as etapas finais do desenvolvimento embrionário - ramificações da
árvore brônquica muito reduzidas, diferenciação celular precoce, células epiteliais com
irregularidades no tamanho, com pneumócitos do tipo I revestindo os sacos alveolares e
alguns poucos pneumócitos do tipo II também no septo alveolar, além da presença de muitas
células apoptóticas no lúmen, epitélio e mesênquima das vias aéreas. Tais observações são
consistentes com a perda das funções de Nmyc nesses pulmões, não proporcionando, assim,
uma proliferação celular adequada para a formação de brônquios e bronquíolos, por exemplo,
e impedindo uma organização apropriada das camadas teciduais que compõem essas
estruturas, assim como interferindo em um crescimento celular que permita a forma normal e
funcional das células presentes.
Com isso, os autores fizeram possíveis relações dessa falta de Nmyc com uma competição
entre as células por recursos limitados no meio, constatando que as primeiras células a
sofrerem a deleção condicional de Nmyc - ou até mesmo perderem sua expressão ao longo do
desenvolvimento pulmonar - podem estar em desvantagem em relação às suas células
vizinhas, e por isso, podem acabar sendo forçadas a saírem do ambiente que é necessário para
que haja o seu crescimento e sobrevivência celular. Isso pode ser correlacionado com os
níveis elevados de apoptose observados nas células epiteliais dos pulmões mutantes
condicionais para Nmyc. Assim, é possível observar que níveis adequados de expressão de
diversas proteínas ao longo do desenvolvimento embrionário - neste caso, da organogênese
pulmonar - são de extrema importância para o correto crescimento celular e organização
estrutural, garantindo a funcionalidade desse órgão posteriormente.
Além disso, alterações predominantemente histológicas também foram observadas em
grupos experimentais transgênicos com superexpressão de Nmyc, comprometendo a
morfogênese pulmonar apropriada. Apesar de apresentarem uma estrutura macroscópica
semelhante aos pulmões do tipo selvagem, foi observada, internamente, a ausência de
alvéolos primitivos, presença de células indiferenciadas com formatos cuboidais
predominantes - o que difere de um desenvolvimento pulmonar normal, em que grande parte
das células se diferenciam em pneumócitos do tipo I, células pavimentosas de revestimento -
e grande quantidade de células apoptóticas na luz das vias aéreas. Ademais, outro ponto que
pode ser correlacionado com as aulas de histologia do sistema respiratório é que no estudo
em questão, o grupo também percebeu ausência de uma barreira hematoaérea eficaz e um
mesênquima abundante nos pulmões transgênicos com a superexpressão de Nmyc, além de
constatarem, através de microscopia eletrônica, uma concentração elevada de glicogênio
típico de uma endoderme indiferenciada e ausência dos corpos lamelares dos pneumócitos do
tipo II - que são de extrema importância para a produção do surfactante. Assim, níveis mais
elevados de Nmyc foram associados a uma proliferação celular aumentada, acompanhada
também por apoptoses e inibição da diferenciação celular, o que também compromete a
morfogênese pulmonar.
Dessa forma, podemos concluir trazendo novamente a ideia da necessidade de níveis
adequados e de uma regulação fina de todos os fatores, vias de sinalização e proteínas
envolvidas no desenvolvimento pulmonar para que seja cumprido o processo na sua
totalidade de forma apropriada. Como visto acima, níveis tanto elevados quanto reduzidos do
proto-oncogene Nmyc levaram a alterações na organização das camadas celulares que
compõem diversas estruturas estudadas nas aulas de histologia do sistema respiratório - com
destaque especial para os brônquios, bronquíolos e o parênquima pulmonar - comprometendo
a funcionalidade do sistema e, em alguns casos, até mesmo a viabilidade dos embriões. Isso
nos demonstra também a importância estrutural e organizacional para o desempenho
adequado das funções primordiais de todos os órgãos, sendo essencial conhecer e estudar a
histologia, inclusive para avaliar possíveis alterações e seus desdobramentos em contextos
patológicos eventuais.
5) Elabore uma hipótese para explicar como Myc pode regular a expressão gênica de
Sox2 e Sox9 e regular a balança entre proliferação e diferenciação celular durante
o desenvolvimento do sistema respiratório.
Durante o presente estudo, foi avaliado como a superexpressão de Nmyc poderia
influenciar o desenvolvimento pulmonar, por meio da análise comparativa entre pulmões do
tipo selvagem e pulmões transgênicos. A partir de diversas técnicas - como RT-PCR,
imunohistoquímica e análise de perfil transcricional por microarray, por exemplo - foi
observado que os pulmões com superexpressão de Nmyc apresentavam defeitos histológicos,
em diferentes níveis – de acordo com a expressão do transgene – quando comparados ao do
tipo selvagem, influenciando em um desenvolvimento pulmonar inadequado.
Além disso, outro resultado interessante desse projeto mostrou que a superexpressão de
Nmyc influenciou negativamente a diferenciação celular epitelial, como mostrado nas
análises dos marcadores das células de Clara, por exemplo. A dito de descrição breve, os
pesquisadores observaram que em indivíduos com desenvolvimento pulmonar normal,
existem delimitações muito características entre os diferentes tipos celulares, sendo uma delas
a junção do ducto bronquioalveolar – entre a região dos bronquíolos terminais, com a
presença de células de Clara (mais proximal), e os alvéolos, com presença de pneumócitos do
tipo I e II (mais distal). Em contraste com o que ocorre fisiologicamente, nos transgênicos,
não há formação dessa delimitação entre as células no eixo proximal-distal e, além disso, não
foram constatadas expressão de marcadores celulares específicos para essas regiões. Isso
indicou, portanto, que a superexpressão de Nmyc atrapalha o processo de diferenciação
celular do epitélio pulmonar, e, em conjunto com os outros resultados, mantém as células
progenitoras em constante proliferação, as impedindo de assumir seus destinos proximais ou
distais.
Ademais, ao realizarem o mesmo experimento com a avaliação da expressão do fator de
transcrição Sox2, os pesquisadores chegaram em um resultado muito interessante que se
conecta com muitas informações adquiridas em aula. No tipo selvagem, foi observado que
Sox2 é expresso nas células que compõem a região mais proximal do epitélio. No entanto,
quando olhamos para expressão de Sox2 nas células proximais sob expressão elevada de
Nmyc, é observado que os níveis de Sox2 são extremamente reduzidos. Conforme aprendido
nas aulas de embriologia, sabe-se que o Sox2, ao ser expresso normalmente nas regiões
proximais do endoderma pulmonar em desenvolvimento, indica a saída das células do ciclo
celular para posterior diferenciação nos tipos celulares que vão compor o trato respiratório e,
por fim, os alvéolos pulmonares. Nessa premissa, observamos, a partir da compilação dos
resultados do artigo, que a superexpressão de Nmyc tende a inibir a diferenciação celular, se
relacionando a domínios com redução da expressão de Sox2. Acreditamos, com isso, que
Nmyc pode atuar como um regulador da atividade desse fator de transcrição, reduzindo seus
níveis ao longo do desenvolvimento pulmonar, e, assim, garantindo um pool de células
progenitoras extremamente proliferativas e indiferenciadas.
Além disso, o papel inibitório da diferenciação das células progenitoras desencadeadas por
Nmyc foi, ainda, corroborado pela alta expressão de Sox9 – encontrado, em suma, nas células
que se dispõe na região distal do endoderma pulmonar. Novamente, com base nos
conhecimentos adquiridos em aula, sabemos que Sox9,ao ser altamente expresso na região
distal, permite que as células permaneçam no ciclo celular e indiferenciadas, se proliferando
de forma adequada e organizada a fim de garantir um pool celular eficaz para a posterior
diferenciação total pulmonar. Assim, também é esperado encontrá-lo em níveis elevados nas
fases iniciais da morfogênese do pulmão e ter seus níveis atenuados à medida que são
iniciadas as fases mais tardias do desenvolvimento. No entanto, quando observamos no artigo
os pulmões que apresentam altos níveis de Nmyc, é revelada uma manutenção dos altos níveis
de Sox9, inclusive em fases tardias, além de uma expansão por todo o epitélio pulmonar,
incluindo as regiões proximais, onde, normalmente, esperaríamos encontrar células já
diferenciadas. Não obstante, quando avaliada a exclusão condicional de Nmyc – deleção
completa e parcial – os níveis de Sox9 nas células foi reduzido. Esses achados levaram os
pesquisadores a acreditar que há uma possível relação entre os níveis de Nmyc e Sox9, bem
como um papel conjunto no processo de proliferação celular e inibição da diferenciação das
células progenitoras. Como dito em questões anteriores, assim como eles, nós também
acreditamos nessa possível correlação - somando-se ao papel de Sox2 nesse contexto - e,
portanto, respaldaremos nossa hipótese com base nesses resultados.
Por fim, a partir de todos esses achados, temos, de forma resumida que, a elevada
expressão de Nmyc impede que as células presentes na endoderme pulmonar se diferenciem e
assumam destinos diferentes, mantendo um pool de células proliferativas e indiferenciadas;
além de que esses altos níveis de Nmyc acompanham um aumento significativo dos níveis de
Sox9 em grande parte do epitélio e redução significativa nos níveis de Sox2 nas regiões
proximais, o que compromete o processo adequado da morfogênese pulmonar.
Com base nesses achados, propomos, então, a hipótese de que Nmyc pode ser um
regulador da expressão de Sox2 e Sox9 e, dessa forma, estaria regulando o equilíbrio entre a
proliferação e diferenciação celular da seguinte maneira: com relação a Sox2, Nmyc regularia
negativamente a expressão dessa proteína, o que resultaria na manutenção da proliferação
celular e na indiferenciação das células progenitoras, já que, segundo nosso conhecimento,
Sox2 contribui para a saída do ciclo celular e caracterização da identidade proximal das
células que compõe o endoderma pulmonar ao longo do desenvolvimento; em contraste, com
relação a Sox9, Nmyc atuaria como um regulador positivo tendo em vista que a
superexpressão de Nmyc mantém elevada a expressão de Sox9, sua expansão ao longo do
desenvolvimento pulmonar e seus efeitos – que acreditamos ser conjuntos – no que se
relaciona à indiferenciação e proliferação celular. Além disso, outro motivo que nos leva a
acreditar no papel regulador de Nmyc é o fato de que sua deleção promove uma redução dos
níveis de expressão de Sox9 e propicia a diferenciação das células progenitoras que
passariam a assumir seus destinos proximais ou distais. Nesse caso, teríamos também, a partir
da supressão/deleção de Nmyc, uma regulação positiva de Sox2, podendo, assim,
desempenhar seus papéis na diferenciação celular ao longo do eixo proximal-distal.
Assim, é de se esperar que, ao longo do desenvolvimento pulmonar, os níveis de Nmyc vão
oscilando no eixo proximal-distal, permitindo uma regulação fina de Sox2 e Sox9 e,
posteriormente, um equilíbrio entre as regiões que irão sair do ciclo celular e se diferenciar e
as regiões que continuarão com células altamente proliferativas, mantendo um pool adequado
para o desenvolvimento total e eficaz do pulmão. No final do processo organogênico,
entretanto, a regulação negativa de Nmyc - que já foi comprovada também neste estudo -
permitiria uma expressão total de Sox2 ao longo de todo o epitélio pulmonar, estando, assim,
totalmente diferenciado e adequado para começar a desempenhar suas funções conhecidas.
6) Diante dos seus conhecimentos acerca da histologia e embriologia do sistema
respiratório, e destas novas informações adquiridas com o artigo, que novo estudo
você, como cientista da área, faria? Sua resposta deve abordar tanto aspectos
histológicos quanto da embriologia e contemplar as hipóteses a serem testadas, a
metodologia a ser utilizada e os resultados esperados .
O presente estudo se volta para a análise dos mecanismos envolvidos na expressão de
Nmyc no pulmão e seus efeitos sobre o equilíbrio da proliferação e diferenciação de células
progenitoras que compõem o pulmão durante a embriogênese, bem como essas informações
podem apresentar alta relevância no melhor compreendimento acerca do desenvolvimento de
alguns distúrbios clínicos, como: displasia broncopulmonar, que acomete neonatos
prematuros, e no câncer de pulmão. Ao longo do artigo “Nmyc plays an essential role during
lung development as a dosage-sensitive regulator of progenitor cell proliferation and
differentiation”, os pesquisadores realizaram testes avaliando estados de ganho e perda de
função de Nmyc e como essa superexpressão ou deleção afeta a morfogênese pulmonar.
Assim, como principal resultado do estudo, temos que Nmyc é um fator crucial para a
manutenção do correto desenvolvimento pulmonar, promovendo um pool de células
progenitoras indiferenciadas na região distal - onde é mais expresso -, de forma tal que elas
também se mantenham em estado proliferativo.
É sabido que Nmyc é um dos componentes da família de proto-oncogenes Myc, que
apresenta papel regulador no processo de transcrição, uma vez que se ligam à molécula de
DNA e coordenam uma série de outros processos fundamentais para a sobrevivência celular,
tais como: crescimento, proliferação, replicação, progressão do ciclo, diferenciação celular,
além de estar envolvido no processo de apoptose, como foi relatado no artigo. Além desse
proto-oncogene envolvido no desenvolvimento pulmonar, fomos apresentados em aula a
diversos outros morfógenos importantíssimos durante o processo de organogênese, como o
Wnt. Durante o desenvolvimento do sistema pulmonar, esse morfógeno, mais
especificamente o Wnt2, é secretado por células mesenquimais que derivam do mesoderma
da placa lateral e é responsável por ativar a via de β-catenina – glicoproteína envolvida no
processo de transição epitélio-mesênquima - que, por sua vez, promove a expressão de
Nkx2.1. Isso garante a especificação de células progenitoras respiratórias, presentes na
formação da fenda laringo-traqueal e na porção ventral do divertículo respiratório, sendo
essenciais para o desencadear das primeiras etapas da morfogênese pulmonar.
Além de Nkx2.1, foi relatado no artigo que a via de Wnt também parece estar envolvida
na regulação da expressão de Nmyc, no entanto, ainda não tem-se um conhecimento preciso
do processo e de como seria feita essa regulação. Ademais, sendo do nosso conhecimento que
a interação recíproca entre as células do epitélio respiratório e as células mesenquimais é de
suma importância para o desenvolvimento pulmonar, outro fator se destaca no processo: o
Fgf10. Esse fator - Fgf10 (fator de crescimento de fibroblasto) - é um morfógeno também
secretado pelas células que compõem o mesênquima durante a morfogênese pulmonar
secundária e assume papel fundamental na manutenção da proliferação celular e consequente
formação e regulação dos brotamentos, que darão origem às ramificações da árvore
brônquica até a formação das unidades morfofuncionais do sistema respiratório. Portanto,
achamos válido averiguar também como o Fgf10 e Nmyc poderiam estar coordenando o
processo de proliferação celular ao longo da morfogênese pulmonar.
Sob essa premissa, propomos, então, a hipótese de que as vias de sinalização de Wnt - em
especial Wnt2 -, presentes na fase precoce embrionária do desenvolvimento pulmonar e
importantes para um dos starts do evento, podem estar regulando também a expressão de
Nmyc ao longo do eixo proximal-distal, mantendo sua expressão predominante na região
distal, em possível associação com a expressão recíprocade Fgf10 nas células mesenquimais.
Com isso, propomos avaliar quais os efeitos da superativação e da inibição de Wnt2 sobre a
expressão de Nmyc, avaliando não só os efeitos moleculares mas, principalmente, fenotípicos,
por meio de análises histológicas ao longo do desenvolvimento pulmonar. Assim, poderíamos
não só confirmar o papel regulatório de Wnt2 sobre a expressão de Nmyc, mas sugerir como
essa expressão impacta nas características celulares, em sua diferenciação e, tão logo, no
desenvolvimento do órgão. Além disso, ao investigarmos os mecanismos reguladores de
Wnt2 na expressão de Nmyc durante a morfogênese pulmonar, também buscaríamos observar
quais poderiam ser os efeitos dessa expressão para a manutenção de uma identidade
proliferativa indiferenciada distal associada à expressão de Fgf10. Por fim, gostaríamos
também de avaliar quais seriam as alterações dessa via de Wnt e suas implicações na
expressão de Nmyc e Fgf10 durante o desenvolvimento e progressão do câncer de pulmão,
mais especificamente, no de células pequenas (SCLC - small cell lung cancer), permitindo,
assim, um melhor entendimento do contexto e abrindo novas portas para possíveis terapias
futuras envolvendo essas vias.
Em relação ao viés metodológico desse trabalho proposto, trabalharíamos com 4 possíveis
grupos experimentais, se debruçando em um grupo controle do tipo selvagem (WT), outro
knockout para Wnt2 [Wnt2 (-/-)] - realizado através da tecnologia de edição genética
CRISPR/Cas9 -, um terceiro com superexpressão de Wnt2 (Wnt2super) - através da utilização
de vetores binários de proteínas de fusão com GFP - e, por fim, um grupo com diagnóstico de
câncer de pulmão SCLC. Assim, a partir desses grupos, realizaríamos diversas análises
histológicas, acompanhamento do desenvolvimento pulmonar - como também da progressão
do carcinoma pulmonar - e RT-PCR para avaliação dos transcritos de Wnt2, Nmyc e Fgf10.
Portanto, a fim de avaliar a relação entre Wnt2, Fgf10 e Nmyc, propõe-se o uso da técnica
de imunohistoquímica para atestar a distribuição, localização e expressão desses antígenos ao
longo do endoderma e mesênquima pulmonar. Nesse método, os antígenos em questão vão se
ligar a anticorpos específicos, que podem ser conjugados a uma enzima ou a um fluoróforo,
para produzir coloração que vai variar de acordo com a concentração e/ou distribuição de
cada antígeno, e possibilitar a sua visualização por imunofluorescência. Posteriormente, a
partir da intensidade da coloração de cada proteína/antígeno em questão, as suas respectivas
concentrações podem ser averiguadas através da análise de densitometria.
Além disso, análises histológicas baseadas em coloração hematoxilina-eosina também
seriam apreciadas, a fim de investigar possíveis alterações nas camadas celulares das
estruturas que compõem o sistema respiratório frente aos diferentes níveis de Wnt2, Nmyc e
Fgf10. Em conjunto, propõe-se também o acompanhamento do desenvolvimento
macroscópico pulmonar para averiguar possíveis implicações na lobulação, tamanho e
formato do pulmão, por exemplo.
Por fim, para avaliar os transcritos de Wnt2, Nmyc e Fgf10, propõe-se o uso da técnica de
RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction), que vai utilizar primers
específicos para a sequência de interesse, que vão se ligar ao RNA para amplificar o DNA e
permitir uma análise dos padrões de expressão gênica.
Dessa forma, com base em tudo que foi exposto e aprendido em aula e no artigo em
questão, podemos especular possíveis resultados esperados do trabalho proposto. O primeiro
deles poderia ser observado a partir das análises transcricionais de Nmyc nos grupos [Wnt2
(-/-)] e (Wnt2super), em comparação com os grupos WT. Conforme visto nas aulas de
embriologia, Wnt2 é secretado por células mesenquimais que derivam do mesoderma da
placa lateral e regula indiretamente a especificação de células progenitoras respiratórias para
o início das primeiras etapas da morfogênese pulmonar; e como observado no presente artigo,
Nmyc está presente no epitélio distal pulmonar, garantindo um pool de células indiferenciadas
e proliferativas e, assim, mantendo um equilíbrio ao longo do eixo proximal-distal. Assim,
esperaríamos visualizar uma relação entre a superexpressão de Wnt2 e um aumento nos
níveis de Nmyc, assim como uma redução de Nmyc nos grupos knockout para Wnt2.
Comparando com os grupos selvagens, no entanto, esperaríamos ver uma regulação fina e
adequada desse morfógeno, não só na organização dos progenitores pulmonares no início do
desenvolvimento, como também ao longo do eixo proximal-distal, regulando a expressão de
Nmyc nas últimas regiões e promovendo, assim, a presença de células indiferenciadas
proliferativas para a apropriada morfogênese pulmonar.
Em relação à associação de Wnt2-Nmyc e Fgf10, sendo este último um morfógeno
também secretado pelo mesênquima e importante para a manutenção da proliferação celular
nos brotamentos pulmonares, também esperaríamos encontrar uma regulação positiva de
Fgf10 em grupos com altos níveis de Wnt2 e Nmyc. Além disso, a partir das análises de
imunohistoquímica, poderíamos esclarecer se a expressão de Fgf10 no mesênquima pulmonar
segue uma mesma direção locacional da expressão de Nmyc no epitélio distal, mantendo,
assim, células altamente proliferativas na região - sendo necessário, claro, uma regulação
adequada para o correto desenvolvimento pulmonar.
Mencionando, então, a necessidade de uma regulação precisa e níveis adequados de
fatores para a apropriada organogênese pulmonar, esperamos encontrar também, em relação
ao viés histológico, alterações nas camadas celulares das estruturas brônquicas, bronquiolares
e alveolares nos grupos com superexpressão e deleção de Wnt2. Em relação aos grupos com
alta expressão, por exemplo, poderíamos encontrar uma falha na organização das camadas
teciduais, associada a uma grande presença de células indiferenciadas - visto a manutenção
do pool dessas células proliferativas.
Por fim, mas não menos importante, ao avaliarmos as vias reguladas positivamente no
carcinoma pulmonar, esperaríamos observar altos níveis de Wnt2 - e talvez de outros
morfógenos da família dos Wnt - e também do proto-oncogene Nmyc - de uma forma
possivelmente desregulada -, o que poderia comprovar a formação e progressão tumoral,
visto que o câncer tem como uma das características principais a proliferação descontrolada.
Dessa forma, conseguiríamos observar novamente as implicações de tais alterações nas
estruturas pulmonares, com a presença de grandes massas celulares concentradas. Além
disso, a partir das análises transcricionais, esperaríamos encontrar outras vias de sinalização
ativadas no contexto cancerígeno, podendo se tornar, em conjunto com a desregulação de
Wnt2-Nmyc, possíveis alvos para terapias anti-tumorais.