Engenharia Genética e Terapia Genica - Conceitos gerais e aplicados

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Engenharia genética e terapia gênica ERE
Giovana Martins Zanette
Semana 1
Capitulo 16 do livro: Biologia Molecular e Ingeniería Genética – José Luque & Angel Herraez.
1- Que são enzimas de restrição (ER)? Como se classificam? Quais são relevantes para a
engenharia genética?
As enzimas de restrição tornam possíveis a aplicação de técnicas em DNA, possibilitando seu corte e
incorporação de fragmentos de vetores, que se introduzem nas células anfitriãs e participam da
replicação. São enzimas próprias de bactérias distintas que são classificadas de acordo com a sua
bactéria de origem. São de grande importância para a engenharia genética pois apresentam grande
especificidade de reconhecimento, possibilitando os cortes e incorporações do DNA em sítios de
reconhecimento de restrição específicos.
4- Descreva a função da enzima fosfatasse e da encima ligasse na clonagem.
Elas abrem o vetor ou cortam uma sequência, deixando as oxidrilas reativas para a religação.
Usando uma fosfatasse, ocorr a inibição da religação das estremidades e permitindo o alinhamento
da sequencia.
Usando a ligasse a sequência se torna continua, religando as oxidroxilas.
5- Quais são os principais componentes (de sequência) de um plasmídeo?
Todos os plasmídeos contém pelo menos uma sequência de DNA que serve como uma "origem de
replicação" ou ori (um ponto inicial para a replicação de DNA), e que permite ao DNA do
plasmídeo replicar-se independentemente do DNA cromossómico
Capítulo 1 do livro: Viral Vectors for Gene Therapy - Methods and Protocol - Otto-Wilhelm Merten
&Mohamed Al-Rubeai - Introduction to Viral Vectors - James N. Warnock, Claire Daigre, and
Mohamed Al-Rubeai
7- Quais as características dos adenovírus?
O capsídeo do Ad é uma camada que envolve o núcleo interno que contém o DNA. O genoma
compreende duas regiões principais de transcrição, denominadas região inicial e região tardia. O
genoma do Ad é um DNA linear de fita dupla.
8- Descreva o ciclo de vida dos adenovírus.
A fase inicial da invasão do DNA adenoviral começa quando o vírus entra em contato com uma célula
hospedeira e termina no início da replicação do DNA.Quando o vírus localiza uma célula
hospedeira, o processo de ligação e internalização começa a partir de receptores celulares. O
vírus libera o vírion e o genoma escapa do capsídeo da proteína fazendo o seu caminho para o
núcleo da célula hospedeira. Após a transcrição a fase tardia começa no início da replicação do
DNA viral, formando proteínas que são posteriormente usadas para formar o capsídeo viral ou
para auxiliar na montagem da progênie viral. A célula hospedeira finalmente se desintegra e o
vírus é liberado.
9- Quais as vantagens e desvantagens dos adenovírus? Como cada uma pode ser vantagem ou
desvantagem?
Vantagens
Capacidade de infectar células em divisão e quiescentes
Estabilidade de vetores recombinantes
capacidade para insertos grandes
Não oncogênico (não produzem câncer)
Pode ser produzido em altos títulos (podem ser produzidos em grande quantidade)
Desvantagens
Correção de longo prazo não permitida (a célula fica modificada por um período curto)
Resposta imune humoral e celular de altas doses de vetor
10- Quais as características dos vírus adeno-associados?
Aprender capsídeo sem envelope. Cada sorotipo deste vírus tem seu próprio capsídeo característico
com uma afinidade especial para certos receptores de células hospedeiras, permitindo que seja
usado para atingir uma variedade de tipos de tecido. Apresenta genoma de composição linear.
11- Descreva o ciclo de vida dos vírus adeno-associados
O ciclo de vida deste sorotipo viral começa com a ligação do capsídeo viral à célula hospedeira. A
internalização é seguida rapidamente liberando o genoma viral. Não é totalmente compreendido
como o genoma viral é capaz de se integrar ao núcleo da célula hospedeira; no entanto, os
pesquisadores descobriram que um vírus auxiliar é necessário para penetrar na membrana
nuclear do hospedeiro antes que o genoma do AAV possa iniciar a replicação (29-31). A
replicação começa. O novo DNA é inserido no vírus “eviscerado” A produção de vetores de AAV
requer co-transfecção de células renais embrionárias humanas com o AAV sem intestino e um ou
dois plasmídeos auxiliares.
12- . Quais as vantagens e desvantagens dos vírus adeno-associados? Como cada uma pode ser
vantagem ou desvantagem?
Vantagens
Não patogênico
Ampla gama de tropismo de hospedeiro e tipo de célula
Início lento da expressão gênica
Manter altos níveis de expressão gênica por um longo período de tempo (anos) in vivo
Desvantagens
O tamanho menor limita a quantidade de genes estranhos que podem ser inseridos
Transduzem células em divisão e não divisão.
13- Quais as características dos retrovírus?
O capsídeo retroviral é uma concha de proteína envolvida que contém o genoma viral. A estrutura do
envelope que envolve o capsídeo é na verdade uma bicamada lipídica que se origina da célula
hospedeira. O genoma do retrovírus é um RNA linear, não segmentado, de fita simples.
14- Descreva o ciclo de vida dos retrovírus.
O ciclo de vida do retrovírus começa quando as glicoproteínas do envelope viral se ligam a
receptores específicos da célula hospedeira. O envelope viral então se funde com a membrana
celular do hospedeiro, e o núcleo viral é liberado no citoplasma da célula hospedeira. A
transcriptase reversa viral é usada para criar um genoma de dsDNA a partir do RNA de fita
simples original do vírus. Posteriormente, a integrase viral ajuda o dsDNA recém-formado a se
integrar ao genoma da célula hospedeira. Depois que o vírus se reúne no citoplasma, ele escapa
da célula por brotamento da membrana celular, onde o capsídeo recebe seu envelopes.
16- Quais as características dos Lentivírus?
Os lentivírus, uma subcategoria da família dos retrovírus, são conhecidos como retrovírus complexos
com base nos detalhes do genoma viral.
17- Descreva o ciclo de vida dos Lentivírus.
O ciclo de vida do lentivírus é representativo da família dos retrovírus, em que as glicoproteínas do
envelope viral são atraídas por receptores celulares específicos; o envelope então se funde com
a membrana da célula hospedeira, e o núcleo é liberado no citoplasma. Logo após essa
internalização, o RNA de fita simples é transcrito ao contrário com a ajuda de proteínas virais
para formar um genoma de fita dupla que é incorporado ao genoma do hospedeiro. No entanto,
algumas diferenças importantes ocorrem no ciclo de vida do lentivírus (64). Em primeiro lugar, a
expressão gênica ocorre em duas fases distintas, conhecidas como fases inicial e tardia, que são
separadas pela ligação da proteína rev (79). Em segundo lugar, o lentivírus é capaz de infectar
células que não se dividem por meio de proteínas expressas do gene vpr. Finalmente, o gene tat,
encontrado apenas em retrovírus complexos, é essencial para a replicação do HIV-1 (81).
O vetor de expressão autoinativador (SIN) é outra forma de vetor do lentivírus, em que o promotor U3
é deletado, causando a inativação transcricional do provírus. Esta forma de vetor limita a
mobilidade do genoma e as possibilidades de recombinação na célula hospedeira (78, 82).
Muitas vezes, os vetores usados em testes de terapia gênica recebem um envelope envolvendo a
estrutura do capsídeo que é composto de glicoproteínas muito específicas, a saber, a
glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), que permite ao vetor um alto tropismo e a
capacidade de infectar uma ampla variedade de tipos de células
19- Quais as características dos baculovírus?
O baculovírus mais comumente estudado é conhecido como Autographa californica multiple
nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Originalmente, pensava-se que esse vírus era incapaz de
infectar células de mamíferos; entretanto, em 1983, vários estudos mostraram que o baculovírus
poderia ser internalizado por células de mamíferos (93, 94) e foram usados para a expressão do
interferon b humano (95). Posteriormente, o AcMNPV foi internalizado com sucesso em váriascélulas humanas, com parte do genoma viral atingindo
o núcleo da célula hospedeira (96, 97). Embora o baculovírus não seja o vírus mais amplamente
estudado em terapia gênica, ele não é patogênico para linhagens de células humanas e é
incapaz de se replicar em células de mamíferos. Estas são vantagens de segurança
consideráveis e podem ser uma vantagem distinta em relação a outros vetores virais.
20- Descreva o ciclo de vida dos baculovírus.
O ciclo de vida do baculovírus ainda não é totalmente compreendido; entretanto, os pesquisadores
chegaram a algumas conclusões sobre sua ligação, internalização e absorção nuclear. Embora o
método de interação vírus-célula hospedeira não seja claro, os pesquisadores concordam que a
glicoproteína Gp64 é necessária para que essa interação ocorra (98). Os pesquisadores também
concordam que o vírus é então levado para a célula por meio de alguma forma de endocitose,
possivelmente endocitose mediada por clatrina, embora alguns outros métodos de internalização
possam coexistir (97, 100-102). Uma vez dentro do citoplasma, o vírus se liberta por meio da
acidificação do endossomo (96, 103). Os cientistas concordam que a transferência do
nucleocapsídeo é de alguma forma bloqueada no citoplasma da célula hospedeira, e alguns
dizem que isso se deve aos vários microtúbulos espalhados pelo citoplasma. Esta conclusão é
apoiada pelo fato de que o tempo de transporte diminui quando esses microtúbulos foram
quimicamente desintegrados (104). Uma vez que o genoma viral finalmente atinge o núcleo da
célula hospedeira, ele está pronto para ser absorvido pela célula; no entanto, parece que este
processo de absorção pode variar dependendo do tipo de célula hospedeira. Algumas células
absorvem o genoma diretamente através dos poros nucleares, enquanto outras parecem
transportar o genoma viral para diferentes compartimentos subcelulares. Outros ainda parecem
degradar o genoma viral antes da absorção nuclear (105). Embora os pesquisadores ainda não
tenham entendido completamente o ciclo de vida do baculovírus, este vírus e suas capacidades
estão sendo continuamente estudados.
21- Quais as características dos herpes simplex vírus?
Na verdade, muitas variedades diferentes do HSV foram descobertas. O mais comum deles,
conhecido como HSV-1, é bem conhecido pela pessoa média como a causa viral do herpes
labial. Um dos aspectos mais intrigantes desse vírus é sua capacidade de infectar um hospedeiro
e então permanecer latente por um período antes de reaparecer novamente (119). A pesquisa
sobre esse vírus continua na esperança de que suas características únicas levem a um avanço
na terapia genética.
22- Descreva o ciclo de vida dos herpes simplex vírus.
Na verdade, muitas variedades diferentes do HSV foram descobertas. O mais comum deles,
conhecido como HSV-1, é bem conhecido pela pessoa média como a causa viral do herpes
labial. Um dos aspectos mais intrigantes desse vírus é sua capacidade de infectar um hospedeiro
e então permanecer latente por um período antes de reaparecer novamente
Quando se liga aos receptores da superfície da célula hospedeira via glicoproteínas do envelope
viral. O vírus é então levado para a célula, de onde é entregue ao núcleo. Assim que o vírus
atinge o núcleo, o capsídeo viral se liga à membrana nuclear e libera o DNA viral no núcleo da
célula hospedeira. A transcrição do DNA viral é um processo complexo que envolve várias
etapas com a ajuda de uma variedade de proteínas também são conhecidas como proteínas
iniciais imediatas, proteínas iniciais e proteínas tardias, e a replicação do DNA começa após sua
transcrição. Os vetores defeituosos de replicação funcionam da mesma maneira que os vetores
adenovirais e retrovirais. Os genes envolvidos na replicação do DNA viral são deletados e o gene
estranho de interesse é inserido no genoma viral. As células auxiliares são então usadas para
tomar o lugar dos genes deletados e o vetor está pronto para a infecção.
23- Quais as características dos poxvírus?
O poxvírus é mais conhecido por seu uso como vacina contra a varíola. Foi um dos primeiros vírus
animais a ser usado como vetor de transferência de genes, são naturalmente defeituosos na
replicação na maioria dos tecidos humanos e não têm a capacidade de produzir vírus infecciosos
em células hospedeiras humanas.
24- Descreva o ciclo de vida dos poxvírus.
O ciclo de vida do poxvírus começa quando as glicoproteínas do envelope viral se ligam aos
receptores da superfície da célula hospedeira. Uma vez que o vírus entra no citoplasma,
pensa-se que ele forma um tipo de centro de replicação envolvido pelo retículo endoplasmático
rugoso. Exclusivo para o poxvírus, a replicação do genoma viral realmente ocorre no citoplasma
da célula hospedeira, em oposição ao núcleo da célula hospedeira (129). A expressão gênica
viral é um mecanismo em cascata extremamente complexo que leva à produção de fatores de
transcrição precoces, intermediários e tardios, juntamente com proteínas estruturais e várias
enzimas (130). Os vírions imaturos são formados seguidos pela produção de vírions maduros
que são envolvidos em uma estrutura de membrana dupla pelo trans-Golgi e que são liberados
na membrana da célula hospedeira e reenvolvidos pela bicamada lipídica que compõe a
membrana da célula hospedeira
Semana 2
1- Que é um vetor adenoviral de alta capacidade?
Os vetores adenovirais são amplamente utilizados para a transferência de genes em uma ampla
variedade de tipos de células, é usado como um veículo de transferência para a introdução de
DNA estranho em um alvo célula.
Esses vetores permitiram a eficiência de transdução aprimorada e especificidade para o respectivo
órgãos-alvo e, foi mostrado que o revestimento do capsídeo adenoviral com polietilenoglicol torna
este tipo de vetor menos imunogênico. As novas metodologias para clonagem e manipulação
genomas adenovirais derivados tornam praticamente qualquer sorotipo acessível. Com base em
cromossomos artificiais bacterianos contendo o genoma do vetor adenoviral e métodos para
genética precisa manipulação, qualquer gene pode ser deletado ou inserido.
Para este tipo do vetor, de alta capacidade, as únicas sequências adenovirais necessárias para o
genoma são sequências não codificantes. Além do cassete de expressão do transgene, o genoma
deste vírus pode conter stuffer DNA para estabilização. Este stuffer DNA pode aumentar os níveis de
transcrição dos transgenes ou pode otimizar a eficiência da embalagem.
2- Quais as limitações destes vetores?
Estes vetores incluem toxicidade e imunogenicidade devido às próprias partículas de capsídeo viral,
além de uma resposta imune dirigida contra o próprio produto transgene.
Além disso, o genoma viral sintético pode ser reconhecido por
componentes da resposta imune inata. Além disso, pode haver um risco de aleatoriedade de baixo
nível integração de genomas de vetores adenovirais recombinantes que podem
levar à mutagênese de inserção.
3- Quais são os sistemas de produção?
O primeiro sistema para a produção de HC-AdV foi descrito em 1996. Todos os protocolos
disponíveis no momento ainda estão com base neste princípio. Durante a produção de HC-AdVs,
um vírus auxiliar adenoviral sem os primeiros genes adenovirais E1 e E3 fornece todos os produtos
de genes adenovirais necessários para amplificação, geração de partículas virais e
empacotamento em trans. Para minimizar o empacotamento indesejado de genomas de vírus
auxiliares, o vírus auxiliar contém um sinal de empacotamento, que foi flanqueado por sites loxP.
Durante a produção em uma linha de células produtoras de adenovírus estavelmente
expressando Cre recombinase, locais loxP são reconhecidos e o
o sinal de empacotamento é extirpado. Logo, genomas virais e genomas de HC-AdV são
eficientemente empacotados. Muitos pesquisadores estão restritos ao uso de vetores
adenovirais de primeira ou segunda geração devido ao complexo e sofisticado procedimento de
produção de HC-AdVs.
4- Como se faz a clonagem dos plasmídeos paraeste vetor?
Vários sistemas HC-AdV para clonagem da produção de HC-AdV
plasmídeos estão disponíveis. Estratégias alternativas de clonagem também são baseadas em raras
enzimas de restrição 56,57 ou recombinação homóloga usando
vetores de backbone com diferentes DNA centromérico de mamífero
fragmentado. Para todos os sistemas, o plasmídeo de produção de HC-AdV é
linearizado por digestão com enzima de restrição e transfectado no
linha de células produtoras. O procedimento de clonagem começa com a inserção do
cassete de expressão do transgene incluindo promotor e sinal de poliadenilação.
Semana 5
1- Defina terapia gênica in vivo.
A terapia genética é a transferência de material genético para um paciente para tratar uma doença.
O vetor administrado in vivo é um método diretamente no paciente.
2- Defina terapia gênica ex vivo.
As abordagens de terapia gênica ex vivo para tratar doenças genéticas têm como alvo principalmente
as HSCs, as células de auto-renovação que dão origem a todas as linhagens de células sanguíneas.
Devido às múltiplas divisões celulares que essas células sofrem, seja para se auto-renovar ou se
diferenciar em um tipo de célula específico, o gene terapêutico precisa ser integrado de forma estável
no genoma do hospedeiro para estar presente em todas as células-filhas. O método, diferente do in
vivo envolve células cultivadas retiradas do paciente que são posteriormente transplantadas de volta.
3- Quais os objetivos da terapia gênica? Utilize a figura 2 para descrever os objetivos.
O objetivo do aumento do gene é restaurar a função celular normal, fornecendo uma cópia funcional
de um gene em trans, afetando o próprio gene doente, que ainda permanecerá na célula.
4- Comente as possíveis complicações dos ensaios de terapia gênica com auxílio da tabela 2.
Silenciamento de genes - repressão do promotor Genotoxicidade - complicações decorrentes de
cortes dentro do genoma.
Fenotoxicidade - As complicações decorrentes da superexpressão ou expressão do gene, alterando
o fenótipo.
Imunotoxicidade - resposta imune prejudicial ao vetor ou ao transgene
Risco de transmissão horizontal - quando ocorre liberação de vetor infeccioso para o meio ambiente
Risco de transmissão vertical - transmissão germinativa de DNA doado
5- Comente os primeiros protocolos de terapia gênica ex vivo aplicados a doenças hematológicas.
A primeira abordagem de terapia gênica bem-sucedida em um adulto com β-talassemia foi relatada
em 2010 (26). Com base nas observações anteriores, o condicionamento mieloablativo precedeu a
reinfusão dos HSCs autólogos transduzidos por lentivírus, resultando na produção estável de
hemoglobina e na independência da transfusão por 33 meses. Digno de nota, a maior parte do
benefício terapêutico resultou de um clone de célula dominante, no qual o vetor integrado causou a
ativação transcricional de HMGA2. Esta dominância clonal benigna diminuiu após vários anos (24).
Ensaios clínicos patrocinados pela indústria e acadêmicos usando vetores lentivirais de β-globina
estão agora abertos em vários locais e em vários países (NCT03276455, NCT03207009,
NCT01639690, NCT02453477, NCT02151526). Um relatório recente descreveu a independência da
transfusão após a transferência de genes em 12 dos 13 pacientes com talassemia β com alguma
β-globina funcional (ou seja, genótipos não β0 / β0). Onde a expressão de β-globina estava
completamente ausente (ou seja, genótipo β0 / β0), o volume médio de transfusão anualizado foi
significativamente diminuído, mas as transfusões de hemácias puderam ser interrompidas em
apenas 3 de 9 pacientes (27). Digno de nota, nenhum evento adverso sério relacionado ao
medicamento e nenhuma dominância clonal relacionada à integração do vetor foram observados
neste estudo.
6- Comente os primeiros protocolos de terapia gênica ex vivo aplicados ao tratamento do câncer.
O primeiro ensaio clínico usando células T modificadas com TCR foi relatado em 2006 e descreveu a
regressão objetiva de lesões de melanoma metastático em 2 de 17 pacientes após a transferência de
células adotivas de linfócitos direcionados ao MART-1 (42), abrindo caminho para uma série de
estudos direcionar este e outros antígenos de melanoma. Embora as células modificadas com TCR
tenham sido usadas para tratar diferentes tipos de câncer (revisado em 43), talvez os resultados
clínicos mais encorajadores tenham sido observados para mieloma múltiplo, com taxas de resposta
de até 80% (44).
7- Comente os primeiros protocolos de terapia gênica in vivo aplicados ao fígado.
A transferência de genes mediada por AAV para distrofias retinianas hereditárias forneceu um
tratamento potencial para uma categoria de doenças que carecia de qualquer terapia farmacológica.
A transferência de genes para mutações autossômicas recessivas no gene que codifica a proteína de
65 kDa associada ao epitélio pigmentar da retina (RPE65) representou indiscutivelmente a primeira
prova de conceito clínica de qualquer terapia genética in vivo. Três estudos independentes
(NCT00481546, NCT00516477 e NCT00643747) demonstraram função visual melhorada em vários
pacientes adultos jovens nos meses iniciais após uma única administração sub-retiniana unilateral de
AAV2 (50–52). No entanto, apenas um desses estudos progrediu para injeção no olho contralateral e
um estudo de fase III (53, 54).
8- Comente os primeiros protocolos de terapia gênica in vivo aplicados aos desordens neurais e
neuromusculares.
Os primeiros estudos clínicos utilizando vetores AAV para mediar a entrega de genes ao SNC
humano foram para o tratamento da doença de Canavan (67), doença de Parkinson (68) e
lipofuscinose ceróide neuronal infantil tardia (69). Todos esses testes utilizaram vetores AAV2
entregues localmente a certas áreas do cérebro; a expressão foi confinada a áreas próximas aos
locais de injeção, um objetivo desejável para Parkinson, mas não para as outras indicações. Novos
sorotipos e diferentes técnicas de infusão foram testados para melhorar a distribuição do vetor para
aquelas indicações do SNC que requerem distribuição global do vetor. A distribuição de vetores AAV
no líquido cefalorraquidiano, por meio de administração intracerebroventricular ou intratecal, foi
proposta como uma forma mais eficiente de atingir distribuição global (70)
Semana 7
Capítulo “Terapia Gênica no Câncer” do livro Introdução à Oncologia Molecular.
1- Defina gene supressor tumoral e sua aplicação ao tratamento do câncer.
O gene supressor de tumor, frequentemente na ativados em todos os tipos de tumores, são
responsáveis por regular o ciclo celular e induzir a morte e senescência celular, Bloqueando o
ciclo celular e consequentemente a proliferação das células tumorais como estratégia na terapia
gene cá contra o câncer.
2- Como funcionam os genes suicidas?
A estratégia do gene suicida baseia-se na introdução de um gene viral ou bacteriana nas células
tumorais, permitindo a conversão de uma pró droga não tóxica em uma droga letal para as
células. Os sistemas de Jenny suicidas são promissores são os genes de timina quinase,
derivado do vírus herpes simples que utiliza o ganciclovir como pró droga e o gene da citosina
desaminase que utiliza 5-fluorocitosina como componente não tóxico a ser convertido em droga
letal.
3- Que são vírus oncolíticos?
Preserva sua capacidade réplica ativa, utilizando-se disso como estratégia para potência alisar o
efeito anti tumoral. Diversos vírus possuem tropismos específicos, que podem ser explorados
para iniciar a infecção preferencial dentro de determinado microambiente tumoral, no qual ocorre
a Lise das células tumorais e as novas partículas formadas podem atingir os demais focos da
doença. Além do potencial efeito da Lizi pela replicação tumoral, os vírus oncolíticos são
engenheirados para expressar antígenos associados a tumores, moléculas com estimulação ou
até mesmo gene suicidas.
4- Defina CAR-T-cells.
Uma das maiores novidades no campo Terapia gene cá e mono terapia Contra o câncer. As células Texpressão receptor de antígeno quimérico. Nos pacientes são retiradas de Modificadas através
de um vetor lentiviral. Assim ocorrendo a transo do são dos sinais para montar uma resposta
efetue contra as células tumorais sem o auxílio da ligação das células com estimuladoras da
célula T, potência Lisandro assim uma resposta contra as células tumorais.
Artigo: O´Connor. Genetic medicines: treatment strategies for hereditary disorders.
5- Descreva a manipulação metabólica.
A manipulação metabólica é um conceito básico de um uso de terapia diatetica ou de pequenas
moléculas para compensar um processo biológico desordenada, em alguns casos prevenir as
complicações de terapias usadas para corrigir o final de ano a forma mais simples de
manipulação metabolismo é a modificação da dieta. Para alguns distúrbios a terapia bem
sucedida depende da combinação de dieta com drogas.
6- Descreva o aumento de proteína.
O conceito de aumento de terapia é usado em vários distúrbios hereditários e distúrbios de
coagulação.A técnica purifica a proteína que falta e devolve ao paciente, assim, Se houver um
mecanismo para importar A proteína para um compartimento de célula relevante ao fenótipo
anormal, o tratamento tem sucesso.
7- Descreva o uso de terapia celular na terapia gênica.
O uso da terapia celular na terapia genica pode ser muito promissora. A terapia celular envolve a
administração de células inteiras, tipicamente células-tronco, para o tratamento ou cura de uma
doença. Assim, essa terapia envolvida na terapia gênica manipularam células inteiras e seus
genes em locais de ação no tratamento sendo mais eficientes.
8- Comente os desafios no desenvolvimento das medicinas genéticas.
A medicina genética tem como maior desafio conseguir entregar a nova informação genética e atuar
na sua manutenção pois isso requer defesas imunológicas circunvizinhas que são levantadas
contra o vetor que carrega o novo gene, que será transferido para um número suficiente de
células modificando o fenótipo
Semana 8
Capítulo 7 ”Antisense oligonucleotides and RNA interference do livro” do livro “Challenges in Delivery
of Therapeutic Genomics and Proteomics” DOIÇ 10.1016/B978-0-12-384964-9.00007-4 (2011)
1- Defina moléculas antisenso.
A tecnologia antisense apresenta uma oportunidade de manipular a expressão gênica dentro das
células para tratar um número infinito de doenças e é uma ferramenta poderosa para estudar a
função do gene. A abordagem antisense utiliza agentes antisense para combater várias doenças,
regulando a expressão de um fator específico, cuja presença realmente causa aquela doença em
particular.
2- Defina arresto e silenciamento da transcrição e pós-transcrição.
O silenciamento de genes altamente específico e eficaz de qualquer doença pode ser alcançado por
um conhecimento preciso da sequência de mRNA alvo e do projeto racional de seus agentes
antisense complementares para a regulação negativa de sua mensagem de proteína. Assim, eles
estão sendo amplamente explorados para terapia personalizada de câncer, HIV e outras doenças
virais mutantes [5–8]. O silenciamento de genes também tem um grande potencial como agente
quimiossensibilizador para superar as dificuldades de resistência a drogas e toxicidades
limitantes de dose de agentes quimioterápicos [9]. Essa técnica difere da usada com
medicamentos convencionais, pois verifica precisamente a formação da proteína causadora da
doença ao diminuir sua expressão, em vez de aliviar os sintomas da doença após sua
manifestação. Além disso, essa técnica pode ser diferenciada da abordagem genética por sua
ação no mRNA, expressando a proteína causadora da doença em vez de atuar sobre um gene
defeituoso específico. O sucesso dessa abordagem depende da compreensão da sequência
correta de RNA que carrega a mensagem da proteína responsável pela doença de interesse.
Felizmente, a conclusão do projeto do genoma humano nos dota de uma rica fonte de
informações sobre genes-alvo, para o design racional de drogas antisense em poucas horas,
para pesquisas e testes clínicos.
3- Descreva as principais barreiras para o sucesso da terapia com moléculas antisenso.
O principal obstáculo na navegação dessas moléculas para aprovação regulatória é a entrega
eficiente ao local desejado. Esse desafio pode ser enfrentado com uma melhor compreensão das
várias barreiras formidáveis encontradas, desde o local de entrega até o local de ação dos
medicamentos antisense. Duas limitações principais, são a entrega insuficiente às células-alvo e
efeitos colaterais fora do alvo. Elas podem ser abordadas projetando um sistema de entrega
adequado, por modificações químicas, como o uso de modificações estruturais ou
nanotransportadores, ou então por conjugação com ligantes de direcionamento específicos do
receptor.
4- Descreva o mecanismo de ação dos ODNs.
AS ODNs e ribozimas já estavam na prática clínica como terapia genética muito antes de pequenos
RNAs interferentes (siRNAs) serem desenvolvidos como potenciais agentes medicinais. Em
1992, Fire et al. foram os primeiros a descrever o RNAi como um mecanismo de ação dos AS
ODNs para a destruição do mRNA alvo [19]. São um mecanismo natural de defesa celular, em
virtude do qual a presença de DNA viral de fita dupla desencadeia a degradação do mRNA.
5- Descreva o mecanismo de ação dos siRNAs.
A introdução de siRNA de 20 a 23 nucleotídeos poderia exibir atividade antiviral por meio do bloqueio
da expressão de proteínas virais, o que levou ao progresso do siRNA na terapêutica para
bloquear a produção de proteínas relacionadas à doença.
6- Descreva os benefícios da utilização de moléculas antisenso na terapia.
siRNA é uma porção terapêutica potente e altamente específica; as drogas tradicionais têm alvos
limitados, enquanto devido à conclusão do projeto genoma humana, agentes antisense como
siRNA podem ser projetados para alvos de doença ilimitados; a maioria dos medicamentos atua
no alívio sintomático da doença, inibindo o fator causador da doença, no entanto, a terapia com
siRNA não permite a formação de doenças causadoras de elementos e, portanto, atua para
remover a causa raiz da doença; siRNA pode ser explorado como um agente profilático para
várias doenças epidêmicas conhecidas; a tecnologia antisense pode ser utilizada para a
prevenção e tratamento de doenças mortais como SARS e gripe suína, por desenho específico
de sequência complementar aos genes causadores da doença desses vírus; algumas doenças
são causadas por mutação em um único alelo do gene, e o siRNA pode ser projetado para agir
naquele alelo particular sem afetar o alelo normal; a dificuldade em tratar algumas doenças virais
como HIV é a mutação viral, desse modo, um medicamento eficaz em um determinado momento
não será eficaz para a próxima mutação viral, siRNA pode ser projetado de acordo com a
mutação do gene particular.
Artígo: Singh et al., A review of Antisense Therapeutic interventions for molecular biological targets in
various diseases.
7- Defina Ribosimas e seu mecanismo de ação.
As ribozimas são moléculas de RNA que possuem a capacidade de atuar como catalisadores,ou
seja, de diminuir a energia de ativação de uma reação de forma específica. Tal como as enzimas
proteicas, possuem um centro ativo que se une especificamente a um substrato e que facilita a
sua conversão num produto.
8- Quais as vantagens da terapia antisenso?
Porque são desenhados para que sejam complementares a uma sequência específica de um gene,
ou seja, para que tenham a capacidade de se ligar a uma determinada sequência de RNA
mensageiro (mRNA), evitando assim a expressão da informação anómala, isto é, a produção de
uma proteína anómala.
Semana 9
1- Defina engenharia de genomas. Descreva a mutagêneses dirigida e a substituição de genes
dirigida.
A genética é impulsionada pela capacidade de conectar genótipo à fenótipo. A abordagem clássica é
identificar um novo fenótipo, de ocorrência espontânea ou derivado de mutagênese,
Para identificar o generesponsável e discernir por que as mutações naquele locus têm o efeito
observado. Uma abordagem mais moderna, às vezes chamada de genética reversa, é identificar um
gene de uma sequência genômica para fazer mutações específicas nesse gene e caracterizar o
fenótipo resultante.
Podem ser considerados dois tipos de manipulações genéticas específicas. Em um deles, que
podemos chamar de "substituição de gene direcionada", o objetivo é fazer mudanças localizadas na
sequência, muitas vezes aquelas que irão criar uma mutação nula. No reposicionamento seletivo de
genes, o objetivo é substituir uma sequência existente por outra projetada em laboratório. Este último
permite a introdução de alterações mais sutis e mais extensas.
2- Utilizando a figura 3 e o texto, defina ZFN.
Finger Nucleases ou Nucleases de dedo de zinco é a classe de reagentes de direcionamento que
provou mais versátil e eficaz nos últimos anos, essa proteína sintética tem atividades de ligação
e clivagem fisicamente separáveis. O domínio de clivagem não tem especificidade de sequência
aparente, e foi mostrado que o corte poderia ser redirecionado substituindo domínios de
reconhecimento alternativos pelo natural. O mais útil deles era um conjunto de dedos de zinco
em que cada unidade de 30 aminoácidos ligava um único átomo de zinco. A estrutura cristalina
de um conjunto de três dedos ligados ao DNA mostrou que cada dedo entra em contato
principalmente com 3 pb de DNA de uma forma notavelmente modular (Pavletich e Pabo 1991).
Isso sugeriu que muitas sequências diferentes poderiam ser atacadas fazendo novas montagens
de ZFs.
3- Como as ZFN são desenhadas?
As primeiras ZFNs foram criadas como endonases de restrição quiméricas e mostraram ter atividade
in vitro. As ZFNs de especificidade conhecida mostraram eficiência de clivagem e recombinação
muito alta. O primeiro sucesso com um par de ZFNs projetados de novo para um alvo genômico
ocorreu em Drosophila. Tanto a mutagênese quanto a substituição gênica foram demonstradas no
locus amarelo do soma e, principalmente, na linhagem germinativa. Desde então, pares de ZFNs
para genes individuais foram projetados, estruturados e usados com sucesso em uma ampla
variedade de organismos e tipos de células. Embora as frequências de modificação do alvo variem,
retornos de cerca de 10% de todos os alvos são bastante comuns.
A chave para esses sucessos têm sido os métodos para a liberação de ZFNs e, quando desejado,
um DNA doador. Em células cultivadas, as construções de expressão de ZFNs usam promotores
adequados para o tipo de célula e vetores que podem ser introduzidos por transfecção de DNA ou
infecção por vírus. Os mesmos métodos também são usados para apresentar o doador.
Do artigo Porteus and Carrol. Gene targeting using zinc finger nucleases. NATURE
BIOTECHNOLOGY VOLUME 23 NUMBER 8 AUGUST 2005
4- Como as ZFN são induzidas na célula?
R. - O primeiro locus genômico para o qual as ZFNs projetadas direcionaram com sucesso foi o
gene amarelo da mosca da fruta D. melanogaster, que produziu um par de ZFNs de três dedos
para uma sequência dentro deste gene, com base no fato de que, naquela época, os dedos
tinham foram identificados que se ligariam a todos os tripletos de DNA da forma 5-GNN-3.
Atendendo aos requisitos para o spin-off da ZFN. Duas nucleases de dedo de zinco foram
montadas para reconhecer um local de 9 pb cada. A indução de choque térmico dessas duas
proteínas de transgenes integrados em larvas de mosca levou à mutagênese dirigida ao local
pós-clivagem e, na presença de DNA de doador marcado, à substituição do gene dirigida ao local
por recombinação homóloga. Essas alterações foram transmitidas de forma estável através da
linhagem germinativa e, em estudos iniciais, representaram uma pequena porcentagem de todos
os alvos cromossômicos. Experimentos recentes estenderam este procedimento a dois outros
loci de D. melanogaster, e alvos de frequências de até 25% foram alcançados.
5- pergunta repetida
6- Quais as aplicações das ZFN?
As Possíveis aplicações das ZFS podem ser observadas em usos experimentais: A criação de genes
knockout (linhas celulares, células primárias, animais transgênicos); Criação de mutações pontuais
ou pequenas exclusões em linhas de células permanentes ou primárias; Melhoramento da eficiência
do direcionamento de genes em células ES;Criação de transgênicos direcionados com inserções em
localizações genômicas precisas; Manipulação do genoma em organismos modelo que não possuem
mecanismo de direcionamento de genes (vermes, zebrafish)
Podem ser aplicadas também no desenvolvimento de fármacos: Criando linhas celulares
humanizadas; linhas celulares para validação de alvos de drogas e para triagem de alto rendimento
para novos compostos.
Em aplicações terapêuticas:Corrigem genes em doenças monogênicas; Atuam na Inserção de genes
de forma precisa em locais para corrigir mutações complexas, alterando alelos.
Do artígo Carrol and Beumer. Genome Engineering with TALENs and ZFNs: Repair pathways
and donor design. 2014
7- Como funciona o sistema de reparo de quebras de dupla fita (DSB) nas células?
As nucleases endereçáveis criaram uma pequena revolução na genética, fornecendo os meios para
fazer alterações muito específicas no DNA genômico com grande eficiência. Primeiras nucleases
de dedo de zinco (ZFN), depois nucleases efetoras semelhantes a ativador transcricional
(TALEN) e, mais recentemente, nucleases guiadas por RNA de CRISPR / Cas se tornaram
ferramentas poderosas para a engenharia do genoma. Na verdade, tudo o que esses reagentes
fazem é quebrar o DNA cromossômico nos locais projetados. Então, tudo é deixado nas mãos
das células em que ocorreram as rupturas. O motivo pelo qual isso funciona bem é que as
células detectam quebras de cadeia dupla (DSBs) como danos potencialmente letais e ativam
mecanismos para repará-los.
As vias de reparo do DSB celular se enquadram em duas categorias amplas: aquelas que dependem
de homologia de sequência ampla e aquelas que não dependem. Os últimos são geralmente
classificados como junção terminal não homóloga (NHEJ). Uma característica do reparo
independente de homologia é que muitas vezes é impreciso, pois não tem um modelo a partir do
qual coletar instruções. Os engenheiros do genoma contam com o NHEJ para gerar mutações
locais em locais de clivagem de nuclease
8- Descreva o sistema de reparo de ligação de extremidades não homologas (NHEJ).
R. - NHEJ canônico em muitos organismos requer um conjunto comum de fatores, incluindo uma
ligase de DNA dedicada (ligase IV ou Lig4) e sua proteína associada Xrcc4, e o dímero de
ligação final, Ku70 / Ku80. Quando algum desses fatores é inativado, o NHEJ é reduzido em grau
variável, dependendo do organismo ou do tipo de célula. Os requisitos genéticos para o NHEJ
alternativo não estão bem definidos, embora a DNA ligase III esteja envolvida, pelo menos em
algumas situações.
Não apenas os fatores e as eficiências do NHEJ canônico e da alternativa diferem, mas também os
sindicatos produzidos. Embora ambos os processos produzam inserções e / ou exclusões de
sequências curtas no local da quebra, os eventos que ocorrem na ausência de fatores canônicos
parecem ser mais dependentes de coincidências de sequências curtas na ou perto da quebra,
chamados microhomologias. Os detalhes moleculares da junção final mediada por
microhomologia não estão totalmente resolvidos, mas existem vários modelos plausíveis. Uma
ideia é que as correspondências curtas fornecem um primer transiente e um complexo modelo
que pode ser capturado e amplificado por DNA polimerases. A DNA ligase I poderia completar
esse processo selando os entalhes que permanecem após a síntese de DNA, eliminando a
necessidade de Lig4.
9- Descreva o sistema de reparo por recombinação por homologia (HR).
Embora alguns aspectos possam ser diferentes, as características básicas da UR estimulada por
ruptura em células em divisão mitótica (a meiose é especial) são essencialmente compartilhadas
por todos os organismoseucarióticos. No nível do DNA, cada extremidade da quebra é
ressecada para atividade de nuclease 5 '-> 3', produzindo uma única fita com uma extremidade 3
'livre. Esta extremidade invade a sequência homóloga e é então estendida pela DNA polimerase.
A fita estendida é removida e emparelhada com a fita única da extremidade 3 'exposta da outra
extremidade da quebra original. As atividades da DNA polimerase e da DNA ligase restauram a
integridade do duplex de DNA. Outros requisitos de proteína para o processo também são
conhecidos, o que é chamado de recozimento de fita dependente da síntese (SDSA). A proteína
Rad51 está envolvida na invasão; o Rad54 participa de várias etapas, incluindo extensão da
ponta invasiva; Rad52 é um fator crítico de HR em leveduras, mas desempenha um papel muito
menor em células de mamíferos e não está presente em Drosophila.
Semana 10
1- Como os TAL ́s reconhecem o DNA?
R. Essa tecnologia do uso de nucleases projetadas, proteínas artificiais compostas por um domínio de
ligação de DNA específico para sequência fundido a uma nuclease Fok I não específica que cliva
DNA. Estas nucleases direcionáveis são usadas para induzir a quebra de fita dupla em sítios
específicos de DNA, que são então reparados por mecanismos que podem ser explorados para criar
alterações de sequências no local de clivagem.
2- Como os TAL ́s são construídos? Como funcionam?
R. O bloco principal para projetar o domínio de ligação ao DNA dos TALs é uma repetição altamente
conservada derivada de TALEs de ocorrência natural codificados por Xanthomonas proteobactérias.
Esses TALEs são injetados nas células da planta hospedeira por meio de um sistema de secreção do
Tipo III e se ligam ao DNA genômico para alterar a transcrição nessas células, facilitando assim a
colonização bacteriana patogênica. A ligação do DNA por esses TALEs é mediada por matrizes de
33-35 repetições de aminoácidos altamente conservadas, flanqueadas por domínios adicionais
derivados de TALE nas extremidades do terminal amino e carboxi da matriz. As repetições
individuais do TALE numa matriz especificam uma única base de DNA determinada pela identidade
de dois resídos hipervariáveis tipicamente encontrados nas posições 12 e 13 do domínio. Sabe-se
que o número de repetições em uma matriz corresponde ao comprimento do seu sítio de destino e
isso permitiu a dedução de uma correlação e simples entre os resíduos e a base limitada
3- Quais as aplicações?
R. Os TALENs permitem a introdução eficiente de alterações direcionadas num número de organismos
modelo que anteriormente eram difíceis ou impossíveis de manipular geneticamente. Além disso, os
TALENs também foram usados para modificar genes endógenos. A maioria desses estudos usou um
único par de TALEN para gerar mutações nocaute, mas dois desses relatórios também descreveram
o uso de dois pares TALEN direcionados ao mesmo cromossomo para gerar deleções e/ou inversões
de grandes segmentos cromossômicos. Outro estudo recente também usou TALENs junto com
doadores de oligodesoxinucleotídeos de DNA de fita simples para fazer inserções precisas em
genoma de peixe-zebra. Também pode-se fazer a edição de plantas e animais agrícolas mediada por
nuclease que diminuiu muito o tempo necessário para gerar novas variedades de espécies em
relação a estratpegias de melhoramento tradicional.
Do artigo Araldi et al., Medical applications of clustered regularly interspaced short palindromic repeats
(CRISPR/Cas) tool: A comprehensive overview. Gene 745 (2020) 144636
4- Qual é a função natural do CRISPR/CAS? Como funciona?
R. A função natural do CRISPR/CAS é de ser um mecanismo de defesa imunológico adquirido contra
infecções por DNA exógeno, como um genoma de fago e plasmídeo. Quando archaea ou bactérias
são infectadas por fagos ou plasmídeos, o DNA exógeno pode ser digerido e integrado em um
genoma hospedeiro. Esta ação pode levar à replicação viral através de um ciclo lisogênico que
resulta em um ciclo lítico, a fim de liberar as partículas virais após a montagem. Durante a fase de
adaptação (1), fagos injetam seu material genético no hialoplasma bacteriano. O DNA viral é clivado
pelas nucleases Cas1 e Cas2 (2), o Fragmentos de DNA são inseridos no CRISPR ensaio, onde o DNA
viral (espaçador) é espaçado entre sequências repetidas (3). Quando transcrito, a matriz CRISPR
origina o RNA pré-CRISRP (crRNA), composto por vários espaços (derivados de vírus anteriores DNA
inserido no genoma do hospedeiro) e sequências espaçadas, que hibridizam com o tracrRNA. (4)
Este pré-crRNA é processado durante o estágio de processamento (5) em crRNA, composto por
sequências repetidas e espaçadores ligados ao transativador de crRNA (tracrRNA), resultando em
guia de RNA (gRNA, 6). O gRNA se liga à clease Cas9 nu, resultando em uma ribonucleoproteína
complexo capaz de interferir com homólogos sequências de DNA viral, promovendo o clivagem do
material genético invasor durante o estágio de interferência.
R. Mutações em resíduos específicos do domínio HNH ou RuvC de Cas9 resultaram no desenvolvimento
da Nickase, que é capaz de clivagem apenas em uma única fita de DNA e, portanto, para ser usado
a fim de reparar a mutação. Usando uma estratégia semelhante, foi desenvolvido o Cas9 morto
(dCas9), que pode ser considerado um marco na era CRISPR / Cas9. O dCas9 possui mutações
específicas em ambas os domínios das clivagens (HNH e RuvC) que conferem uma característica
única: a capacidade de se ligar a sequências de DNA alvo sem introdução de DSB. Usando um dCas9
combinado com um gRNA modificado tendo uma proteína fluorescente (GFP - proteína fluorescente
verde e RFP - fluorescente vermelha proteína) ligada a um efford, desenvolveu-se uma rotulagem
multiplexada de loci genômico, conhecido como CRISPRainbow. Esta método pode ser usado para
estudar e identificar loci específicos com precisão, permitindo uma melhor compreensão do território
cromossômico. Usando uma estratégia semelhante, em que o dCas9 é combinado com um gRNA
modificado carregando um adaptador (MS2) ligado ao transcricional ativador, também é possível
regular os níveis de expressão do alvo genes. Esta técnica, conhecido como CRISPRa (ativador), usa
uma proteína tetramérica sintética derivada do vírus Herpes simplex (VP64). Avanços recentes nesta
tecnologia permitiram um aumento de 10 vezes nos níveis de expressão dos genes alvo por meio de
um adaptação do CRISPRa. Esta novo método, denominado CRISPR-SAM (mediador de ativação
sinérgica), combina dois outros.
6- Como desenhar um gRNA?
R. O primeiro passo para o design experimental consiste na identificação das sequências alvo com a
cauda 3’ PAM (5’-NGG-3’). Embora a SpCas9 seja a nuclease mais utilizada, seu uso é restrito. No
entanto, em casos em que esses motivos estão ausentes ou distantes da sequência alvo, o uso de
outro Cas9 que seja capaz de identificar outros PAMs é obrigatório. Nestes casos, o uso de
CHOPCHOP e CRISPOR são recomendados, uma vez que eles podem identificar diferentes PAMs
usando outro Cas9 de diferentes espécies. Algumas características dentro da sequência alvo
também podem ser consideradas durante o planejamento experimental, incluindo o conteúdo de
guanina e adenina e o comprimento da sequência. A análise in silico também pode prever os
eventuais efeitos fora do alvo, que estão relacionados a incompatibilidades. Nesse sentido, algumas
ferramentas, como A ferramenta CRISPR Search and Design, fornece suas informações em uma
tabela descritiva, mostrando as eventuais incompatibilidades em suas coordenadas genômicas. Com
base nessas coordenadas, é possível identificar genes suscetível a edição (fora do alvo). Identificar
esses eventuais desvios é obrigatório na escolha do crRNA, uma vez que incompatibilidades podem
levar ao edição de genes envolvidos em processos celulares, como fornecimento de energia que
pode reduzir a viabilidade celular. Embora essas incompatibilidades possam reduzir a precisão do
crRNA, já mostrou-se que mais de três incompatibilidades geralmente levam à perda de eficiênciade edição. A análise bioinformática é uma etapa crucial para garantir a precisão e sucesso da edição
de genes. A identificação de sequências de gRNA que ligam-se exclusivamente ao gene alvo ou com
um número reduzido de alvos off permite uma redução na concentração de ribonucleoproteína
complexos, o que também evita efeitos fora do alvo. Outra vantagem do CRISPR / Cas9 é a
possibilidade de editar vários genes simultaneamente. Edição multiplex podem ser realizado usando
mais de um gRNA capaz de se ligar a diferentes Sequências de DNA ou sequências repetitivas no
genoma.
7- Como entregar o sistema CRISPR/CAS nas células?
R. Vários métodos de entrega têm sido usados, incluindo eletroporação, nucleofecção, lipofecção,
vetores virais e microinjeção. Métodos baseados em estímulos elétricos, como eletroporação e
nucleofecção, têm sido amplamente utilizados para transfecção. A eletroporação é uma ferramenta
poderosa de transfecção de alta tensão que promove a permeabilização das membranas plasmáticas
quando uma corrente elétrica é aplicada. Nucleofection é um método baseado em eletroporação
novo e de alta eficiência que usa uma combinação de soluções especializadas e parâmetros elétricos
específicos para atingir entrega de DNA de plasmídeo no núcleo da célula. A lipofecção pode ser
considerada uma alternativa de método de entrega devido à sua simplicidade e baixo custo quando
comparado aos métodos com base na estimulação elétrica. A área das placas de 96 poços pode
limitar o número de células semeadas, reduzindo a probabilidade de isolar o editado subclone devido
à baixa eficiência de edição, enquanto a placa de 6 poços requer o consumo de grandes quantidades
de gRNA e nuclease Cas9. As células podem ser semeadas em meio completo. É recomendado ser
substituído por meio Opti-MEM sem soro fetal bovino (FBS), e substituído por meio completo após
seis horas após a transfecção (Raposo et al., 2017). Outra possibilidade é utilizar o meio apropriado
(de acordo com o tipo de célula) sem antibióticos, pois a lipofecção ou eletroporação podem
aumentar a concentração intracelular do antibiótico, aumentando a citotoxicidade. Outras
estratégias também foram utilizadas para entregar o CRISPR / Cas9 sistema, como nanopartículas
de ouro com arginina catiônica, biobalística para protoplastos e vetores virais para entrega in vivo.
No entanto, as condições de transfecção usando vetores virais não são totalmente controlada e, por
isso, há uma preocupação constante com a introdução de mutações adicionais como consequência
do integração viral para hospedar cromatinas. Nesse sentido, o uso de adenovírus (AdVs), vírus não
envelopados com um nucleocapsídeo icosaédrico contendo um DNA de fita dupla, surge como um
sistema de entrega de biossegurança, especialmente para a terapêutica finalidades, uma vez que o
vírus não se integra à cromatina do hospedeiro. Outra alternativa é a aplicação hidrodinâmica, na
qual os componentes do sistema CRISPR / Cas são introduzidos diretamente em uma veia.
8- Como avaliar a eficiência?
R. Os ensaios de clivagem de detecção de incompatibilidade de enzima são rápidos e de baixo custo
métodos usados para estimar a eficiência de edição com base no pixel da banda intensidade. Nestes
ensaios, o alvo sequência é amplificada por PCR convencional, desnaturada e re-hibridizada em
termociclador, levando à formação de um heteroduplex. Incompatibilidades encontradas em um
heteroduplex são reconhecidas e clivado por nucleases como T7E1, que reconhece e cliva diferentes
moléculas de dsDNA se sua estrutura contiver protuberâncias formadas por loops extra-helicoidais
devido à presença de incompatibilidades, e SURVEYOR, a membro da família de nucleases CEL de
endonucleases de DNA de plantas que é capaz de clivar com alta especificidade no lado 3 ′ de
qualquer local incompatível em ambas as fitas de DNA ou T7. No entanto, os ensaios de clivagem de
detecção de incompatibilidade de enzima são semiquantitativos e passam por altos sinais de fundo
quando a sequência polimorfismos estão presentes. O sequenciamento de alto rendimento em torno
do local de quebra induzida é uma alternativa poderosa. No entanto, esta técnica é muito cara e
geralmente exige várias semanas para análise. Com base nisso, desenvolveu uma estratégia rápida
e econômica, que quantifica com precisão a eficiência de edição e identifica os tipos predominantes
de Indels no pool de células alvo. Este método, denominado Tracking of Indels by DEcomposition
(TIDE). A análise de TIDE requer duas reações de PCR: uma empregando o DNA de células não
editadas (parentais), que é usado como um controle, e outro de um pool de células tratadas com o
sistema CRISPR / Cas9. A sequência arquivos de dados (formato .abif ou .scf) são importados para
o TIDE. TIDE usa um ferramenta de genotipagem que pode identificar Indels curtos heterozigotos na
sequência traços, mas não pode resolver sequências com misturas indel complexas. Primeiro, ele
alinha a sequência de gRNA com a sequência de controle para determinar a posição dos locais de
quebra esperados Cas9. Próximo, a região a montante dos locais de quebra da sequência de
controle está alinhada com a sequência obtida a partir do pool de células incubadas com o Sistema
CRISPR / Cas9, a fim de determinar qualquer deslocamento entre os dois leituras de sequência.
9- Como se isolam as células modificadas?
R. Considerando que a maioria da edição de genes é realizada em 94 / 24/6 poços, após 48 h de
transfecção, espera-se obter um pool de células editadas. Este pool celular é composto por
diferentes subclones, uma vez que a edição depende de Indels aleatórios em locais de corte, o que
leva a mutações frameshift. Assim, após a edição, este pool de células será composto de células
com diferentes genótipos e células não editadas que não foram transfectadas devido à cinética do
processo de edição. Com base nisso, é obrigatório isolar os subclones a fim de obter uma população
de células composto exclusivamente por células com o mesmo genótipo. Isto é porque a cultura de
células com diferentes genótipos pode levar a preferencial expansão de um genótipo específico. Este
processo pode ser executado por diferentes estratégias. A maioria comum é o uso de proteína
fluorescente verde aprimorada (EGFP). Assim, as células que exibem fluorescência verde podem ser
isoladas por separação de células ativadas por fluorescência (FACS). No entanto, o FACS não pode
ser usado para selecionar clones de células editados usando o RNP-CRISPR / Cas9 a menos que o
gene alvo codifique uma proteína de membrana, como um cluster diferenciação (CD). Isso ocorre
porque as proteínas citoplasmáticas e nucleares requerem permeabilização celular, o que evita a
expansão de isolados subclones seguindo FACS. Para esses casos, a diluição limitante surge como
uma alternativa. Nisso método, um volume de 100 μL de uma suspensão de células com cerca de 8
células / mL é transferido para uma placa de 96 poços. Cada poço pode ser analisado em um
microscópio invertido para selecionar os poços contendo uma única célula.
10- Quais as aplicações?
R. A edição de gene pode ser usado na terapia gênica e no desenvolvimento de tecnologias de perfil
molecular, levando ao conceito de modelos médicos customizados, nos quais as decisões e práticas
são baseadas nas características de um subgrupo de pacientes (medicina de precisão) ou em
pacientes individuais (personalizados medicina). Foi a partir da década de 2000 que começou a ser
testado em ensaios clínicos de fase I-III como uma opção de tratamento em casos crônicos doença
pulmonar obstrutiva, imunodeficiência-X1 combinada grave, β-talassemia, gliobastoma,; na
medicina regenerativa baseada em iPSC, por exemplo, uma abordagem usando CRISPR / CAS9,
usado células-tronco hematopoiéticas progenitoras humanas geneticamente modificadas (HSPCs)
para imitar os grandes rearranjos no locus β-globina associados à persistência hereditária de
hemoglobina fetal (HPFH) para o tratamento de pacientes com β-hemoglobinopatias; em
tratamentos contracâncer, o sistema CRISPR / Cas9 surge como uma poderoso tecnologia para
interrogar a função do gene, identificar alvos adicionais e prever a resposta da quimioterapia.
Usando o sistema CRISPR / Cas9, com sucesso editou o receptor do fator de crescimento epidérmico
(EGFR) em linhas celulares derivadas de carcinoma anaplásico de tireoide (ATC), reconhecido como
o tipo histológico mais agressivo e mortal de câncer de tireoide sem efeitos fora do alvo, de acordo
com a biologia viral relacionada ao HPV, a integração viral no hospedeiro a cromatina permite a
expressão desregulada de oncoproteínas HPV E6 e E7 de alto risco. A oncoproteína E6 promove a
degradação proteossomal de p53, enquanto o E7 causa a fosforilação de pRb, aumentando a
proliferação celular, levando o CRISPR / Cas9 para o promotor E6 e E7 de HPV-16 (alto risco) em
células SiHa, observaram um acúmulo de p53 e proteínas p21 e a consequente redução da
proliferação celular, sugerindo que CRISPR / Cas9 pode ser considerada uma alternativa ao
tratamento de cânceres relacionados ao HPV; e também na criação de animais modelo, apesar das
promessas de edição de genes usando o sistema CRISPR / Cas, é obrigatório analisar os efeitos
sistêmicos da edição para evitar os resultados catastróficos anteriores da terapia genética, neste
contexto, o modelos animais são cruciais para estudos translacionais.