TCC ICSI - Injeção Intracitoplasmatica em equinos

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*Discente do Curso do curso de Medicina Veterinária da instituição Centro Universitário Octavio Bastos-
UNIFEOB 
**Docente do Curso do curso de Medicina Veterinária da instituição Centro Universitário Octavio Bastos-
UNIFEOB 
 
 
INJEÇÃO INTRACITOPLASMATICA DE ESPERMATOZOIDE 
EM EQUINOS 
 
 
ÉRICA DASDORES SOUSA, THAYNÁ DA CRUZ PADUAN SILVA*; 
KARINA ALBERTI** 
 
 
RESUMO 
 
Ao longo dos anos várias biotecnologias reprodutivas foram criadas ou estudadas e 
melhoradas para atender a demanda de criadores em melhorar a qualidade genética de seu 
rebanho colaborando com a evolução das raças. Diversas pesquisas são realizadas na área da 
reprodução, e a produção in vitro de embriões em equinos vem crescendo a cada dia mais, 
porém com a limitação da espécie, foi se necessário um aprimoramento da técnica FIV, que 
seria a injeção intracitoplasmática de espermatozoide. A ICSI é uma técnica de fertilização in 
vitro, que se baseia na aspiração e injeção de um único espermatozoide no interior de um oócito, 
consequentemente possuindo um grande potencial de utilizar um sêmen de baixa qualidade, ou 
sêmen congelado que tenha poucas doses disponíveis. E também é indicada para éguas que não 
respondem as outras técnicas convencionais, como a transferência de embriões, sendo assim, 
podemos afirmar que está tecnologia reprodutiva, só veio para acrescentar. 
PALAVRAS-CHAVE: Oócito. In vitro. Doadoras. Embrião. Aspiração folicular. 
 
 
 
INTRACYTOPLASMATIC INJECTION OF SPERMATOZOIDS IN 
HORSES 
 
 
ABSTRACT 
 
Over the years, several reproductive biotechnologies have been used or studied and 
improved to meet the demands of breeders and veterinarians, in a herd with a higher genetic 
quality, both in their stallions and in their females because of their high zootechnical value, as 
well as collaborating with the improvement of breeds. Several researches are carried out in the 
reproduction area, and the in vitro production of embryos in horses has been growing every 
day, however, with the limitation of the species, it was necessary to improve the IVF technique, 
which would be an intracytoplasmic sperm injection. An ICSI is an in vitro fertilization 
technique, which is based on the respiration and injection of a single sperm into an oocyte, 
therefore, it allows a great potential for using low quality or frozen semen with few doses 
available. And it is also indicated for waters that do not respond as other applied techniques, 
such as embryo transfer, so we can indicate that it is reproductive technology, so it came to add. 
KEYWORDS: Oocyte. In vitro. Donors. Embryo. Ovum pick up. 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
 
O Brasil possui o quarto maior rebanho de cavalos do mundo, atualmente conta com 
cerca de 5,5 milhões de animais de diversas raças (IBGE, 2016). Segundo dados da Associação 
Brasileira dos Criadores do Cavalo Mangalarga Marchador (ABCCMM), os equinos geram 
uma rentabilidade aproximadamente de 16 bilhões de reais por ano e emprega 3 milhões de 
pessoas. 
O avanço das biotecnologias da reprodução foi um ponto importante para o aumento da 
produção, que facilitou a exploração mais ampla dos animais que possuem uma qualidade 
genética elevada, assim como a conservação do material genético de indivíduos superiores. 
(MORAIS, 2011). 
As biotecnologias da reprodução vêm evoluindo a dezenas de anos. Acredita-se que a 
inseminação artificial (IA) teve seu primeiro relato no ano de 1332, segundo uma lenda, um 
sheik árabe roubou o sêmen de um cavalo promissor da tribo rival com a ajuda de uma esponja 
e inseminou sua égua, e 11 meses após nasceu um potro, porém sem comprovação científica. 
O primeiro registro cientifico de uma IA bem sucedida foi em 1780 quando Lazzaro Spallanzani 
inseminou uma cachorra obtendo 3 filhotes deste experimento (FOOTE, 1982). A maior 
propagação da utilização da IA deu-se a partir da década de 1930 (BRINSKO; VARNER, 
1993). Segundo Squires (2005) a inseminação artificial, foi inicialmente utilizada com a 
finalidade de diminuir contaminação e/ou transmissão de doenças sexualmente transmissíveis 
entre garanhões e éguas. As biotecnologias da reprodução evoluíram em passos largos nos 
últimos anos, motivada pela necessidade dos criadores em incrementar a eficiência reprodutiva 
e a evolução genética dos plantéis. Com isso novas técnicas reprodutivas foram desenvolvidas, 
obtendo um melhor uso das biotecnologias disponíveis para elevar o número de potros obtidos 
por ano com uma carga genética melhor (GOMES; GOMES, 2009). 
A inovação e avanço das biotecnologias da reprodução, busca privilegiar a utilização de 
reprodutores, garanhões e matrizes geneticamente superiores que permitam alcançar bons 
resultados de fertilidade, visando obter um maior número de descendentes que colaborem com 
a evolução genética da raça. Dentre as biotecnologias mais utilizadas em equinos são a 
inseminação artificial, transferência de embriões e a manipulação de sêmen para transporte e 
criopreservação (GONÇALVES et al., 2001). Outra biotecnologia de destaque é a fertilização 
in vitro (FIV) comumente utilizada em animais de produção como bovinos, caprinos e ovinos. 
Nos equinos a técnica não é tão eficiente sobretudo pela dificuldade de realizar a superovulação 
nas éguas (RIERA, 2009; CARNEIRO, 2012). Então para suprir essa deficiência foi 
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desenvolvida a técnica in vitro, para ser utilizada em equinos, que é a Injeção 
Intracitoplasmática em equinos (ICSI). A primeira prenhez gerada de oócitos maturados in 
vitro, utilizando a ICSI foi realizada com sucesso (SQUIRES, 1999), e sendo documentado por 
Choi (2002), mostrando que a ICSI ultrapassou as dificuldades da FIV, atingindo taxas de 
prenhes de aproximadamente 60%. 
Em vista disso, o presente trabalho objetiva descrever a técnica de ICSI na espécie 
equina, e abordar aspectos relacionados ao uso e seus benefícios que justifiquem ou limitem 
sua utilização nos rebanhos. 
 
2. REVISÃO BIBLIOGRAFICA 
 
2.1 Seleção de doadoras 
 
As éguas selecionadas para serem doadoras de oócitos devem ser geneticamente 
superiores para a sua finalidade. O histórico reprodutivo não influencia na escolha das éguas já 
que a técnica não exige que elas sejam férteis, embora precisem ter os ovários ativos para 
produzir oócitos. Muitas éguas elegíveis para ser utilizadas nessa técnica possuem alta 
ocorrência de falhas de ovulação, má conformação da vulva e podem possuir patologias do 
útero, corpo, cornos uterinos e cérvix (ALVARENGA; CARMO, 2007). Os oócitos também 
podem ser provenientes de éguas que já morreram e tiveram seus ovários removidos e 
preservados para a realização da coleta. (CARNEVALE, 2004). É importante que os oócitos 
coletados sejam processados com menos de uma hora post mortem pois apresenta um resultado 
de 36 % comparado com os processados com 26 horas post mortem que tem 10% (BRINSKO, 
2011). 
Segundo Carnevale e Ghinter (1995), a taxa de gestação após a transferência de oócito 
de éguas jovens apresentam um melhor resultado dos oócitos de éguas mais velhas. Pois as 
éguas mais jovens (6 a 10 anos) apresentam um maior desenvolvimento de vesículas 
embrionárias. 
 
2.2 Hormônios 
 
Para a obtenção de oócitos é necessária a aplicação de hormônios exógenos. 
Habitualmente os mais utilizados são: o hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), 
hormônio hCG, e o hormônio luteinizante (LH) ( SQUIRES et al., 2003). 
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O GnRH não apresenta bons resultados na indução da ovulação por causa de sua vida 
curta (SAMPER, 2008). Porém, os análogos do GnRH, como a deslorelina, que demonstra uma 
grande eficácia em acelerar o tempo da ovulação de folículos pré-ovulatorios, devido a 
liberação de LH e FSH proveniente da glândula hipófise anterior (CAMPBELL, 2012). A 
deslorelina quando utilizada na forma injetável, a indução da ovulação ocorre de 40 a 46 horas 
após a aplicação (MCCUE et al., 2007). No entanto,é relatado a ausência de resposta do 
fármaco em vários ciclos estrais, ocorrendo em éguas jovens e idosas (MCKINNON, 2011). 
O hormônio hCG atua na estimulação da progesterona pelo corpo lúteo (KELLY; 
HOYER; WISE, 1988), ele diminui o tempo entre o recrutamento do folículo dominante e a 
ovulação, sendo assim reduz os custos e economiza tempo (CARNEVALE et al., 1995). A 
ovulação com a aplicação de hCG por via intravenosa em éguas que tenham folículo pré-
ovulatório, ocorre em 48 horas (BRINSKO, 2002). Utilizando este protocolo, essas éguas 
apresentam uma maior concentração de progesterona pós ovulação, aumentando a taxa de 
prenhez (KELLY; HOYER; WISE, 1988). 
Dentre estes o hCG é o mais empregado com o objetivo de promover na maturação 
folicular, acelerar a ovulação e diminuir o período de estro. O uso deste hormônio pode permitir 
a ovulação em torno de 40 horas. (FLEURY, 2007). No entanto, segundo Duchamp (1987), as 
aplicações sucessivas de hCG pode provocar uma formação de anticorpos, resultando em 
ineficiência da resposta ovulatória. 
 
2.3 Aspiração folicular 
 
Para Pieterse (1988), entre todas as técnicas desenvolvidas para a coleta de oócitos, a 
aspiração transvaginal guiada por ultrassom é a mais eficiente, com ela é possível recuperar 
oócitos e consequentemente possibilita a produção de um número maior de embriões 
produzidos in vitro.Com a aspiração folicular por via transvaginal é possível a realização, de 
várias coletas, no mesmo animal em diferentes ciclos, por não ser um método muito invasivo 
(CARNEIRO, 2012). 
Para a realização da técnica, é preciso que a doadora seja colocada em um tronco de 
contenção para a retirada de fezes do reto, higienização perianal e sedação o animal 
(RODRIGUES, 2006). O protocolo anestésico é utilizado xilazina intra venosa a 0,3 mg/kg 
associado ao butorfanol endovenoso a 0,01 mg/kg (CARNEVALE, 2010). Cada ovário deve 
ser manipulado e posicionado no fundo da parede vaginal, pela palpação transretal. Após serem 
posicionados essas estruturas serão aspiradas com uma probe ultrassonográfica acoplada com 
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uma agulha de aspiração de tamanho 14G ou 16 G, de calibre duplo para elevar a taxa de 
recuperação dos oócitos (CARNEVALE et al., 2004). Logo após, com a agulha perfura-se a 
parede vaginal para que o folículo seja atingindo. Sendo assim, o liquido folicular é aspirado, 
com o uso de uma bomba de vácuo com pressão de 150 mmHg (CARNEVALE, 2010). 
O próximo passo é lavar o folículo, utiliza-se solução tamponada com heparina a 37º C, 
para evitar a coagulação do material aspirado, em seguida o fluido folicular é acondicionado 
em um copo coletor. Outra opção para o lavado uterino tem sido o uso de Ringer Lactato 
(RODRIGUES et al., 2006). 
Após esse processo, o fluido folicular é depositado na placa de Petri, que deve estar com 
riscas feitas anteriormente, para auxiliar na busca pelo oócitos, com a ajuda de um 
estéromicroscópio binocular (lupa). Localizados os oócitos, são classificados pelos padrões da 
IETS (International Embryo Transfer Society), segundo Mckinnon (1997). Em recuperações de 
oócito entre 6 e 8 dias após ovulação, normalmente são encontrados mórula (Mo), blastocisto 
inicial (Bi), blastocisto (Bl) e/ou blastocisto expandido (Bx). É atribuído um escore de 1 a 5, 
avaliando-o quanto ao formato, simetria, coloração, extrusão celular e integridade de zona 
pelúcida (CARNEVALE et al., 2010). 
É importante que realizem essa avaliação e classificação, pois a qualidade do oócito tem 
relação direta sobre as taxas de prenhez. Embriões com escores baixo, anormalidades 
morfológicas ou que apresentam um tamanho menor do que o normal para sua idade, resultam 
em baixa taxa de prenhez (SQUIRES et al., 2003). 
A seguir, o oócito é passado por um processo de lavagem, em até 10 gotas de meio para 
lavagem de embrião (FLEURY et al., 2001). Comercialmente encontra-se diversos meios de 
lavagem de embrião , como a solução de fosfato tamponada modificada por Dulbeco(DPBS®), 
Embriocare®,Ham’s F10®, TQC Holding Plus® e o Botuembryo Holding®, e cada uma dessas 
soluções contém em sua composição três elementos que são, o tampão de bicarbonato, fosfato 
e switteriônico (GOMES et al, 2016). Em um estudo realizado por Gomes et al (2016), avaliou 
a taxa de recuperação embrionária de acordo com o meio holding, no primeiro grupo, de 80 
embriões coletados, 44 deles foram colocados no meio TQC Holding Plus® , e 33 éguas 
receptoras ficaram gestantes ( 75%). Em um segundo grupo foi utilizado o BotuEmbryo®, de 
36 embriões, obtendo um resultado de 30 éguas receptoras gestantes (83,3%). Em outras 
pesquisas realizadas obtiveram resultados de recuperação embrionária, com o Embriocare® de 
65%, Ham´s F10® um total de 70% e em meio DPBS de 73,3%. 
Essa lavagem proporciona eliminar impurezas existente na zona pelúcida antes de 
aspira-lo na palheta de inovulação (DAELS, 2007). Sendo assim os oócitos estão prontos para 
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serem transferidos imediatamente, maturados in vitro ou serem criopreservados 
(CARNEVALE et al., 2001). 
 
2.4 Maturação de oócitos in vitro 
 
O primeiro relato sobre uma maturação in vitro com sucesso em equinos, foi realizada 
por Fulka e Okolski (1981), primeiramente coletaram oócitos dos ovários em abatedouro e 
maturaram in vitro, e em seguida realizaram a transferência para o oviduto de éguas 
inseminadas. 
Devido à escassez de abatedouros em equinos, que tenham disponíveis ovários para uso 
em estudos e pesquisas, o que limita a técnica em equinos. Para que aconteça o desprendimento 
do cumulus do oócito é necessário que faça lavagens excessivas do folículo, o que demanda 
tempo e cuidado, necessitando de profissionais adequados para a coleta. Com todos esses 
problemas, acaba afetando as pesquisas para as tecnologias de fertilização in vitro e para Injeção 
intracitoplasmática (ICSI) (GALLI et al., 2007). 
A maturação in vitro em equinos é feito em meio de cultivo de tecido denominado TCM-
199, com suplementação de soro bovino fetal, gonadotrofinas e estradiol (CURCIO, 2005; 
PEREIRA et al., 2006). Há disponível outros materiais para a maturação como fluído folicular 
(BOGH et al., 2002), fator de Crescimento semelhante a Insulina-I (IGF-I) (CARNEIRO et al., 
2001; CURCIO, 2005) e Interleucina-1β (IL-1β) (CAILLAUD et al., 2006) e o hormônio de 
Crescimento equino ( eGH) (PEREIRA et al., 2006). 
 
2.5 Injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) 
 
A ICSI é um método de fertilização in vitro, no qual é realizado uma injeção mecânica 
de um único espermatozoide inteiro, ou do núcleo espermático isolado(cabeça) no interior do 
citoplasma do oócito com a assistência de micromanipuladores (GALLI et al., 2007). Além do 
espermatozoide inteiro ou do núcleo, a ICSI possibilita a utilização de células espermáticas 
redondas e alongadas, visto que apresentam uma capacidade fecundante. (HINRICHS, 2005). 
Essa biotecnologia proporciona a utilização de sêmen de baixa qualidade ou que tenham um 
número limitado de doses disponíveis (HEUWIESER et al., 1992). E também pode ser o caso 
de um garanhão de alto valor, porém que morreu recentemente ou que vai ser eutanasiado, 
sendo utilizado os espermatozoides do epidídimo (MARTINS et al., 2001). Choi (2002) obteve 
com a utilização de ICSI 60 % de taxas de prenhez. 
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É preciso que o oócito seja maturo, em metáfase II. Os oócitos podem ser provenientes 
da aspiração folicular transvaginal ou de ovários coletados post-mortem, e a última alternativa 
são os maturados in vitro (HINRICHS et al., 1999). 
Na ICSI, pode se utilizar o sêmen fresco ou criopreservado. A porção de sêmen é lavada, 
e inserida em meio polivinilpirrolidona (PVP). O PVP, melhora a viscosidade do meio, diminui 
a aderência, motilidade dos espermatozoides, o que colabora com a aspiração do 
espermatozoide pela pipeta e seu caminho até o citoplasma do oócito (MATOS, 2004). 
Posteriormente umagota da solução é deslocada para a placa de Petri, que irá ser utilizada como 
câmara de micro injeção (KUROKAWA et al., 2003). É necessário um microscópio invertido 
com micromanipuladores acoplados para o manuseio das células (CRUZ, 2014). 
Os micromanipuladores, contam com um sistema denominado Piezo. Esse sistema faz 
com que a pipeta de injeção espermática produza pulsos mecânicos, que auxiliam na perfuração 
da zona pelúcida e membrana plasmática sem danificar o oócito. (CRUZ, 2014). Segundo 
Kimura et al., (1995) e Kurokawa et al., (2003), descreveu que o espermatozoide é transportado 
até o oócito, o mesmo é fixado por sucção por uma pipeta holding. E com os pulsos piezos, 
ocorre a penetração da zona pelúcida e a cabeça do espermatozoide é injetada. 
Para um sucesso maior na ICSI, é necessário que as pipetas holding tenham um espaço 
interno inferior ao oócito, uma vez que poderá desfigurar o mesmo. O diâmetro externo ter um 
tamanho maior que o oócito. Caso ocorra de o diâmetro externo possuir um tamanho inferior, 
o mesmo não conseguirá imobilizar o oócito para a introdução na zona pelúcida (MARTINS et 
al., 2001). 
O estimulo causado pelas micro injeções de espermatozoides e a estimulação mecânica 
é insatisfatório, na ICSI é preciso que os oócitos sejam ativados artificialmente. (KEEFER et 
al., 1990). Essa ativação pode ser causada por muitos incentivos, como o ionomicina, corrente 
elétrica, etanol e entre vários outros estimulantes (HORIUCHI et al., 2000). 
Os oócitos fertilizados são cultivados in vitro de 7 a 8 dias, quando estão na fase de 
blastócisto, e em seguida pode ser transferido para a receptora selecionada (GALLI et al., 2007). 
 
2.6 Vantagens da ICSI 
As vantagens em utilizar a técnica de ICSI são inúmeras, a principal delas é a 
possibilidade de usar espermatozoides com pouca fertilidade ou imóveis, desde que seu núcleo 
esteja intacto. Além disso, pode ser utilizado as células germinativas masculina, como por 
exemplo, as espermátides arredondadas e alongadas (GRACIANO, 2014). 
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Segundo Martins (2001) o uso desta técnica viabiliza usar o sêmen de um garanhão que 
está prestes a ser eutanasiado ou que morreu a poucas horas e poderá ser coletado o sêmen da 
cauda do epidídimo. Outra vantagem para os criadores é o fato de que com a ICSI, os 
espermatozoides podem ser sexados, portanto, é um excelente recurso na reprodução 
(GRACIANO, 2014). 
A ICSI adianta várias etapas da fertilização, assim como a fusão da membrana, 
penetração e ligação da zona pelúcida (DELL’AQUILA et al., 1997). 
Além disso, é utilizado apenas 1/5 de uma palheta de sêmen, potencializando seu uso. 
Também possibilita sua execução em éguas doadoras que não apresentam uma boa resposta as 
técnicas convencionais reprodução (OLIVEIRA; FERREIRA, 2019) 
 
 
3. CONCLUSÃO 
 
A técnica de ICSI está na vanguarda das biotecnologias reprodutivas, sua utilização 
beneficia sobretudo o aproveitamento de animais importantes que estejam, por quaisquer 
motivos, infértil ou subfértil e possam reproduzir e colaborar com a evolução genética dos 
rebanhos. Está biotecnologia trouxe muitos benefícios como a produção de embriões 
provenientes de oócitos de uma égua doadora que não obtinham respostas eficientes com 
técnicas convencionais, por problemas reprodutivos em útero, oviduto e cérvix, que 
impossibilitem a mesma de fecundar ou manter a gestação. Da mesma forma a técnica é 
benéfica para a utilização de garanhões geneticamente superiores que possuam sêmen de baixa 
qualidade ou que já tenham morrido e possuem pouca reserva genética criopreservada. 
 
 
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