Microbiologia Clínica - Isolamento de Microrganismos - Métodos de Isolamento e Coloração

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Coleta, Transporte e Conservação da Amostra 
▪ O resultado liberado pelo laboratório de microbiologia é consequência da qualidade da amostra 
recebida. O material coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo 
ser eleito o melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as áreas adjacentes. 
▪ A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e 
favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um tratamento não apropriado. 
▪ Pontos importantes na coleta: 
 
Obs.: A coleta do material precisa ser feita antes do início da antibioticoterapia. 
Critérios de segurança: 
 
 
 
 
Coleta
Antes da 
antibiótico
terapia
Instruir 
paciente
Antisepsia
Local mais 
provável
Estágio da 
doença
Quantidade 
suficiente
Pedido 
medico
Segurança
Barreiras de 
proteção
Potencialment
e patogênica
Frascos e 
meios de 
transportes 
apropriados
Não manusear 
a amostra em 
trânsito
Superfície 
externa
Não 
contaminar 
requisição 
médica
Encaminhamen
to imediato
Amostra Tempo Crítico Frascos e Meios de Transporte 
Líquor Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril 
Líquido pleural Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril 
Swab Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril ou meio semi-
sólido (Stuart, Amies) 
Suspeita de anaeróbios 30 minutos Meio de transporte apropriado; 
Evitar o transporte em seringa 
com agulha 
Feridas e tecidos 30 minutos ou até 12 horas 
(meio de transporte) 
Meio de transporte apropriado 
Hemocultura 30 minutos (não refrigerar) Frascos com meio de cultura 
para rotina manual ou 
automatizada 
Trato respiratório 30 minutos Tubo seco estéril 
Trato gastrointestinal 1 hora Tubo seco estéril 
Urina 1 hora ou refrigerada até 24 
horas 
Pote seco estéril 
Fezes 12 horas se em meio de 
transporte 
Cary Blair meio modificado para 
transporte de fezes, com pH 8,4. 
Boa recuperação também para 
Vibrio sp e Campylobacter sp 
 
Critérios de Rejeição 
▪ Erros de identificação: ausência de identificação ou identificação discrepante em relação ao pedido 
médico; 
▪ Amostras inadequadas; 
▪ Material clínico recebido em solução de fixação (formalina); 
▪ Material conservado inadequadamente com relação à temperatura (urinas colhidas há mais de 24 
horas, que ficaram guardadas em geladeira, ou colhidas há mais de 2 horas, sem refrigeração); 
▪ Frascos não estéreis; 
▪ Presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminação na superfície 
externa; 
▪ Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida colhida no mesmo dia e da mesma origem; 
▪ Swab único com múltiplas requisições de testes microbiológicos; 
▪ Swab seco; e 
▪ Culturas para anaeróbios recebidas em condições não apropriadas. 
 
Métodos de Isolamento 
O isolamento é feito em meio de cultura. Trata-se de material nutriente utilizado para promover o 
crescimento de microrganismos. Ele contém nutrientes, água, pH, oxigênio e esterilidade. 
Meios definidos: adição de quantidades precisas de compostos químicos inorgânicos ou orgânicos à 
água destilada. Portanto, a composição química exata de um meio definido (de forma qualitativa e 
quantitativa) é conhecida. Ex.: caldo simples e ágar simples. 
Meios complexos: produtos microbianos, animais ou vegetais, como a caseína, extrato de carne, soja, 
levedura etc. Esses meios podem ser enriquecidos para fastidiosos. Ex.: ágar sangue, ágar chocolate, 
caldo BHI. Desvantagem: sua composição nutricional não é precisamente conhecida. 
 
Meios seletivos: contém compostos que inibem seletivamente o crescimento de alguns 
microrganismos, mas não o de outros. Ex.: Ágar Thayer-Martin, Caldo Selenito. 
 
Meios diferenciais ou seletivo-indicador: aquele ao qual um indicador é adicionado, revelando por 
meio de uma mudança de coloração, se uma reação metabólica em particular ocorreu durante o 
crescimento. Ex.: Ágar MacConkey e Ágar SS. 
 
Obs.: Ao se falar em ágar simples, o meio é apenas solidificante. Todavia, quando o meio for líquido, 
chama-se de caldo. 
Inóculo: microrganismos introduzidos em um meio de cultura para dar início ao crescimento e gerar a 
cultura (produto final). 
Todo o processo de isolamento deve ser feito de maneira asséptica. 
 
▪ A alça é aquecida para esterilização. 
▪ O tubo é destampado. 
▪ A ponta do tubo é passada pela chama para esterilização. 
▪ Apenas a porção estéril da alça entra no tubo. 
▪ O tubo é novamente flambado. 
▪ O tubo é fechado. 
▪ A alça é novamente esterilizada. 
 
1. A alça é esterilizada e uma porção do inóculo é removida do tubo. 
 
2. A semeadura inicial é realizada em uma porção da placa. As estrias subsequentes estão em ângulo 
com a primeira estria. 
 
3. Aspecto de uma placa bem-semeada após a incubação mostra colônias da bactéria Micrococcus 
luteus em uma placa de ágar-sangue. 
A escolha dos meios de cultura utilizados para cada material deve estar relacionada aos agentes 
esperados. 
Crescimento dos microrganismos nos principais meios de culturas utilizados na rotina 
Mais 
Provável 
Ágar 
chocolate 
Ágar 
Sangue 
CLED Mac 
Conkey 
Salm. – 
Shingella 
Caldo TIO 
Gram-
negativo, 
leveduras e 
enterococo 
+ + + + + + 
Gram 
positivo 
+ + + - - + 
Gram-
negativos 
exigentes 
+ + - - - - 
Haemophilus + - - - - - 
Anaeróbios - - - - - +* 
+ Meio dá suporte ao crescimento 
- Meio não dá suporte ao crescimento 
* Principalmente em coluna alta 
 
Técnicas de Semeadura 
Técnica de Semeadura Qualitativa: gradiente decrescente (esgotar) de concentração do inóculo, que 
permita o isolamento de todas as colônias diferentes. 
▪ Descarregar o material num canto da placa; 
▪ Flambar a alça; 
▪ Esfriar a alça em um canto do ágar; 
▪ Semear partindo da ponta da primeira semeadura; e 
▪ A cada mudança de direção, flambar a alça e esfriá-la. 
 
Técnica de Semeadura Quantitativa: semeadura de um volume conhecido de material e a contagem 
do número de UFC (unidades formadoras de colônia) obtidas após incubação. Ex.: urina, trato 
respiratório, cateter etc 
 
 
Avaliação do Crescimento e Contagem 
 
Técnica de Semeadura Quantitativa: 
 
Macroscópicas 
Tamanho
Cor
Hemólise
FormaConsistência
Cheiro
Densidade
Atmosfera de incubação: aeróbia em estufa/anaeróbia em câmara/microaerófila em jarra de 
microaerofilia. 
 
Obs.: A tampa da placa sempre fica para baixo e o meio de cultura sempre fica para cima. Isso acontece 
para que a água de condensação não atinja o local de semeadura das bactérias. 
Tempo e temperatura de incubação: 18-24 horas a 36oC +/- 1ºC 
 
Métodos de Coloração 
▪ Coloração de Gram 
Trata-se de um método de coloração desenvolvido em 1884 pelo médico dinamarquês Christian Gram. 
Esse é o procedimento mais importante na microbiologia. Ele utiliza corantes diferenciais: diferentes 
cores a diferentes tipos de células (Diferenças na estrutura da parede celular) 
Gram-positivos: roxo: 90% da parede celular composta por peptideoglicano; Ácido teicoico. 
Gram-negativos: vermelho: Camada fina de peptideoglicano; Membrana externa composta por 
lipopolissacarídeos. 
▪ Bactérias Gram-negativas apresentam uma fina camada de peptideoglicano, envolta por 
membrana externa lipídica. 
▪ Bactérias Gram-positivas apresentam uma espessa camada de peptideoglicano e não possuem 
membrana externa. 
▪ Desvantagem: baixa sensibilidade de amostras in natura. São necessárias aproximadamente 
100.000 bactérias/mL para que se possa visualizar uma bactéria por campo de microscopia, 
utilizando óleo de imersão (objetivas de 100x). 
Procedimento 
1. Preparação de um esfregaço: 
 
Espalhar a cultura em uma camada fina, sobre a lâmina e secar ao ar. 
2. Fixação pelo calor e coloração: 
 
Passar a lâmina sobre a chama, para fixar pelo calor e cobrir a lâmina com o corante. Após, lavar e secar. 
3. Microscopia: 
 
Pingar uma gota de óleo sobre a lâmina. Por fim, examinarcom a lente objetiva de 100x. 
Etapas 
 
1. Aplicação de cristal violeta (corante púrpura) — 1 Min; 
2. Aplicação de iodo (mordente). Forma complexos com o cristal violeta — 1 Min; 
3. Lavagem com álcool (descoloração). Perda da membrana externa de lipopolissacarídeo — 30s; 
4. Aplicação de safranina/fucsina (contracorante). 
A coloração de Gram é o procedimento microbiológico mais importante. Todavia, nem todas as 
bactérias podem ser visualizadas por ela. 
 
 
Coloração de Ziehl-Neelsen 
Método de coloração, também chamada de coloração acidorresistente, para identificação de todas as 
bactérias do gênero Mycobacterium, incluindo os dois patógenos importantes Mycobacterium 
tuberculosis e Mycobacterium leprae, e do gênero Nocardia. Foi desenvolvida por Franz Ziehl e 
posteriormente melhorada por Friedrich Neelsen, no final do século XIX. 
 
Obs.: No aquecimento, não pode deixar ferver. 
▪ Acidorresistentes: vermelho; 
▪ Não acidorresistentes: azul. 
Obs.: BAAR = Bacilo álcool ácido resistente. (Mycobacterium) 
 
Exame Direto sem Coloração