Morte Celular: Necroptose e Outros Mecanismos

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NECROPTOSE
Programa de Pós-graduação em Patologia Experimental – UEL
Docente: Dra. Alessandra Lourenço Cecchini Armani
NECROSE
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Lesões irreversíveis.
Não regulada e acidental.
Identificação de mortes não-apoptóticas 
programadas:
◦ Necroptose
◦ Partanatos
◦ Piroptose
◦ Ferroptose
◦ NETose
 Figura 1: Mecanismos que induzem à morte por 
necrose.
Retirado de: Vanlangenakker, N., Berghe, T., Krysko, D., Festjens, N., & Vandenabeele, P. 
(2008). Molecular Mechanisms and Pathophysiology of Necrotic Cell Death. Current Molecular 
Medicine, 8(3), 207–220.doi:10.2174/156652408784221306
INTRODUÇÃO
PARTANATOS
Figura 2: Cascata que conduz ao fenômeno 
de Partanatos.
Retirado de: Fatokun, A. A., Dawson, V. L., & Dawson, T. M. 
(2014). Parthanatos: mitochondrial-linked mechanisms and therapeutic
opportunities. British Journal of Pharmacology, 171(8), 2000–
2016. doi:10.1111/bph.12416 
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INTRODUÇÃO
PIROPTOSE
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Figura 3: Mecanismo de piroptose pela 
Gasdermina D.
Retirado de: Shi, J., Gao, W., & Shao, F. (2017). Pyroptosis: Gasdermin-Mediated
Programmed Necrotic Cell Death. Trends in Biochemical Sciences, 42(4), 245–254. 
doi:10.1016/j.tibs.2016.10.004
INTRODUÇÃO
FERROPTOSE
Figura 4: Mecanismo moleculares e 
sinalização da Ferroptose.
Retirado de: Xie, Y., Hou, W., Song, X., Yu, Y., Huang, J., Sun, X., … 
Tang, D. (2016). Ferroptosis: process and function. Cell Death & 
Differentiation, 23(3), 369–379. doi:10.1038/cdd.2015.158
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INTRODUÇÃO
NECROPTOSE
Apoptose + Necrose
◦ Mecanismos programados
◦ Características fenotípicas
Bloqueio do mecanismo de apoptose:
◦ Morte por necrose induzida por TNF.
Fases:
◦ Iniciação
◦ Propagação
◦ Execução
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INTRODUÇÃO
SINALIZAÇÃO
• Principais moléculas envolvidas;
• O heteredimero Casp-8/FLIP cliva 
RIPK1 e RIPK3;
• O complexo FADD/Casp-8/FLIP 
direciona a célula para a apoptose e 
inibe a necroptose.
Fonte: WEINLICH, R., GREEN, D.R. The two
faces of receptor interacting protein kinase-1.
Molecular Cell. N.56, v. 4, p. 469-480, dez.
2014.
SINALIZAÇÃO
• Estudos relatam a ativação direta de RIPK3;
Fonte: WEINLICH, R., GREEN, D.R. The two faces of receptor interacting protein kinase-
1. Molecular Cell. N.56, v. 4, p. 469-480, dez. 2014.
SINALIZAÇÃO
Receptores Envolvidos
• TNFR1;
• CD95 (Fas);
• TRAIL;
Ativação de RIPK1
• IFNR; 
• TLR3/4;
Ativação de RIPK3
SINALIZAÇÃO
Receptores da família TNF
Pode induzir:
• Proliferação;
• Apoptose;
• Necroptose;
• TNFR1;
• Fas (CD95);
•TRAIL;
SINALIZAÇÃO
TOLL-LIKE RECEPTORSSINALIZAÇÃO
Receptor de InterferonSINALIZAÇÃO
Principais proteínas envolvidas
• RIPK1;
• RIPK3;
• MLKL;
SINALIZAÇÃO
RIPK1 (Receptor interacting protein-1)
• Possui 4 domínios:
1. KD = N-terminal kinase
domain;
2. ID = Domínio 
intermediário;
KD = Necroptose e apoptose, dependendo do microambiente;
ID = Ativação de ERK, JNK, p38 e kB;
SINALIZAÇÃO
RIPK1 (Receptor interacting protein-1)
• Possui 4 domínios:
3. RHIM = Domínio C-
terminal;
4. DD = Domínio de 
morte;
RHIM = Recruta RIPK3;
DD = Recruta FADD e Casp-8, apoptose;
SINALIZAÇÃO
Conformações da RIPK1
Conformação fechada: quinase inativa, ativa vias de NFkB e MAPK;
Conformação fechada: quinase ativa, inicia apoptose e necroptose;
SINALIZAÇÃO
RIPK3
• Homólogo a RIPK1;
1. KD = N-terminal kinase 
domain;
2. ID = Domínio intermediário
3. RHIM = Domínio C-terminal;
SINALIZAÇÃO
MLKL (Mixed lineage kinase domain-like protein)
• Molécula efetora da necroptose;
4HB = Domínio N-
terminal;
BR = região de ligação;
KD = domínio C-terminal;
4HB = Formação de poros 
na membrana;
• DONDENLINGER, Y. et al. MLKL compromises plasma
membrane integrity by binding phosphatidylinositol
phosphates. Cell Reports, n. 7, v. 4, p. 971-981, maio,
2014.
SINALIZAÇÃO
➢ Ativação padrão:
INICIALIZAÇÃO Formação do Necrossomo
1. Estímulo do TNF
2. Recrutamento de TRADD
O complexo 1 essencialmente 
previne a morte celular.
INICIALIZAÇÃO Formação do Necrossomo
➢ Ativação padrão:
Ativam a Necroptose se a caspase 8 
estiver ausente.
Formação do complexo 2:
o Defosforilação ou deubiquitinação de RIPK1
o Ocorre a dissociação do TRADD do TNFR
o Podem ser formados diferentes tipos de 
complexo II
o Indução de apoptose na presença de Caspase 8.
INICIALIZAÇÃO Formação do Necrossomo
➢ Ativação padrão:
Complexo IIa inclui o TRADD
A indução da apoptose é 
INDEPENDENTE de RIPK1 e de sua 
atividade.
1. Dissociação do TRADD
2. Recrutamento do FADD
3. Recrutamento e 
ativação da caspase 8
INICIALIZAÇÃO Formação do Necrossomo
➢ Ativação padrão:
Complexo IIb é formado na ausência de TRADD
A indução da apoptose é DEPENDENTE
de RIPK1 e de sua atividade (ativação 
da caspase 8).
1. Ausência de cIAPs, 
TAK1 ou IKKα/β
2. Formação de um 
complexo sem TRADD
3. Ocorre recrutamento 
de FADD.
INICIALIZAÇÃO Formação do Necrossomo
➢ Ativação padrão:
1. Ausência/inativação 
de casp 8
2. RIPK1 recruta e ativa 
RIPK3
3. Formação do 
necrossomo.
Necrossomo complexo IIa:
TRADD
FADD
RIPK1
RIPK3
Necrossomo complexo IIb:
TRADD
FADD
RIPK1
RIPK3
INICIALIZAÇÃO Formação do Necrossomo
➢ Ativação padrão:
▪ Vários outros estímulos podem 
causar necroptose
▪ Indiretos dependem da liberação 
de TNF para a formação do 
necrossomo, descrito 
anteriormente.
Incluem os estímulos:
Ativação de receptores de morte
Estimulação de patógenos e TLR
MAVS (proteína de sinalização 
mitocondrial antiviral)
RIG-I/DDX58
Dano no DNA
INICIALIZAÇÃO Formação do Necrossomo
➢ Ativação padrão:
▪ Algumas substâncias podem ativar 
diretamente a RIPK1, sem a ação 
do TNF
Incluem os estímulos:
Drogas anti-câncer, como 
Obatoclax.
IFNγ
INICIALIZAÇÃO Formação do Necrossomo
➢ Ativação não padrão:
▪ Independente da atividade de 
RIPK1.
▪ É um tipo de formação direta do 
necrossomo
▪ dsRNA ou LPS em fibroblastos e 
células endoteliais → dependente 
do sensor DAI/ZBP1
▪ CMV/HSV vírus → dependente do 
sensor TRIF.
Propagação Inflamação
DAMPs
Propagação Execução
PROPAGAÇÃO
Propagação: Indução da inflamação
✓ Inflamação crônica é induzida pela ação de TNF-α e DAMPs.
TNF-α
• Sinaliza a necroptose;
• TNFR1: Genes inflamatórios;
Funções citotóxicas.
Funções pró-inflamatórias.
DAMPs
1. Proteína 1 da caixa de alta
mobilidade (HMGB-1);
2. Interleucina-1α (IL-1α)
3. Interleucina-33 (IL-33)
PROPAGAÇÃO
Proteína 1 da caixa de alta mobilidade (HMGB-1);
Proteína não-histona Transcrição, replicação e reparo.
Alarmina.
Necroptose HMGB-1
IL-1β
IFN-γ
Inflamação
PROPAGAÇÃO
PROPAGAÇÃO
IL-1α e IL-33
• IL-1α: Processada proteoliticamente e liberada.
• IL-33: Constitutiva, liberada após o dano a membrana.
IL-1α
RIPK3 ou amilóide?
Como se dá a propagação da necroptose? 
• RIPK3 é uma proteína da 
família RIP3 com domínio 
RHIM (motivo de interação 
homotípico RIP).
• Amilóides são essenciais 
para a necroptose induzida 
por TNF.
• Função?
Dimerização
Formação de amilóide:
PROPAGAÇÃO
Propagação: RIPK3 ou amilóide?
Importância da formação de amilóide.
Mutação em 
RHIM.
Inibe a 
formação de 
amiloides.
Mutação em 
RHIM.
Recrutamento 
e ativação de 
RIPK3.
Interferência 
na interação 
homotípica.
PROPAGAÇÃO
Oligomerização de RIPK3:
Propagação: RIPK3 ou amilóide?
Como se dá a propagação da necroptose? 
PROPAGAÇÃO
EXECUÇÃO
RIPK3 FOSFORILAÇÃO
MLKL
Thr357 Ser358 Ser347Ser345
Interior da Alça de Ativação da MLKL
Deslocamento Conformacional de MLKL e Exposição do seu Domínio de 4 hélices;
EXECUÇÃO
✓ Mecanismos 
▪ Direto
▪ Indireto
▪ CAMPK2D
EXECUÇÃO
MLKL PIP
SÍTIO DE 
BAIXA 
AFINIDADE
LIGAÇÃO REARRANJO 
CONFORMACIONAL
MEMBRANA PLASMÁTICAFOSFATIDILINOSITOL FOSFATO
EXECUÇÃO
RIPK3
CAMK2D
A
T
I
V
A
Ç
Ã
O
EXECUÇÃO
MLKL ATUA COMO CANAL DE Mg+
▪ Atividade como canal de Mg+;
▪ Alta seletividade;
▪ Oligomeriza poros maiores e menos seletivos;
NECROSE FISIOLÓGICA
Desenvolvimento embrionário:
◦ C. elegans – as células de Linker moldam as gônodas e depois morrem com morfologianecrótica.
◦ Pintinhos – morfologia necrótica no desenvolvimento e neurônios motores.
◦ Porcos – morfologia necrótica na ponta do saco embrionário durante toda a gravidez.
Necrose secundária: depois de um processo apoptótico não percebido.
Esporádico e em raras circunstâncias ou “plano B” para falha na apoptose.
Não é possível atribuir a necrose fisiológica com a necroptose.
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RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
NECROPTOSE NA DOENÇA
Iniciada por diversos gatilhos:
◦ TNF, Fas, TRAIL, IFN, LPS, dsRNA, Danos no DNA, Estresse no RE, Infecção viral e quimioterápicos.
Associação entre necrose e necroptose:
◦ Descoberta da Necrostatina 1 (Nec-1)
◦ Redução da morte/mortalidade em diversos modelos de doença
◦ AVC, Infarto cardíaco, Síndrome Respiratória Inflamatória Sistêmica (SIRS), Hepatite induzida por 
acetominofeno e lesão renal por reperfusão pós-isquêmica.
Nec-1 utilizada em várias concentrações:
◦ Viés dos estudos.
◦ Resultados diferentes em estudos in vivo e in vitro para a mesma concentração.
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RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
NECROPTOSE NA DOENÇA
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RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
Moléculas estudadas Resultado observado
Nec-1
Inibidor da indolamina 2,3 – dioxigenase (IDO), quebrando a 
imunotolerância aos tumores e os sensibilizando para a morte.
RIPK3-/-
Sobrevivência prolongada na lesão renal por reperfusão, SIRS induzida 
por TNF e pancreatite induzida por ceruletide*, necrose na retina e 
danos hepáticos associados ao abuso de álcool. No entanto, em 
modelos de colite, pode ter papel de regenerar tecido, devido ao 
aumento de sensibilidade do camundongo do estudo.
RIPK1 inativo e RIPK3 ou MLKL 
combinado com knockout de 
caspase-8.
Redução na lesão renal por reperfusão e SIRS induzida por TNF. 
Sugerindo que RIPK1 tem papel na apoptose e necroptose.
NECROPTOSE NA DOENÇA
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RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
Moléculas estudadas Resultado observado
M45 
Mutações não permitem a replicação de citomegalovírus em 
camundongos.
RIPK3-/-
Menor lesão tecidual em infecção por varíola, no entanto, maior título 
viral; Permite a replicação do citomegalovírus para cepas mutantes de 
M45, indicando que a necroptose dependente de RIPK3 previne a 
replicação do CMV.
BENÉFICA EM ALGUNS CASOS DE INFECÇÕES
NECROPTOSE NA DOENÇA
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RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
Shikonina
CHEN, et al. 2003.
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
Lithospermum erythrorhizon
(WADA et al, 2014).
(FU et al, 2013).
(CHEN et al, 2003).
(LIANG et al, 2013).
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
1. Morfologia similar a de células necróticas;
2. Perda da integridade da membrana plasmática;
3. Perda de potenciais de membrana mitocondrial;
4. Ativação de autofagia;
5. Elevação de espécies reativas de oxigênio;
Mecanismos de ação
(HAN et al, 2003).
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
▪ Câncer de ovário resistência à terapêutica pró-apoptose comum, como a 
cisplatina.
▪ Possuem expressão aumentada de RIPK.
Estratégia: Inibição do cIAP por miméticos de SMAC combinadas com a 
inibição das caspases. 
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
c-IAP1 e c-IAP2
TNF-α TNFR-1 TRADD
RIPK1 TRAF2/5
c-IAP1 e c-IAP2 
NF- κB
(McCABE et al, 2014).
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
▪ Ubiquitinação de RIPK1 pela c-IAP1/2 ativa o NFkB, resultando em 
sobrevivência celular.
▪ Por outro lado, a desubiquitinação de RIPK1 ou, a falta de ubiquitinação após 
a degradação de c-IAP1/2 leva à formação de um complexo citosólico que 
inclui FADD e caspase-8.
c-IAP1 e c-IAP2
(McCABE et al, 2014).
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
(McCABE et al, 2014).
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
FTY720
Imunossupressor potente que tem eficácia antitumoral pré-clínica em 
vários modelos de câncer.
▪ Leucemia mielóide crônica, esclerose múltipla, câncer de pulmão e glioblastoma. 
▪ Atua como análogo sintético de ceramida, aliviando a inibição de proteína fosfatase, 
permitindo a sua ativação na necroptose dependente de RIP. 
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
FTY720:
Glioblastoma Humano
• Em células de glioblastoma humano, o tratamento com FTY720 resultou
em vários processos de morte celular, incluindo autofagia, apoptose e
necroptose.
• As propriedades imunossupressoras do FTY720 são independentes da
indução da morte e a sua distinção é possibilitada pela fosforilação
específica da molécula.
• O amplo pré-clínico e eficácia clinicamente estabelecida de FTY720 como
um agente antitumoral fazem desta uma molécula importante para uma
investigação mais aprofundada.
(fonte: usp.br)
(ZHANG; WANG; GING; XU; 2015).
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
▪Foram utilizadas células cancerígenas necroptóticas para induzir a imunidade adaptativa em 
células cancerígenas do cólon em camundongos.
▪ Sendo a apoptose imunogênica, um potencial para a necroptose imunogênica torna-se 
atraente quando a resistência à apoptose deve ser superada. 
▪ Existem vários aspectos da via necroptótica que desempenham papel na tumorigêmese e 
podem ser alvos de tratamento. 
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
Dimerização direta de FADD + Expressão indutível
de RIPK3
Necroptose
Liberação de padrões moleculares associados a 
danos;
Promovem a maturação de CDs;
Promovem a iniciação citotóxica de céls. T;
Levam a produção de IFN.
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
▪ Hipóteses:
▪Envolvimento na morte celular;
▪Desempenho do papel de sinalização de 
sobrevivência;
▪Papel diferencial na sinalização necroptótica;
▪Desregulação no contexto do câncer. 
MiRNAs
RELEVÂNCIA BIOLÓGICA
Referências bibliográficas:
▪Holohan C, Van Schaeybroeck S, Longley DB, Johnston PG. Cancer drug resistance: an evolving paradigm. Nat Rev Cancer 2013; 
13:714- 26;
▪Han W, Li L, Qiu S, Lu Q, Pan Q, Gu Y, Luo J, Hu X. Shikonin circumvents cancer drug resistance by induction of a necroptotic death. 
Mol Cancer Ther 2007; 6:1641-9;
▪Chen X, Yang L, Zhang N, Turpin JA, Buckheit RW, Osterling C, Oppenheim JJ, Howard OM. Shikonin, a component of chinese 
herbal medicine, inhibits chemokine receptor function and suppresses human immunodeficiency virus type 1. Antimicrobial 
agents and chemotherapy 2003; 47:2810-6;
▪Liang D, Sun Y, Shen Y, Li F, Song X, Zhou E, Zhao F, Liu Z, Fu Y, Guo M, et al. Shikonin exerts anti-inflammatory effects in a murine 
model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibiting the nuclear factor-kappaB signaling pathway. Int 
Immunopharmacol 2013; 16:475- 80;
▪Fu Z, Deng B, Liao Y, Shan L, Yin F, Wang Z, Zeng H, Zuo D, Hua Y, Cai Z. The anti-tumor effect of shikonin on osteosarcoma by 
inducing RIP1 and RIP3 dependent necroptosis. BMC Cancer 2013; 13:580;
▪Wada N, Kawano Y, Fujiwara S, Kikukawa Y, Okuno Y, Tasaki M, Ueda M, Ando Y, Yoshinaga K, Ri M, et al. Shikonin, dually 
functions as a proteasome inhibitor and a necroptosis inducer in multiple myeloma cells. Int J Oncol 2015; 46:963-72
▪McCabe KE, Bacos K, Lu D, Delaney JR, Axelrod J, Potter MD, Vamos M, Wong V, Cosford ND, Xiang R, et al. Triggering 
necroptosis in cisplatin and IAP antagonist-resistant ovarian carcinoma. Cell Death Dis 2014; 5:e1496; 
▪Zhang L, Wang H, Ding K, Xu J. FTY720 induces autophagy-related apoptosis and necroptosis in human glioblastoma cells. 
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▪Aaes TL, Kaczmarek A, Delvaeye T, De Craene B, De Koker S, Heyndrickx L, Delrue I, Taminau J, Wiernicki B, De Groote P, et al. 
Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Antitumor Immunity. Cell Rep 2016; 15:274-87;