ENZIMAS

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ENZIMAS
A TEORIA DE COLISÃO explica como as reações químicas ocorrem e como certos
fatores afetam a taxa dessas reações. A base da teoria de colisão é que todos os átomos, íons
e moléculas estão em movimento constante e que, portanto, colidem constantemente uns com
os outros. A energia transferida pelas partículas na colisão pode romper suas estruturas
eletrônicas o suficiente para quebrar as ligações químicas ou formar novas ligações.
Diversos fatores determinam se uma colisão irá causar uma reação química: a
velocidade das partículas colidindo, sua energia e suas configurações químicas
específicas. Até certo ponto, quanto mais velozes as partículas estiverem, maior é a
probabilidade de que sua colisão provoque uma reação. Além disso, cada reação química
requer um nível específico de energia. Contudo, mesmo que as partículas em colisão tenham a
energia mínima necessária para a reação, nenhuma reação ocorrerá a menos que as
partículas estejam corretamente orientadas uma em relação à outra.
Vamos presumir que moléculas da substância AB (o reagente) serão convertidas em
moléculas das substâncias A e B (os produtos). Em uma dada população de moléculas da
substância AB, em uma temperatura específica, algumas moléculas têm relativamente pouca
energia; a maioria da população tem uma quantidade média de energia; e uma pequena parcela
da população tem alta energia.
Se apenas as moléculas AB de alta energia forem capazes de reagir para serem
convertidas em moléculas A e B, então somente uma quantidade pequena de moléculas
possui energia suficiente para reagir em uma colisão em um determinado momento.
A energia de colisão requerida para uma reação química é sua ENERGIA DE ATIVAÇÃO,
que é a quantidade de energia necessária para romper a estabilidade da configuração
eletrônica de qualquer molécula específica para que os elétrons possam ser reorganizados.
A TAXA DE REAÇÃO – a frequência das colisões contendo energia suficiente para que a
reação aconteça – depende do número de moléculas reagentes que estejam no nível da energia de
ativação ou acima dela.
Uma maneira de aumentar a taxa de reação de uma substância é elevar sua temperatura. Ao
fazer as moléculas se moverem mais rapidamente, o calor aumenta tanto a frequência das colisões
quanto o número de moléculas que atingem o nível da energia de ativação. O número de colisões
também aumenta quando a pressão é aumentada ou quando os reagentes estão mais
concentrados (pois a distância entre as moléculas é, dessa forma, reduzida).
Nos sistemas vivos, as enzimas aumentam a taxa de reação sem elevar a temperatura.
ENZIMAS E REAÇÕES QUÍMICAS
As substâncias que podem acelerar uma reação química sem que ela seja alterada são chamadas de
CATALISADORES. Nas células vivas, as enzimas servem de catalisadores biológicos.
Como catalisadores, as enzimas são específicas. Cada uma atua em uma substância específica,
chamada de SUBSTRATO DA ENZIMA (ou SUBSTRATOS, quando há dois ou mais reagentes), e cada
uma catalisa apenas uma reação.
Por exemplo, a sacarose (açúcar de mesa) é o substrato da enzima sacarase, que catalisa a hidrólise
da sacarose para glicose e frutose.
Como catalisadores, as enzimas tipicamente aceleram as reações químicas. A molécula tridimensional da
enzima tem um sítio ativo, uma região que interage com uma substância química específica.
Como catalisadores, as enzimas tipicamente aceleram as reações químicas. A molécula tridimensional da
enzima tem um sítio ativo, uma região que interage com uma substância química específica.
A enzima orienta o substrato para uma
posição que aumente a probabilidade de
uma reação. O COMPLEXO ENZIMA-
SUBSTRATO formado pela ligação
temporária da enzima com os reagentes
permite que as colisões sejam mais
eficientes e diminui a energia de ativação da
reação. A enzima, dessa forma, acelera a
reação ao aumentar o número de moléculas
AB que atingem a energia de ativação
necessária para que haja uma reação.
A capacidade da enzima de acelerar uma reação sem a necessidade de elevar a temperatura é
crucial para os sistemas vivos, porque um aumento significativo da temperatura poderia destruir as
proteínas celulares. A função crucial das enzimas, portanto, é acelerar as reações bioquímicas a uma
temperatura que seja compatível com o funcionamento normal da célula.
ESPECIFICIDADE E EFICIÊNCIA ENZIMÁTICA
A especificidade das enzimas é possibilitada por suas estruturas. As enzimas geralmente são
grandes proteínas globulares que variam em peso molecular de cerca de 10 mil a vários milhões.
Cada uma das milhares de enzimas conhecidas tem uma forma tridimensional característica com uma
configuração de superfície específica resultante de suas estruturas primária, secundária e terciária.
A configuração única de cada enzima permite que elas “encontrem” o substrato correto dentre o
grande número de diversas moléculas nas células.
https://drive.google.com/file/d/1sNETLyO6kMEFi73IDa6vdh50OoMiLE5M/view?usp=sharing
As enzimas são extremamente eficientes. Sob condições ótimas, elas podem catalisar
reações com velocidades de 108 a 1010 vezes (até 10 bilhões de vezes) maiores que aquelas de
reações sem enzimas. O número de turnover (número máximo de moléculas de substrato que
uma molécula de enzima converte em produto em cada segundo) geralmente é de 1 a 10.000,
podendo ser tão alto quanto 50 mil.
Por exemplo, a enzima DNA-polimerase I, que participa da síntese de DNA, tem um número
de turnover de 15, enquanto a enzima lactato-desidrogenase, que remove átomos de hidrogênio
do ácido láctico, tem um números de turnover de 1.000. Muitas enzimas existem na célula nas
formas ativa e inativa. A velocidade com que as enzimas trocam de uma forma para outra é
determinada pelo ambiente celular.
NOMENCLATURA DAS ENZIMAS
Os nomes das enzimas em geral terminam em -ASE. Todas as enzimas podem ser agrupadas em
seis classes, de acordo com o tipo de reação química que elas catalisam. As enzimas dentro de cada
uma das principais classes são denominadas de acordo com os mais específicos tipos de reações que
elas auxiliam.
Por exemplo, a classe chamada de oxidorredutase está envolvida nas reações de oxidação-
redução. As enzimas na classe oxidorredutase que removem hidrogênio a partir de um substrato são
chamadas de desidrogenases; aquelas que adicionam oxigênio molecular (O2) são chamadas de
oxidases. As enzimas desidrogenase e oxidase têm nomes ainda mais específicos, tais como lactato-
desidrogenase e citocromo-oxidase, dependendo dos substratos específicos em que elas atuam.
COMPONENTES DAS ENZIMAS
Embora algumas enzimas consistem inteiramente de proteínas, a maioria apresenta uma porção
proteica chamada de APOENZIMA e um componente não protéico chamado de COFATOR. Íons de
ferro, zinco, magnésio ou cálcio são exemplos de cofatores. Se o cofator é uma molécula inorgânica, é
chamado de COENZIMA. As apoenzimas são inativas sozinhas; elas devem ser ativadas por
cofatores. Juntos, a apoenzima e o cofator formam a holoenzima, ou enzima completa ativa. Se o
cofator for removido, a apoenzima não funcionará.
As coenzimas podem auxiliar a enzima aceitando átomos removidos do substrato ou doando
átomos requeridos pelo substrato. Algumas coenzimas atuam como carreadores de elétrons, removendo-
os do substrato e os doando para outras moléculas em reações subsequentes. Muitas coenzimas são
derivadas de vitaminas.
Duas das mais importantes coenzimas no metabolismo celular são a nicotinamida adenina
dinucleotídeo (NAD+) e a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+). Ambos os compostos
contêm derivados da vitamina B niacina (ácido nicotínico), e ambos funcionam como carreadores de
elétrons. Enquanto a NAD+ está basicamente envolvida em reações catabólicas (produzem energia), a
NADP+ está envolvida em reações anabólicas (requerem energia).
As coenzimas flavinas, tais como a flavina mononucleotídeo (FMN) e a flavina adenina
dinucleotídeo (FAD), contêmum derivado da vitamina B riboflavina e são também carreadores de
elétrons.
Outra importante coenzima, a coenzima A (CoA), contém um derivado do ácido pantotênico, outra
vitamina A. Essa coenzima possui um importante papel na síntese e na degradação das gorduras em
uma série de reações de oxidação chamada de ciclo de Krebs.
Como mencionado anteriormente, alguns cofatores são íons metálicos, incluindo ferro,
cobre, magnésio, manganês, zinco, cálcio e cobalto. Tais cofatores podem auxiliar na catálise
de uma reação pela formação de uma ponte entre a enzima e o substrato.
Por exemplo, o magnésio (Mg2+) é requerido por muitas enzimas fosforilativas (enzimas
que transferem um grupo fosfato do ATP para outro substrato). O Mg2+ pode formar uma ligação
entre a enzima e a molécula de ATP. A maior parte dos elementos traços requeridos pelas
células vivas provavelmente seja utilizada dessa maneira para ativar as enzimas celulares.
O MECANISMO DA AÇÃO ENZIMÁTICA
As enzimas diminuem a energia de ativação das reações químicas. A sequência geral dos eventos
na ação enzimática é como segue:
1. A superfície do substrato entra em contato com uma região específica da superfície da molécula da
enzima, chamada de SÍTIO ATIVO.
2. Um composto intermediário temporário é formado, chamado de COMPLEXO ENZIMA-
SUBSTRATO.
3. A molécula de substrato é transformada pelo rearranjo dos átomos existentes, pela quebra da
molécula de substrato, ou pela combinação com outra molécula de substrato.
4. As moléculas de substrato transformadas – OS PRODUTOS DA REAÇÃO – são liberadas da
molécula da enzima porque elas não se encaixam mais no sítio ativo da enzima.
5. A enzima inalterada está agora livre para reagir com outras moléculas de substrato.
Com resultados desses eventos, uma enzima acelera uma reação química. Como
mencionado anteriormente, as enzimas têm especificidade para substratos específicos.
Por exemplo, uma determinada enzima pode ser capaz de hidrolisar uma ligação
peptídica entre dois aminoácidos específicos. Outras enzimas podem hidrolisar amido, mas
não celulose; apesar do amido e da celulose serem polissacarídeos, compostos de
subunidades de glicose, as orientações das subunidades nos dois polissacarídeos diferem.
As enzimas têm esta especificidade porque a configuração tridimensional do sítio ativo
encaixa com o substrato como uma fechadura encaixa com sua chave. Contudo, o sítio ativo e
o substrato são flexíveis, e eles modificam um pouco a sua forma quando se encontram para
se encaixarem mais firmemente.
O substrato é em geral bem menor que a enzima, e relativamente poucos aminoácidos
da enzima participam do sítio ativo.Um certo composto pode ser o substrato de muitas
enzimas diferentes que catalisam reações diferentes, assim o destino de um composto
depende da enzima que atua sobre ele.
Pelo menos quatro enzimas diferentes podem atuar na glicose-6-fosfato, uma molécula
importante no metabolismo celular, e cada reação produz um produto diferente.
FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA
As enzimas estão sujeitas a diversos controles celulares. Dois tipos principais são o
controle da síntese enzimática e o controle da atividade enzimática (quanto da enzima está
presente versus o quão ativa ela é).
Muitos fatores influenciam a atividade de uma enzima. Entre os mais importantes estão a
temperatura, o pH, a concentração do substrato e a presença ou a ausência de inibidores.
TEMPERATURA
A velocidade da maioria das reações químicas aumenta com o aumento da temperatura. As
moléculas movem-se mais lentamente em baixas temperaturas do que em altas temperaturas e
então podem não ter energia suficiente para causar uma reação química. Para as reações
enzimáticas, contudo, uma elevação acima de certa temperatura (a temperatura ótima) reduz
drasticamente a velocidade da reação.
A temperatura ótima para a maioria das bactérias que produzem doenças no corpo humano é
entre 35 e 40 ºC. A velocidade da reação declina acima da temperatura ótima devido à desnaturação
enzimática, a perda de sua estrutura tridimensional característica (configuração terciária). A
desnaturação de uma proteína envolve a quebra de ligações de hidrogênio e de outras ligações não
covalentes; um exemplo comum é a transformação pelo calor da clara de ovo não cozida (uma
proteína chamada de albumina) para um estado endurecido.
A desnaturação de uma enzima modifica o arranjo dos aminoácidos no sítio ativo, alterando sua
forma e causando a perda da atividade catalítica da enzima. Em alguns casos, a desnaturação é
parcial ou totalmente reversível. Contudo, se a desnaturação ocorrer até a enzima perder sua
solubilidade e coagular, a enzima não poderá recuperar suas propriedades originais. As enzimas
também podem ser desnaturadas por ácidos concentrados, bases, metais pesados (como chumbo,
arsênico ou mercúrio), álcool e radiação ultravioleta.
https://drive.google.com/file/d/1sNETLyO6kMEFi73IDa6vdh50OoMiLE5M/view?usp=sharing
pH
A maioria das enzimas tem um pH ótimo no qual sua atividade é caracteristicamente máxima.
Acima ou abaixo desse valor de pH, a atividade enzimática, e portanto a velocidade da reação,
diminui. Quando a concentração de H+ (pH) no meio é modificada, a estrutura tridimensional da
proteína é alterada.
Mudanças extremas no pH podem causar desnaturação. Ácidos e bases alteram a estrutura
tridimensional da proteína porque o H+ (e o OH-) compete com o hidrogênio e as ligações iônicas em
uma enzima, o que resulta na desnaturação enzimática.
CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
Há uma velocidade máxima em que certa quantidade de enzima pode catalisar uma reação
específica. É somente quando a concentração do(s) substrato(s) está extremamente alta que essa
velocidade máxima pode ser alcançada.
Sob condições de alta concentração de substrato, a enzima é dita estar em saturação, ou seja, seu
sítio ativo permanece sempre ocupado por moléculas de substrato ou produto. Nessa condição, um
aumento adicional na concentração do substrato não afetará a velocidade da reação porque todos os
sítios ativos já estão ocupados.
Sob condições celulares normais, as enzimas não estão saturadas com substrato(s). Em um
determinado momento, muitas das moléculas de enzima estão inativas por falta de substrato e, portanto,
a velocidade da reação poderá ser influenciada pela adição de substrato.
INIBIDORES
Uma forma efetiva de controlar o crescimento de uma bactéria é controlar suas enzimas.
Certos venenos, como o cianeto, o arsênico e o mercúrio, podem se combinar com enzimas e
impedem seu funcionamento. Como resultado, as células param de funcionar e morrem.
Os inibidores enzimáticos são classificados como INIBIDORES COMPETITIVOS ou NÃO
COMPETITIVOS.
Os inibidores competitivos ocupam o sítio ativo de uma enzima e competem com o substrato
normal pelo sítio ativo. Um inibidor competitivo pode fazer isso porque sua forma e estrutura química
são similares àquelas do substrato normal. Contudo, ao contrário do substrato, ele não sofre reação
para formar produtos.
Alguns inibidores competitivos ligam-se irreversivelmente aos aminoácidos do sítio ativo,
impedindo interações adicionais com o substrato.
Outros ligam-se de forma reversível, alternadamente ocupando e deixando o sítio ativo; isso
reduz a interação da enzima com o substrato.
Aumentar a concentração do substrato pode superar a inibição competitiva reversível. Como
os sítios ativos ficam disponíveis, mais moléculas de substrato que moléculas de inibidores
competitivos estão disponíveis para se ligarem aos sítios ativos das enzimas.
Um bom exemplo de inibidor competitivo é a sulfanilamida (uma droga sulfa), que inibe a
enzima cujo substrato normal é o ácido para-aminobenzoico (PABA):
O PABA é um nutriente essencial utilizado por muitas bactérias na síntese do ácido fólico, uma
vitamina que funciona como coenzima. Quando a sulfanilamida é administrada às bactérias, a
enzima que normalmente convertePABA em ácido fólico se combina com a sulfanilamida. O ácido
fólico não é sintetizado, e as bactérias não podem crescer. Como as células humanas não utilizam
PABA para produzir seu ácido fólico, a sulfanilamida mata as bactérias sem prejudicar as células
humanas.
Os inibidores não competitivos não competem com o substrato pelo sítio ativo da enzima; em
vez disso, eles interagem com outra parte da enzima. Nesse processo, chamado de INIBIÇÃO
ALOSTÉRICA (“outro espaço”), o inibidor se liga a outro sítio na enzima que não o sítio de ligação
ao substrato, chamado de SÍTIO ALOSTÉRICO. Essa ligação causa uma modificação da
conformação do sítio ativo, tornando-o não funcional. Como resultado, a atividade enzimática é
reduzida. Esse efeito pode ser reversível ou irreversível, dependendo se o sítio ativo pode ou não
retornar a sua forma original.
Em alguns casos, as interações alostéricas podem ativar uma enzima em vez de inibi-la.
Outro tipo de inibição não competitiva pode funcionar em enzimas que requerem íons metálicos
para sua atividade. Certas substâncias químicas podem ligar ou envolver os íons metálicos
ativadores e, portanto, impedir a reação enzimática.
O cianeto pode ligar o ferro nas enzimas contendo ferro, e o fluoreto pode ligar o cálcio ou o
magnésio. Substâncias como o cianeto e o fluoreto algumas vezes são chamadas de venenos
enzimáticos porque inativam as enzimas de maneira permanente.
INIBIÇÃO POR RETROALIMENTAÇÃO
Os inibidores alostéricos têm um papel em um tipo de
controle bioquímico chamado de INIBIÇÃO POR
RETROALIMENTAÇÃO, ou INIBIÇÃO DO PRODUTO
FINAL. Esse mecanismo de controle impede a célula de
gastar recursos químicos na produção de mais substância
do que o necessário.
Em algumas reações metabólicas, várias etapas são
requeridas para a síntese de um composto químico
específico, chamado de PRODUTO FINAL. Esse processo
é similar a uma linha de montagem, com cada passo
catalisado por uma enzima separada.
Em muitas vias anabólicas, o produto final pode inibir alostericamente a atividade de uma das
enzimas iniciais da via. Esse fenômeno é a inibição por retroalimentação.
A inibição por retroalimentação geralmente atua na primeira enzima de uma via metabólica
(semelhante a paralisar as operações em uma linha de montagem impedindo o trabalho do primeiro
operário da linha).
Como a enzima é inibida, o produto da primeira reação enzimática na via não é sintetizado. Já
que esse produto não sintetizado seria normalmente o substrato da segunda reação na via, essa
reação também para imediatamente.
Então, mesmo que somente a primeira reação seja inibida, a via inteira para de funcionar, e
nenhum produto final é formado. Inibindo a primeira enzima na via, a célula também deixa de
acumular intermediários metabólicos. Como a célula consome o produto final existente, o sítio
alostérico da primeira enzima irá permanecer desligado com mais frequência, e a via retomará a sua
atividade.
A bactéria E. coli pode ser usada para demonstrar a inibição por retroalimentação na síntese do
aminoácido isoleucina, que é requerido para o crescimento da célula.
Nessa via metabólica, o aminoácido treonina é convertido enzimaticamente em isoleucina em
cinco passos. Se a isoleucina é adicionada ao meio de crescimento para E. coli, ela inibe a primeira
enzima da via, e as bactérias param de sintetizar isoleucina. Essa condição é mantida até que o
fornecimento de isoleucina seja esgotado. Esse tipo de inibição por retroalimentação também está
envolvido na regulação da produção celular de outros aminoácidos, assim como de vitaminas,
purinas e pirimidinas.
RIBOZIMAS
Antes de 1982, acreditava-se que somente as moléculas de proteínas tinham atividade
enzimática. Pesquisadores trabalhando com microrganismos descobriram um tipo peculiar de RNA
chamado de RIBOZIMA. Como as enzimas protéicas, as ribozimas funcionam como catalisadores,
têm sítios ativos que se ligam ao substrato e não são consumidas na reação química. As ribozimas
atuam especificamente nas fitas de RNA, removendo seções e unindo as peças remanescentes.
Nesse caso, as ribozimas são mais restritas que as enzimas proteicas em termos de diversidade
de substratos com os quais elas interagem.
FUNDAMENTOS DE GRÁFICOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
Vamos imaginar que você está em uma loja de carros esportivos. O que você gostaria de saber
para escolher qual é a melhor dentre várias opções? Uma característica óbvia seria saber a velocidade
que o carro atinge quando acelerado. Mas você talvez queira obter informações mais requintadas,
como a rapidez de aceleração do carro de 0 a 60 mph. Em outras palavras, ao invés de apenas saber a
velocidade máxima do carro, você também queira a cinética, que é como o carro atinge certa
velocidade.
Os bioquímicos costumam pensar da mesma forma sobre as enzimas que eles estudam. Eles
querem saber o máximo possível sobre os efeitos de uma enzima sobre a taxa de reação, e não
apenas a rapidez de uma enzima em termos de velocidade.
Na realidade, você pode aprender muito a respeito do funcionamento de uma enzima e como ela
interage com outras moléculas tais como os inibidores simplesmente medindo a rapidez que ela
catalisa uma reação em diferentes condições. Geralmente a informação proveniente destes
experimentos é apresentada na forma de gráficos, e por isso iremos conhecer aqui como os gráficos
são feitos (e como devem ser lidos para se obter o máximo de informações).
PRINCIPAIS GRÁFICOS DA CINÉTICA ENZIMÁTICA
Gráficos como este mostrado a seguir (representando graficamente a taxa de reação em função
da concentração de substrato) são frequentemente usados para exibir informações sobre a cinética
enzimática. Eles fornece muitas informações úteis, mas podem ser bastante confusos quando vistos
pela primeira vez.
Imagine que você tem um tubo de ensaio com sua enzima favorita e quer saber mais
sobre ela, sob diversas condições. Então, você realiza uma série de ensaios nos quais você
pega diferentes concentrações de substratos - digamos, 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M e 1,0
M - e encontra a taxa de reação (ou seja, a velocidade em que seu substrato é transformado
em produto) quando você acrescenta a enzima, em cada caso. É claro que você deve tomar
cuidado e acrescentar sempre a mesma concentração de enzima em cada reação, de forma
que você compare maçãs com maçãs.
COMO SE DETERMINA A VELOCIDADE DA REAÇÃO?
Na verdade, queremos a velocidade inicial da reação, quando se acaba de combinar a
enzima e o substrato, e a enzima catalisa a reação o mais rápido possível para aquela
concentração específica de substrato (posteriormente a velocidade de reação diminuirá para zero
conforme o substrato vai sendo utilizado). Portanto, deve-se medir a quantidade de produto
produzido por unidade de tempo bem no começo da reação, quando a concentração do produto
está crescendo linearmente. Esse valor, a quantidade de produto produzido por unidade de
tempo no início da reação, é chamado de VELOCIDADE INICIAL, ou V0, para aquela reação.
Agora, digamos que você encontrou seus valores de V0 para todas as concentrações
de seu interesse. Você pode, então, representar graficamente cada concentração de
substrato e seu V0 como um par (X, Y). Depois que representar todos os seus pares (X, Y)
no gráfico para diferentes concentrações, pode ligar os pontos com a curva melhor ajustada
para obter um gráfico. Para muitos tipos de enzimas, o gráfico que você vai obter lembra a
reta roxa mostrada acima: os valores de V0 vão aumentar rapidamente com concentrações
baixas de substrato, e depois, vão nivelar em um platô com altas concentrações de
substratos.
Esse platô acontece porque a enzima está SATURADA, significando que todas as
moléculas enzimáticas disponíveis já estão ocupadas processando substratos. Quaisquer
moléculas adicionais de substrato terão que esperar até que outra enzima se torne
disponível, por isso a velocidade da reação (quantidade de produtoproduzido por unidade
de tempo) é limitada pela concentração de enzimas. A maior velocidade de reação de uma
determinada enzima a uma determinada concentração é conhecida como VELOCIDADE
MÁXIMA, ou Vmax. A Vmax é o valor de Y (valor da velocidade inicial de reação) no qual o
gráfico acima atinge o platô.
A concentração de substrato na qual ocorre a reação em um valor mediano da Vmax é
chamada de Km, e serve para medir quão rapidamente a velocidade da reação aumenta com a
concentração do substrato. A Km é também uma medida da afinidade (tendência de se ligar) de
uma enzima com seu substrato. Uma Km menor corresponde a uma maior afinidade pelo
substrato, enquanto uma Km maior corresponde a uma menor afinidade pelo substrato. Diferente
da Vmax, que depende da concentração enzimática, a Km é sempre a mesma para uma
determinada enzima, caracterizando uma determinada reação (embora a Km "aparente", ou
experimentalmente medida, possa ser alterada por inibidores, como apresentado abaixo).
GRÁFICOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA E INIBIDORES
● Os inibidores competitivos retardam o progresso da reação ao se ligar à enzima, geralmente no sítio
ativo, impedindo que o verdadeiro substrato se ligue. De cada vez, somente o inibidor competitivo ou o
substrato pode estar ligado à enzima (e não ambos ao mesmo tempo). Portanto, o inibidor e o substrato
competem pela enzima. A inibição competitiva age diminuindo o número de moléculas enzimáticas
disponíveis para se ligar ao substrato.
● Os Inibidores não competitivos não impedem que o substrato se ligue à enzima. Na verdade, o inibidor
e o substrato não afetam de maneira nenhuma a capacidade um do outro de se ligar à enzima. Contudo,
quando o inibidor está ligado, a enzima não consegue catalisar sua reação para produzir um produto.
Assim, a inibição não competitiva age reduzindo o número de moléculas enzimáticas funcionais que
podem realizar a reação.
Se quiséssemos mostrar os efeitos desses inibidores em um gráfico como o de cima,
poderíamos repetir todo o experimento mais duas vezes: uma vez com uma certa quantidade de
inibidor competitivo adicionada à cada reação teste, e outra vez com uma certa quantidade de
inibidor não competitivo adicionada. Nós obteríamos os seguintes resultados:
INIBIDOR COMPETITIVO
Com um inibidor competitivo, a reação irá atingir sua Vmax normal, mas precisará de uma
maior concentração de substrato. Em outras palavras, a Vmax permanece inalterada, mas a
Km aparente é maior. Por que se deve adicionar mais substrato para que se chegue à Vmax? O
substrato extra torna as moléculas de substrato suficientemente abundantes para "vencerem"
bravamente as moléculas inibidoras da enzima.
INIBIDOR NÃO COMPETITIVO
Com um inibidor não competitivo, a reação nunca atinge sua Vmax normal,
independentemente de quanto substrato adicionarmos. Uma parcela das moléculas enzimáticas
sempre estarão "envenenadas" pelo inibidor, então a concentração efetiva de enzimas (que
determina a Vmax) é reduzida. Contudo, a reação atinge a metade de sua nova Vmax na mesma
concentração de substrato, portanto a Km permanece inalterada. A Km inalterada mostra que o
inibidor não afeta a capacidade da enzima de ligar-se ao substrato, apenas diminui a
concentração de enzimas utilizáveis.
EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN E ENZIMAS ALOSTÉRICAS
Muitas enzimas agem de modo similar à enzima hipotética do exemplo acima, produzindo
curvas parabólicas quando a velocidade de reação é grafada como uma função da concentração
do substrato. Enzimas que demonstram esse comportamento podem comumente ser descritas
por uma equação que relaciona concentração de substrato, velocidade inicial, KM, e VMAX,
conhecida como EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN. Enzimas cuja cinética obedece essa
equação são chamadas de enzimas Michaelis-Menten.
https://drive.google.com/file/d/1khMEb_SMCx1PqxkWL-G2b3IhdCp8s9Uo/view?usp=sharing
Enzimas cooperativas são mais sensíveis em sua
resposta a mudanças nas concentrações do substrato
que outras enzimas e apresentam uma transição "do tipo
interruptor" da taxa de reação baixa para alta à medida
que a concentração do substrato aumenta. Isso
corresponde a uma curva velocidade vs. substrato que
tem o formato de S, como representado acima.
As enzimas de Michaelis-Menten são diferentes das enzimas alostéricas. ENZIMAS
ALOSTÉRICAS têm, tipicamente, múltiplos sítios ativos e geralmente apresentam COOPERATIVIDADE,
o que significa que a ligação de um substrato a um sítio ativo aumenta a habilidade de outros sítios ativos
ligarem-se e processarem substratos.
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
Os principais problemas da utilização de enzimas solúveis são: alto custo de produção e
purificação, instabilidade da estrutura tridimensional quando isoladas do seu ambiente natural e
perda de atividade devido às condições do processo ou inibição pelo substrato ou produto. Isto
resulta em um tempo de meia-vida operacional curto e, consequentemente, um custo elevado.
Além disso, muitas enzimas atuam na forma solúvel em meio aquoso (catálise homogênea), na
qual contaminam o produto desejado e não podem ser recuperadas do meio reacional na forma
ativa.
IMOBILIZAÇÃO é um termo genérico empregado para descrever a retenção de uma
biomolécula no interior de um reator ou de um sistema analítico. No caso das enzimas, a
imobilização consiste no confinamento da proteína em um suporte sólido insolúvel em
meio aquoso e em solventes orgânicos, e pode ser usada isolada ou em combinação com
outras técnicas de estabilização de proteínas, considerada uma das ferramentas mais
eficientes para alterar a especificidade, seletividade, atividade e estabilidade das enzimas
Em comparação com as enzimas solúveis, as enzimas imobilizadas são mais robustas e
mais resistentes a mudanças do ambiente reacional, incluindo influências de temperatura, pH e
solventes orgânicos. Outras importantes vantagens das enzimas imobilizadas em comparação
com as enzimas solúveis são: possibilidade de reutilização do biocatalisador; facilidade de
separação do catalisador e do produto da reação e de interrupção da reação, quando se atinge
um determinado grau de conversão; além da possibilidade de conduzir processos contínuos.
Entretanto, dependendo da relação entre o custo do suporte e a estabilidade do derivado
imobilizado, a imobilização, ao invés de reduzir o custo de um determinado processo, pode torná-
lo ainda mais oneroso.
KENNEDY & WHITE propuseram uma classificação que combina a natureza da interação responsável pela
imobilização com a natureza do suporte utilizado
Não existe um método ou suporte de imobilização único aplicável a todas as enzimas e suas várias
aplicações. Isso se deve às diferentes características físico-químicas de cada enzima, às diferentes
propriedades dos substratos e produtos e às diversificadas aplicações dos produtos obtidos. Além disso,
todos os métodos apresentam vantagens e limitações. Consequentemente, as condições ótimas de
imobilização para uma determinada enzima são determinadas empiricamente pelo processo de erro e
acerto, a fim de se obter maior retenção da atividade enzimática, estabilidade operacional e durabilidade.
Nessa classificação, o termo enzimas solúveis designa os métodos em que a enzima permanece na
mesma fase em que estão os substratos (reagentes) e os produtos da reação, enquanto o termo enzimas
insolúveis designa aquelas que, após imobilização em material sólido, passam a constituir fase diferente do
meio de reação, geralmente líquido.
MÉTODOS PARA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS SOLÚVEIS
Nestes métodos, as enzimas mantêm sua solubilidade inalterada e são separadas do restante
da solução por membranas semipermeáveis, fibras porosas ou membranas de ultrafiltração. De
modo geral, neste processo ocorre a contenção da enzima livre em uma câmara ou compartimento,
através do qual o substrato (reagente) passa e é convertido em produto. Deste modo, é possível
utilizar continuamente a enzima, na sua formanativa, por períodos prolongados de tempo. As
membranas utilizadas neste tipo de imobilização variam muito em sua composição química e
tamanho de poro, podendo ser de natureza química bem simples como as de policarbonato ou mais
complexas como as de compósitos de óxido de alumínio/polietilenoimina/polianilina.
IMOBILIZAÇÃO SEM MODIFICAÇÃO QUÍMICA DA ENZIMA
Neste método a enzima nativa é aprisionada em uma câmara por uma membrana ou fibra, que
são impermeáveis à molécula de enzima, mas são amplamente permeáveis às moléculas de
substrato ou produto. Trata-se de uma técnica extremamente simples, em que a enzima não sofre
qualquer alteração em seu micro-ambiente. No entanto, há algumas restrições a sua ampla
aplicação, uma vez que os produtos da reação devem ser moléculas pequenas, capazes de passar
através dos poros do sistema.
IMOBILIZAÇÃO COM MODIFICAÇÃO QUÍMICA DA ENZIMA
Este método consiste primariamente em modificar quimicamente a molécula de enzima, através
da ligação de compostos de massa molar variada sem, no entanto, alterar a solubilidade da enzima
nativa ou sua atividade catalítica. Deste modo, a enzima modificada adquire massa molar e diâmetro
maior, permitindo a sua retenção com o uso de membranas com porosidade elevada, as quais
facilitam o processo de difusão entre os ambientes, seja do substrato, seja do produto.
MÉTODOS PARA PREPARAÇÃO DE ENZIMAS INSOLÚVEIS
Nos métodos de enzima insolúvel, a enzima sofrerá modificação em sua solubilidade, passando a operar
em fase diferente daquela do solvente, onde estarão presentes os substratos e para onde, via de regra,
deverão retornar os produtos da reação. Nestes métodos, a molécula de enzima sofre tanto modificação
química como no seu microambiente.
APRISIONAMENTO
O método de aprisionamento consiste em aprisionar ou enclausurar a molécula de enzima dentro de
uma matriz polimérica, de forma que seja possível a entrada do substrato e saída do produto, mas não da
enzima.
O método se subdivide, de acordo com o material utilizado, em APRISIONAMENTO EM GEL,
onde são usados materiais tais como o ágar, poliacrilamida, gelatina e alginato, e APRISIONAMENTO
EM FIBRA em que o acetato de celulose é um exemplo típico. Uma terceira subdivisão diz respeito ao
APRISIONAMENTO EM NANO/MICROCÁPSULAS, onde as enzimas são retidas dentro de
membranas poliméricas, preparadas à partir de material semi-permeável que permitem a difusão do
substrato e do produto
LIGAÇÃO AO SUPORTE
O método consiste na ligação da enzima a suportes insolúveis, gerando assim uma segunda fase
diferente do meio reacional, onde a enzima se encontra fixada, e pode ser subclassificado de acordo
com o tipo de ligação da enzima com o suporte.
LIGAÇÃO AO SUPORTE POR ADSORÇÃO
Neste método de imobilização, grupos superficiais do suporte interagem com grupos de
superfície da enzima, através de atrações eletrostáticas ou dipolares (forças de van der Waals) ou
ainda pontes de hidrogênio. O tipo predominante de interação depende da natureza química e
propriedades superficiais do suporte e da enzima em questão. A técnica, relativamente simples,
consiste basicamente na mistura do suporte insolúvel à solução de enzima, sob condições
apropriadas, seguida da separação do suporte contendo a enzima adsorvida do meio de reação.
Considerando as forças envolvidas no processo de adsorção,
podemos inferir que a eficiência deste método depende de variáveis
tais como pH, força iônica do meio e a natureza do solvente
empregado, bem como da relação entre a concentração da enzima e
do suporte. Assim sendo, após imobilização é necessário um
cuidado especial para que as condições ótimas de imobilização
sejam mantidas, para que o sistema se mantenha inalterado, o que,
de certa forma, limita a aplicação destes sistemas. Apesar disto, a
simplicidade e rapidez desta técnica preserva seu uso nos dias
atuais com vastos exemplos de enzimas imobilizadas por adsorção.
LIGAÇÃO IÔNICA
No método de imobilização por força iônica, o suporte possui grupos funcionais ionizáveis
característicos, os quais irão interagir especificamente com grupos da enzima. No processo, é possível
que algum tipo de adsorção ocorra simultaneamente. Entretanto, a força da interação iônica é maior
do que a de adsorção e, portanto, prevalece.
Para se obter o máximo de eficiência neste método, é necessário cuidado na escolha da solução
iônica com propriedades tamponantes que será o meio para a enzima a ser ligada, de forma que seja
compatível com o suporte e favoreça a substituição dos íons deste pelos grupos ionizados da enzima.
De modo semelhante ao que ocorre com as preparações de enzimas imobilizadas por adsorção, as
condições ótimas de imobilização devem ser continuamente monitoradas a fim de se preservar a integridade do
sistema, em especial o pH e força iônica do meio onde a preparação será utilizada, o que também serve como
limitante para a aplicação destes sistemas.
Este método tem sido frequentemente utilizado na construção de biossensores em que a polianilina atua
como polímero condutor depositado sobre o eletrodo (carbono vítreo, platina, ouro). A síntese de polianilina feita
eletroquimicamente resulta em polímero carregado positivamente. Assim, a enzima poderá interagir
ionicamente com o polímero em valores de pH abaixo do valor do pI29.
LIGAÇÃO COVALENTE AO SUPORTE
A imobilização de enzimas através da formação de ligações covalentes entre um grupo ligante da
enzima e o suporte insolúvel é um dos métodos mais largamente utilizados e investigados. Este
método emprega os mais variados tipos de ligação, sendo possível imobilizar uma enzima através de
qualquer um de seus grupos superficiais reativos. Assim sendo, há uma gama imensa de reações que
podem ser utilizadas para imobilização via ligação covalente.
Cuidado especial deve ser tomado para que grupos importantes para o desempenho da atividade
catalítica não sejam envolvidos na formação da ligação covalente entre enzima e suporte, o que teria
como conseqüência uma enzima retida desprovida de atividade.
Inconvenientes desta técnica incluem as condições mais drásticas e maior número de etapas de reação e,
conseqüentemente, mais tempo para sua realização. No entanto, uma vez imobilizada adequadamente, essas
preparações apresentam grande estabilidade, de forma que somente alterações muito drásticas no meio serão
capazes de interferir neste tipo de ligação.
Um dos métodos mais largamente utilizados para imobilização por ligação covalente é o uso de vidro ou
materiais derivados de sílica. Nestes materiais é comum o tratamento para ampliação da quantidade de grupos
reativos através de silanização, seguida de introdução do braço espaçador de glutaraldeído que atuará como
ponto de ligação para e enzima.
LIGAÇÃO CRUZADA OU CROSS-LINKING
A insolubilização de enzimas por este método envolve a formação de ligação covalente entre moléculas
de enzima e reagentes bifuncionais de baixa massa molar, formando agregados unidos por ligações
intermoleculares. Vários meios distintos são disponíveis para o preparo de derivados insolúveis de enzimas
por ligação cruzada, usando reagentes bifuncionais de baixa massa molar. O sucesso da reação depende das
condições experimentais e varia de acordo com a enzima e o reagente escolhido. Dentre os diversos
reagentes bifuncionais existentes, destacamos o glutaraldeído como o reagente de primeira escolha, que
continua a ser freqüentemente utilizado nos dias atuais em função de sua rápida reação com os grupos amino
superficiais na molécula de enzima. Outro reagente muito utilizado é a carbodiimida em função de sua fácil
reação com grupos carboxilas. O caráter reversível ou não das reações de imobilização por ligação cruzada e,
portanto, a estabilidade da ligação obtida, depende do tipo de reagente bifuncional.
Um aspecto importante a ser ressaltado é o fato de que o método de ligação cruzada, tal qual descrito
aqui, não envolve a associação da enzima com umsuporte sólido. O produto da ligação de várias moléculas
de enzimas através de reagentes bifuncionais é que se torna insolúvel e precipita, formando um agregado
sólido cataliticamente ativo.
TIPOS DE SUPORTES
Os requisitos básicos para um material ser considerado um suporte adequado são: elevada área
superficial, permeabilidade, estabilidade química e mecânica sob as condições operacionais, capacidade de
regeneração, custo, morfologia e composição, natureza hidrofílica ou hidrofóbica, resistência ao ataque
microbiano, alta densidade de grupos reativos presentes em sua superfície, dentre outras.
De acordo com sua origem, os suportes podem ser classificados como materiais orgânicos e
inorgânicos. Quanto à sua morfologia, podem ser porosos, não porosos e de estrutura em gel.
Os materiais porosos apresentam como principal vantagem uma elevada área superficial interna
disponível para a imobilização de enzimas. Contudo,é importante atentar para o diâmetro dos poros do
suporte, pois estes devem ser suficientemente grandes para acomodar a enzima e permitir o acesso do
substrato.
Como inconveniente do uso dos suportes porosos têm-se possíveis problemas relacionados a limitações
difusionais, uma vez que o substrato, além de se difundir da solução para a superfície externa, deverá difundir-
se também para o interior dos poros do suporte, onde grande parte das moléculas do catalisador está situada.
Todavia, a localização das moléculas de enzimas no interior dos poros também confere uma proteção frente a
eventuais condições adversas do meio reacional.
Os suportes não porosos apresentam como principal vantagem a acomodação das moléculas de enzima
apenas na sua superfície externa, o que facilita a interação do catalisador com moléculas de substrato. No
entanto, a pequena área superficial exibida por esses suportes é sua mais notória desvantagem. Na tentativa
de contornar esse problema, muitos pesquisadores têm optado pela utilização de partículas ou fibras finas;
porém, outras dificuldades surgem quando se utilizam esses tipos de materiais como, por exemplo, alta queda
de pressão e baixas vazões para operação em reatores contínuos.
Os materiais orgânicos, em especial os polímeros, que podem ser naturais ou sintéticos, são uma
classe de suportes muito importantes no campo da imobilização de biocatalisadores. Os polímeros
sintéticos exibem variedades de formas físicas e estruturas químicas que podem ser combinadas para
formar um suporte de acordo com as características desejadas, porém os polímeros naturais
apresentam algumas vantagens quando comparados aos sintéticos, pois geralmente têm baixo custo e
são facilmente degradáveis, não causando danos ao meio ambiente.
Dentre os diferentes suportes empregados na imobilização de enzimas destacam-se os
orgânicos naturais agarose e quitosana, resinas acrílicas comerciais (polímeros sintéticos)
toyopearl e Sepabeads e os nanomateriais considerando o grande número de trabalhos publicados.
https://drive.google.com/file/d/1CqJQNI3eO8uPuwdfndsOdg1NWGUpWrEn/view?usp=sharing
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS
As enzimas são capazes de catalisar reações de hidrólise, transesterificação,
isomerização, oxirredução esterificação, transferência de grupos inter e intramoleculares,
adição de grupos em ligações duplas, dentre outras. Ou seja, são capazes de catalisar
qualquer tipo de reação orgânica atuando de maneira específica e em condições reacionais
brandas. Desde 1960, quando a tecnologia enzimática surgiu como área de investigação, as
enzimas imobilizadas têm sido testadas para a produção de produtos de interesse em ramos
industriais diversificados.
https://drive.google.com/file/d/1Y_RR2MwjDok1qWdcd2FNLIhhPhg8HcsK/view?usp=sharing
As aulas são baseadas a partir da extração do material atualizado dos principais livros de microbiologia e
conteúdos online, passando por uma triagem crítica e responsável de modo a trazer as informações mais atualizadas e
condizentes com a conteúdo.
 Manual de métodos de análise Microbiológica de Alimentos e água / Neusely da Silva (et al.) / 4. Ed. / São Paulo /
Livraria Varela / 2010.
 Microbiologia dos alimentos / Irineide Teixeira Carvalho / Recife / EDUFRPE / 2010.
 Biotecnologia: Ensino e Divulgação / Maria Antonia Malajovich / 2ª Edição / Rio de Janeiro / 2016.
 Microbiologia / Gerard J. Tortora (et al.) / 12. ed. / Porto Alegre / Artmed / 2017.
 Microbiologia industrial : bioprocessos : volume 1 / Bernardo Dias Ribeiro (et al.). - 1. ed. - Rio de Janeiro : Elsevier,
2018.
 Khan Academy / acessado em 01.03.2021 / www.khanacademy.org.
 Microrganismos: Relações ecológicas / Microbiologia Geral / Departamento de Fitopatologia e Nematologia / Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” / acessado em 01.03.2021.
http://www.khanacademy.org/
MUITO OBRIGADO
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