Relatório de Processamento Histológico

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ - UECE 
FACULDADE DE VETERINÁRIA - FAVET 
CURSO DE GRADUAÇÃ​​​​O EM MEDICINA VETERINÁRIA 
DISCIPLINA: HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA 
DOCENTE: JANAÍNA SERRA AZUL 
 
 
 
 
ANA PAULA ROCHA JOVENTINO - 1572292 
GABRIELA LIMA ARAUJO - 1567386 
INGRID DA SILVA SOUSA - 1567263 
SUEANE FILIPE AGUIAR - 1572351 
 
 
 
 
 
 
PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO 
 
 
 
 
 
FORTALEZA – CEARÁ 
2020 
 
 
1. Introdução 
A histologia é a ciência que estuda os aspectos microscópicos de células e tecidos, 
suas funções e inter relação, bem como se relacionam com componentes extracelulares. Os 
tecidos podem ser submetidos a procedimentos técnicos com o objetivo de preservar suas 
características morfológicas. Isso se dá por meio de processamento histológico, no qual as 
células teciduais são coradas para que possam ser observadas em microscópios, 
possibilitando análises dos tecidos. Logo, é evidente a importância desse processo à ciência 
de modo geral. Ademais, cada etapa do processamento deve ser realizada com atenção e 
organização. (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010) 
 
2. Etapas do Processamento Histológico 
 
 ​2.1 Eutanásia 
A eutanásia deve ser feita de modo que não cause sofrimento ao animal e que não 
danifique os órgãos a ser coletados posteriormente, seja por estresse ou por substâncias 
injetadas. Sendo assim, uma das maneiras rápidas e fáceis adotadas pelo histologista é a 
guilhotina. Para tanto, é necessário também o manejo correto do animal antes da eutanásia 
para não causar o estresse. 
 
 2.2 Coleta 
Após a eutanásia do animal, faz-se rapidamente a coleta de amostra dos tecidos para 
análise para por em um fixador, pois após a morte as células entram em deterioração 
(autólise) devido à falta de oxigênio e substâncias essenciais, o que resulta em alterações 
nas estruturas dos tecidos. Para a coleta, o histologista faz uma cirurgia com o auxílio de um 
bisturi, pinça ou lâmina para retirar parte dos órgãos. 
 
 2.3 Clivagem 
A clivagem é o processo de redução do tamanho e espessura das amostras. Não é 
indicada a extração de porções volumosas de tecido para observação (já que o intuito é obter 
uma camada fina para ser analisada em microscópio óptico). Logo, peças maiores tem a 
necessidade de serem cortadas em fragmentações menores, de preferência o tamanho de 2 
a 6 mm, para facilitar a penetração do fixador. 
 
 ​2.4 Fixação 
Esta etapa consiste na utilização de procedimentos físicos ou químicos para imobilizar 
as substâncias constituintes das células e dos tecidos, fornecendo maior resistência para 
suportar as etapas posteriores. Muito frequentemente, há a associação dos dois tipos de 
procedimentos, pois uma fixação química pode sofrer influência de fatores físicos, como a 
temperatura do ambiente, por exemplo. Além disso, os fixadores retardam os efeitos post 
mortem (pós morte) do tecido, como enzimas que causam a degradação, mantendo sua 
arquitetura normal. 
Cada fixador, além de seu propósito inicial, pode apresentar algumas vantagens, tais 
quais: rápido poder de penetração, baixo potencial de modificação dos tecidos, preservação 
das estruturas bioquímicas e que possibilite qualquer método de coloração. Por outro lado, 
há também desvantagens, como a perda molecular, inchaço ou retração dos tecidos, 
variação na qualidade de colorações, entre outros fatores. (SUVARNA; LAYTON; 
BANCROFT, 2013) Como nenhum é 100% vantajoso ou completamente inofensivo aos 
tecidos, é essencial conhecer diversos tipos de fixadores para escolher o mais adequado ao 
propósito desejado. (MICHALANY, 1990). 
O tempo de fixação dependerá do tamanho do fragmento do tecido, podendo variar 
entre 06 e 24h. É recomendado que, sempre que possível, não ultrapasse a 3mm de 
espessura e se utilize, no mínimo, um volume 20 vezes maior de fixador, em relação ao 
 
tecido a ser fixado, para que o material reaja satisfatoriamente. Uma vez fixado, a peça deve 
ser transferida para álcool 70%, onde poderá permanecer indefinidamente. 
Os reagentes mais comuns em fixadores não coagulantes (precipitam as proteínas) 
são: cloreto de mercúrio e ácido pícrico. Após a fixação é fundamental a remoção do ácido 
pícrico dos tecidos para a posterior etapa de coloração. Além disso, resíduos deste ácido 
podem favorecer a deterioração da peça com o passar do tempo. Para a eliminação do 
excesso de fixador dos tecidos é recomendado: 
1. Lavagem em água corrente por 18h; 
2. Transferência da peça para álcool 50%, durante 30min; 
3. Armazenamento da peça em álcool 70%. 
Importante​: O conteúdo dos frascos de ácido pícrico deve ser mantido úmido, pois ele é 
explosivo quando seco. (JUNQUEIRA E JUNQUEIRA,1983). 
Atualmente, dos fixadores químicos coagulantes (não há precipitação de proteínas) 
usados em processos histológicos, o mais acessível é o formaldeído, conhecido como fixador 
universal. 
2.4.1 Como realizar uma boa fixação 
Um dos fatores que mais interferem na qualidade da fixação é a escolha do fixador. 
Nesse sentido, dentre os aspectos considerados, estão: os tecidos que serão analisados, as 
características químicas do fixador, a velocidade de penetração no tecido e a temperatura de 
fixação. Mas, de maneira mais geral toda fixação depende: 
● Mínimo intervalo de tempo possível entre coleta e fixação da amostra; 
● Utilizar peças dentro limite de espessura (2-6mm); 
● Utilizar a proporção correta de volume do líquido fixador (10-20x volume da 
peça); 
● Agitar suavemente e de tempos em tempos a peça no fixador; 
● Evitar marcar a peça com o uso de pinças. 
 
 ​2.5. Desidratação 
 Consiste no processo de remoção da água retida nos componentes tissulares da 
amostra. A parafina, na qual o corte será acoplado, é matéria orgânica derivada do petróleo, 
posto assim, é insolúvel a água. 
 Após a fixação, a composição celular ainda é cerca de 70% de líquido aquoso, 
suscitando a necessidade do uso de reagentes desidratantes - solúveis em água - para 
remover a água, possibilitando, posteriormente, eficaz reação da parafina na estrutura dos 
tecidos. 
 Os álcoois etílico, metílico e isopropílico, a acetona e o éter são exemplos de 
substâncias empregadas na etapa de desidratar, em especial, o álcool etílico, por sua 
acessibilidade e baixo custo. A ação dos agentes alcoólicos sobre o corte diferencia-se pelo 
tempo de desidratação, como, por exemplo, a acetona apresentando reação mais rápida que 
o álcool. 
 
A fim de evitar deformações celulares por uma desidratação agressiva, o processo dá-se por 
uma série de submersões da amostra em concentrações crescentes de álcool: 
 ETAPA REAGENTE DURAÇÃO 
 Desidratação Álcool 70% 1 hr 
 Desidratação Álcool 80% 1 hr 
 Desidratação Álcool 90% 1 hr 
 Desidratação Álcool l 100% 1 hr 
 Desidratação Álcool ll 100% 1 hr 
 
OBS​: quantidade de reagentes e duração das etapas variantes por tipo e tamanho de 
amostra. 
 
Recomendações para eficiente desidratação: 
● Utilize frascos de fundo largo; evita maior acúmulo de água no fundo do recipiente e 
menos contato com a amostra desidratada; 
● Volume do álcool vinte vezes o volume da amostra; 
● Agitação constante do frasco para melhor mesclagem do reagente desidratante com a 
água depositada no fundo; 
● Trocasregulares do álcool etílico e descarte da água extraída; 
● Inibir a reação de hidratação do álcool, impedindo que a substância volátil se aqueça. 
 
 
 2.6. Clarificação ou diafanização 
 Com a insolubilidade entre a parafina e o etanol, é necessária uma etapa de extração 
do álcool acumulado no interior da amostra. Tal limpeza visa facilitar a penetração e 
endurecimento da parafina entre os componentes teciduais, além de favorecer a manutenção 
estrutural das células, pois já que sua solução aquosa foi removida, ela precisa ser 
substituída por um fluido com afinidade a parafina. O Xilol é o agente diafanizador (ou 
clarificador) mais utilizado. 
 
OBS​: quantidade de reagentes e duração das etapas variantes por tipo e tamanho de 
amostra. 
 
 Consequente a reação do clarificador com o desidratante, a retirada das gorduras dos 
tecidos estimula que os mesmos adquiram colorações claras e translúcidas, motivo pelo qual 
a etapa também é conhecida como clarificação. Esta transparência é de extrema importância 
para a passagem da luz do microscópio pelo corte. 
 Tratando-se de um composto químico volátil, o manuseio do Xilol necessita cuidado e 
atenção às normas de Biossegurança. As reações do organismo vão desde ardência nos 
olhos, tosse, falta de ar e náuseas a possíveis problemas respiratórios e gástricos por 
exposição contínua e prolongada ao agente químico. Por isso, o correto é a manipulação do 
Xilol em capelas de exaustão com o uso de Equipamentos de Segurança (EPIs). Além dos 
cuidados na manipulação, o descarte correto dos resíduos pode ser feito por meios de 
empresas de coleta química, mas o Xilol nunca deve ser jogado em pias para o esgoto 
comum, com risco de contaminação dos lençóis freáticos e impactos na vida marinha. 
 
 ETAPA REAGENTES DURAÇÃO 
 Clarificação Xilol l 40 min 
 Clarificação Xilol ll 40 min 
 
 
Figura 1: Capela de exaustão de gases, para manuseio do xilol e demais substâncias tóxicas, de 
forma, a proteger o manipulador de reações químicas. 
 Fonte: Max Labor. 
 
 
Para diafanização adequada: 
● Agitar o frasco para melhor retirada do álcool e preenchimento do xilol na amostra; 
● Troca do clarificador, ao menos duas vezes; 
● O banho no xilol não deve ser demorado, podendo acarretar no ressecamento e 
deterioração dos tecidos. 
 
 
 
 Figura 2: Recipientes de álcool e xilol, destinados a desidratação e clarificação de lâminas 
histológicas. 
Fonte: Arquivo pessoal 
 
 
 
 
 
 
 
2.7. Inclusão em parafina 
Segundo Junqueira, para obter secções delgadas com o micrótomo os fragmentos de 
tecidos e órgãos devem, após a fixação, ser infiltrados com substâncias que lhes 
proporcionem uma consistência rígida. As substâncias mais utilizadas para esse fim são a 
parafina e algumas resinas de plástico. A parafina é habitualmente utilizada para microscopia 
de luz, e as resinas, para microscopia de luz e eletrônica. 
Após a desidratação, o etanol dos fragmentos deve ser substituído por uma substância 
intermediária (geralmente um solvente orgânico) que é miscível tanto em etanol como no 
meio que foi escolhido para inclusão (parafina ou resina). Para a inclusão em parafina, as 
substâncias intermediárias mais comumente usadas são o xilol e o toluol. Quando os 
fragmentos de tecidos são embebidos no solvente orgânico, eles ficam transparentes ou 
translúcidos. 
Em seguida, são colocados na estufa em parafina derretida (56 a 60ºC). O calor causa 
a evaporação do solvente orgânico, e os espaços existentes dentro dos tecidos tornam-se 
preenchidos com parafina. Depois de os fragmentos serem retirados da estufa, a parafina 
solidifica e eles se tornam rígidos. 
 
 
 
 
 
Figura 3: Estufa Figura 4: Cassete histológico para a inclusão da parafina. 
Fonte: Arquivo Pessoal. Fonte: Essencial Lab. 
 
 
 2.8. Corte no micrótomo 
Ainda segundo Junqueira, na maioria dos casos os tecidos e órgãos são espessos e 
não possibilitam a passagem adequada da luz para a formação de uma imagem, por essa 
razão antes de serem examinados ao microscópio eles devem ser fatiados em cortes 
histológicos muito delgados. Os blocos de parafina que contêm os tecidos são seccionados 
pelo micrótomo por uma lâmina de aço ou de vidro, de modo a fornecer cortes de 1 a 10 
micrômetros de espessura. 
 
 
 
Figura 5: Micrótomo. 
Fonte: Arquivo pessoal. 
 
 
 2.9. Banho maria 
Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar sobre uma superfície de 
água aquecida e, depois, sobre lâminas de vidro, onde aderem e serão, em seguida, 
corados. (Junqueira e Carneiro 2013) 
 
 
Figura 6: Aparelho banho maria. 
Fonte: Arquivo pessoal. 
 
 
 ​2.10. Coloração 
 Etapa mais importante dos processos histológicos, a coloração possibilita a 
visualização, no microscópio óptico, dos componentes teciduais e celulares da amostra. 
 A transparência dos tecidos dificulta a análise óptica da lâmina. Para tal, as lâminas 
são banhadas e coradas por soluções corantes, naturais ou artificiais, cujas composições 
químicas aderem-se ao corte, distinguindo o núcleo celular e o meio celular. Os corantes 
mais utilizados, universalmente, são Hematoxilina e Eosina. Tais corantes diferem-se por 
afinidades químicas opostas, ácida ou básica. 
 
 
 
Figura 7: Próstata. H.E.; 4x. 
Fonte: Pathologika. 
 
 ​ ​2.10.1. Propriedades dos corantes 
 A estrutura geral dos corantes é fator determinante para o caráter ácido ou básico. 
Suas moléculas são formadas por ligações iônicas e covalentes: o cromóforo, responsável 
pela tintura do tecido, é associado ao cromógeno, o qual liga-se ao auxocromo, que delibera 
a afinidade da solução corante. Desta forma, o caráter e especificidade dos corantes serão 
influenciados por compostos iônicos dos auxocromos. 
 Corantes ácidos (Eosina) possuem auxocromo catiônico (ou ácido) ligado aos 
componentes celulares básicos (proteínas do meio citoplasmático e extracelular), chamados 
de acidófilos, e, como resultado, a amostra será colorida em tons de rosa/vermelho/laranja. 
 No oposto, corantes básicos (Hematoxilina) possuem auxocromo aniônico (ou 
básico) de afinidade com componentes celulares ácidos (o material genético do núcleo 
celular), chamados de basófilos, são tingidos em variações de azul e roxo. 
 
 Os corantes também são caracterizados de acordo com o tipo de ação da tintura no 
material, tempo da coloração e cromatização. 
 Dependendo do corante, a penetração no material celular precisa ser auxiliada por 
compostos químicos nas suas estruturas moleculares; corantes de ação direta penetram 
facilmente no interior celular, enquanto os corantes de ação indireta são auxiliados por um 
mordente - composto metálico, adicionado em solução -, a hematoxilina é um exemplo de tal 
corante, derivada da oxidação da hemateína, a qual o mordente liga-se covalentemente, 
conferindo durabilidade tintorial a hematoxilina. 
 Quanto ao tempo, uma coloração gradual do corte será progressiva, sem 
necessidade da retirada do excesso de corante; já no caso de coloração regressiva, o tecido 
hiper corado suscita a diferenciação, ou seja, remoção do excesso para não danificar a 
avaliação da amostra por artefatos técnicos. 
 Já a cromatização, refere-se a quantidade de cores utilizadas na colorização, 
classificadas em monocrômica (uma cor), bicrômica (duas cores), tricrômica (três cores) ou 
policrômica (mais de três cores). 
 
 
 
 
 
 
2.10.2. Coloração da lâmina 
 Em seguida a microtomia, a amostraé aquecida em estufa a cerca de 45°C, para 
derretimento da parafina, sucessivamente, a mesma precisa ser lavada para a limpeza dos 
resíduos de parafina antes de ser submetida a solução corante, que, por sua vez, é solúvel 
em água. Tal etapa é a desparafinização, em que a lâmina é mergulhada em banhos de xilol. 
Uma ineficiente remoção da parafina prejudica a passagem do corante nos componentes 
teciduais. 
 Após desparafinizada, a lâmina passa por hidratação na qual o xilol é removido, o 
material é imerso por substância alcoólica em concentrações decrescentes até que, por fim, 
os tecidos são corados para a nitidez da análise em microscópio de luz. 
 
Preparação da amostra antes da coloração: 
​OBS​: quantidade de reagentes e duração das etapas variantes por tipo e tamanho de 
amostra e solução corante a ser utilizada. 
 
 No caso de coloração de H.E. (Hematoxilina e eosina), a lâmina, primeiramente, é 
submergida na solução de hematoxilina e, por seguinte, lavada em água corrente. Ela é 
rapidamente desidratada por álcool, para retirada do excesso de corante, e, então, corada 
por eosina e lavada novamente. O material, agora tonalizado pelas duas soluções, é levado 
ao álcool para 3 banhos desidratantes e clarificado com 2 banhos de xilol, a fim de fixar o 
corante no corte. Para finalizar, a lâmina será selada. 
 
Processo de coloração do corte por Hematoxilina – Eosina: 
 ETAPA REAGENTE DURAÇÃO 
 Desparafinização Xilol l 3 – 10 min 
 Desparafinização Xilol ll 3 – 10 min 
 Desparafinização Xilol lll 3 – 10 min 
 Hidratação Álcool l 100% 5 min 
 Hidratação Álcool ll 100% 5 min 
 Hidratação Álcool 95% 5 min 
 Hidratação Álcool 80% 5 min 
 Hidratação Álcool 70% 5 min 
 Lavagem Água destilada 10 min 
 ETAPA REAGENTE DURAÇÃO 
 Coloração Hematoxilina 3 min 
 Lavagem Água corrente 10 min 
 Desidratação Álcool 70% 1 min 
 Coloração Eosina 8 – 20 min 
 Lavagem Água corrente 1 min 
 Desidratação Álcool 70% 2 min 
 Desidratação Álcool l 100% 3 min 
 Desidratação Álcool ll 100% 3 min 
 Fixação do corante Xilol l 5 min 
 Fixação do corante Xilol ll 10 min 
 
OBS​: quantidade de reagentes e duração das etapas variantes por tipo e tamanho de 
amostra e solução corante a ser utilizada. 
 
 2.11. Selagem ou montagem 
 Na etapa final do processamento, a amostra recém corada precisa ser coberta com 
uma lamínula de vidro, advindo o nome selagem, previamente limpa por solução alcoólica. 
 Em geral, são usadas resinas naturais, por exemplo, o Bálsamo do Canadá, para a 
fixação da lamínula, com atenção a formação de bolhas de ar, as quais podem ser removidas 
pressionando moderadamente com o uso de pinça. A lâmina passa por secagem na estufa e, 
logo após, é etiquetada. 
 Por fim, a amostra está pronta para a avaliação histológica no microscópio de luz. 
 
 
3. Conclusão 
Processamento histológico é um conjunto de etapas que precisam ser seguidas 
criteriosamente em uma determinada ordem, uma vez que cada passo depende da execução 
adequada do anterior para que seja realizado com êxito. Todos os procedimentos do 
processamento histologico são de suma importância, pois sem eles não seria possível o 
estudo aprofundado de tecidos e células do corpo. Viabilizam estudos e análises 
histotecnológicas por microscópio óptico, compreensão aprofundada do funcionamento do 
organismo animal e, por conseguinte, na prevenção e formulação de tratamentos 
especializados e resolução de doenças. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referências bibliográficas 
 
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