Reações Cinéticas

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Reação Cinética de Dois Pontos 
As reações cinéticas são geralmente aplicadas nas determinações de atividades de enzimas, mas podem ser 
utilizadas para determinação de analitos (ex: creatinina que geralmente apresenta vários interferentes 
endógenos ou exógenos), habitualmente ensaiados por reações de ponto final. A creatinina é comumente 
dosada com uma reação de ponto final, mas pode-se também utilizar uma reação cinética de dois pontos. Neste 
caso, a reação de ponto final é aplicada em metodologias manuais e a reação cinética é utilizada, 
principalmente, em metodologias automatizadas (a cubeta estará automatizada o tempo inteiro, não terá erro 
sistemático). 
Quando se dispões de facilidades instrumentais para medidas fotométricas contínuas em tempos reduzidos, 
pode-se medir em modo cinético de dois pontos vários analitos habitualmente ensaiados por reações de ponto 
final (o fato de se entender como ocorre uma reação de ponto final, consegue-se padroniza-la para uma cinética 
de dois pontos e com isso há um ganho de tempo). Se uma determinação de glicose, usando a enzima glicose 
oxidase, é medida em 10 minutos na reação de ponto final (essa reação geralmente demora porque todo 
produto que poderia ser formado foi produzido), pode-se realizar a mesma determinação usando um 
instrumento capaz de medir a reação em um tempo de 5 minutos ou menos (normalmente são 60 segundos, 
pois avalia a fase linear onde há uma velocidade constante para que haja a produção do produto, isso porque 
no início da reação os sítios catalíticos das enzimas não estão totalmente preenchidos e no final há um consumo 
completo de substratos), quando se tem a certeza de que as medições das amostras desconhecidas, calibradores 
e controles serão realizadas no mesmo tempo de reação e que a velocidade de reação é a mesma para amostras, 
controles e calibradores. 
As reações cinéticas de dois pontos podem ser utilizadas para diminuir o tempo de reação, minimizar a ação 
de interferentes ou estender a linearidade do sistema analítico (existem interferentes de ação rápida e ação 
longa, assim é dado um tempo para que esses interferentes sejam degradados e é feito um corte na reação antes 
do aparecimento desses produtos de degradação). Comumente, as reações cinéticas de dois pontos utilizam a 
fase inicial da reação com mediação aos 30 segundos, que servirá como branco, e outra medição aos 90 
segundos. Utiliza-se então o delta da reação para calcular a concentração do analito (o fator de calibração será 
a concentração informada pelo calibrador dividido pelo delta que será a leitura final menos a leitura inicial). 
A escolha do intervalo de medição mais adequado irá depender da melhor linearidade, da eliminação de 
interferentes ou da melhor sensibilidade. Observar que a velocidade de reação é maior nos tempos iniciais 
onde logicamente a sensibilidade é maior (o problema é que no tempo inicial, onde a velocidade é maior, a 
 
reação não será medida pois ela não é constante). 
Existem reações cinéticas de dois pontos em que os intervalos são maiores, como no caso da Frutosamina, 
quando é necessário um tempo mais longo na fase inicial para maximizar a eliminação de interferentes. Deve-
se enfatizar que o controle da temperatura também é fundamental nas reações cinéticas de dois pontos. Na 
reação cinética, é necessário um equipamento espectrofotômetro com cubeta termostatizada e ele tem que ser 
programado para que seja possível manter o intervalo cinético de maneira adequada. 
Gráfico – Cinética de Dois Pontos 
Geralmente o ângulo mais adequado para uma reação cinética é em torno de 45°. Um ponto importante é que, 
quanto mais próximo da abscissa do X menor será a velocidade de reação e quanto mais próximo do Y maior 
a velocidade de reação. 
Se a velocidade de reação for muito rápida, ela não será possível de ser detectada e por isso será necessário a 
diluição para que a concentração de enzimas na amostra do paciente seja diminuída e assim, posteriormente, 
será multiplicado pelo fator de diluição. Por isso, que o ângulo mais apropriado é em torno de 45°C. 
Todos os conjuntos diagnósticos (KIT) têm excesso de substrato para que as reações aconteçam com 
velocidade constante, ou seja, fazer o preenchimento de todos os sítios analíticos. A informação que vem no 
conjunto diagnóstico é chamada de prospecto (não é bula!!) 
Exemplo 
Paciente com hepatite. Ao pegar um tubo, colocar o reagente dentro e pipetar no tubo 10 microlitros da amostra 
do paciente, terá tanta enzima (transaminase) na fase aguda da hepatite que quando for colocado a amostra do 
paciente no tubo haverá um rápido consumo do substrato que fará com que a velocidade fique muito rápida 
em milissegundos e com isso a determinação será muito difícil. 
Após isso, com uma alta concentração de enzimas (curva estourada), terá que fazer uma diluição para que 
reduza a quantidade. 
Assim, é feito novamente a determinação e assim será notável uma proporcionalidade entre a quantidade de 
enzimas e a quantidade de substrato presente no meio para que elas transformem em produto e por isso, quando 
for preenchido todos os sítios catalíticos a velocidade não terá como aumentar. Logo, é necessário excesso de 
substrato em um certo tempo para que os sítios catalíticos sejam preenchidos aos poucos até atingir sua 
velocidade máxima. 
Vale ressaltar que, na região de 0 a T1 ainda não houve tempo suficiente para que todos os sítios catalíticos 
fossem preenchidos e por isso, a velocidade ficará aumentando. Depois de ficar constante, ela cairá devido ao 
consumo de todo o substrato. 
Percebe-se que no gráfico abaixo há um intervalo cinético (T2- T1), se a velocidade continuasse constante 
poderia ter T3-T2, T4-T3 e etc. Em geral, as cinéticas contínuas possuem no mínimo dois intervalos cinéticos. 
 
Exemplos 
Creatinina: 
 A determinação é feita através de 4 etapas. Sendo que o final é semelhante as reações de glicose, 
colesterol e triglicérides. Ou seja, se houver a formação de um produto que interaja com o peróxido, 
vai ser possível usar a peroxidase para formar a quinonimina colorada. 
 A intensidade da quinonimina formada será diretamente proporcional a concentração da creatinina. 
 Essa reação também pode ser de ponto final (espera-se 10 minutos para que haja toda creatinina da 
amostra medida como quinonimina, porém se, por exemplo, o paciente estiver usando um antibiótico 
leva o aparecimento de interferentes (por competição ou cromogênica) e assim vai ser preferível fazer 
uma reação cinética para que haja uma otimização 
 Na determinação da creatinina no modelo de dois pontos, é feita a primeira medida em 30 segundos 
que será o branco de reação cinética e após 5 minutos será feito uma nova medida para que possa ser 
feito o cálculo do delta de reação. 
 A cinética enzimática, além da determinação de enzimas, pode determinar metabólitos (Ex: creatinina) 
 
Frutosamina: 
 Usa-se o método colorimétrico do NBT 
 A primeira medida é feita em 10 minutos e após 5 minutos será feito a segunda medida, isso porque 
existem diversos interferentes exógenos que podem afetar a reação da determinação da Frutosamina 
(entre 0 e 10 min). A Frutosamina são proteínas glicadas utilizadas para usar o comportamento de 
pacientes diabéticos (normalmente albumina glicada, após 21 dias de controle glicêmico). 
 O cálculo é feito através da concentração do calibrador/ absorvância final menos a inicial 
 
Reação Cinética Contínua 
As reações que utilizam medidas contínuas da formação de produtos são denominadas “reações de cinética 
contínua”. 
 
Pontos importantes: 
 Quanto maior a quantidade de intervalos, mais precisa será a reação. Se houve, por exemplo, dois 
intervalos cinéticos em que o delta “d-c” e “c-b” forem iguais será possível afirmar que a velocidade 
da reação é constante, se “d-c” for maior que “c-b” é possível confirmar que a reação aumentou develocidade e se “c-b” for maior que “d-c” a reação diminuiu a velocidade. 
 Vale ressaltar que, na reação de cinética contínua quando não se dispõe de um fotômetro com 
temperatura controlada, deve-se utilizar reação cinética de tempo fixo. 
 Geralmente na cinética contínua possui mais de um intervalo e na de dois pontos terá somente um 
intervalo. 
Sintetizando – Reações Cinéticas 
As reações cinéticas são reações onde a velocidade da formação do produto é medida durante um intervalo de 
tempo, que pode ser horas, minutos ou segundos e a determinação cinética é decorrente do relacionamento da 
reação com o tempo. Muitos consideram reações cinéticas aquelas em que se mede a formação do produto 
usando pequenos intervalos de tempo, minuto a minuto, na faixa ultravioleta do espectro (340 ou 345 nm). 
Estas reações, sem dúvida, são cinéticas, mas também são aquelas reações em que se mede a formação de um 
produto em 5, 10 ou 30 minutos de incubação. As medições da atividade da fosfatase alcalina e amilase, entre 
outras, são realizadas utilizando reações cinéticas 
Na reação cinética contínua e cinética de dois pontos, é importante que o equipamento tenha cubeta 
termostatizada. Na reação de tempo fixo é imprescindível um rigoroso controle da temperatura e do tempo de 
incubação.