Lista 3 - Eng Bioquímica (1)

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1) Revise o Capitulo (6) de Cinética de Processos Fermentativos (W.S) e Capítulo 4 (AIBA). Acrescente ainda os contidos nas pg(s) 138 a 142 – Cap (7) (W.S). Resolva os seguintes questões: 
a) Pesquisar as diferentes formas de classificação das fermentações ou cultivos segundo Gaden e Deindoerfer exemplificando-as. 
b) No item 6.3, avalie o exemplo fornecido na figura 6.2, calculando as velocidades especificas para o tempo de quatro e seis horas de fermentação.
b) Utilizando a Tabela (1), com dados de uma fermentação alcoólica de hidrolisado amiláceo, construa as seguintes curvas: 
c1) Das concentrações de células (X), concentração de substrato (S) e de produto (P) em função do tempo. 
c2) Com os dados do item c1, alisados, e com a e a planilha Excel calcule as velocidades volumétricas de crescimento celular, consumo de açúcar e produção de etanol em função do tempo,
c3) E as velocidades específicas de crescimento da levedura, consumo de açúcar e produção de etanol em função do tempo.
 
c4) Construa as curvas de velocidades especificas de crescimento celular, consumo de substrato e formação do produto em função do tempo e verifique se a formação do produto está associada ao consumo do substrato. 
c5) Analise o item 6.6 quanto a influência da concentração de substrato sobre a velocidade de crescimento celular. 
Classificação segundo Gaden:
Relaciona a formação de produto com a utilização do substrato. 
Tipo I – formação de produto diretamente relacionada com a utilização de carboidrato (etanol). 
Tipo II – formação de produto indiretamente relacionada com a utilização de carboidrato (ácido cítrico). 
Tipo III – formação de produto aparentemente não associado com a utilização de carboidrato (Penicilina).
Classificação segundo Deindoerfer: 
Simples - nutrientes convertidos a produtos numa estequiometria fixada, sem acúmulo de intermediários. 
Simultânea – nutrientes convertidos a produtos em proporção estequiométrica variável, sem acúmulo de intermediários. 
Consecutiva – Nutrientes convertidos a produtos com acúmulo de intermediário.
Escalonada - O crescimento microbiano ocorre a partir de dois substratos. O primeiro faz crescer linearmente e o segundo de maneira variável, porém continua aumentando a concentração celular.
b) As velocidades específicas para o tempo de 4 horas de fermentação, segundo os dados do exemplo citado foram:
μX= 0,08 ; μS=0,85 ; μP=0,78.
Para o tempo de 6 horas, foram: 
μX= 0,12 ; μS=1,43 ; μP=1,07
c1)
 
Dada a tabela 1, pôde-se construir os gráficos de Sxt, Xxt e Pxt.
 
A partir do gráfico, os dados foram analisados a partir de um ajuste de função polinomial de quarto grau, os resultados obtidos foram utilizados para calcular as próximas alternativas.
C2) Sabe-se que as velocidades volumétricas são denotadas por:
 
Sendo assim, a partir do cálculo da planilha, obteve-se:
C3) a partir do cálculo da planilha, obteve-se os seguintes valores de velocidades específicas:
C4) 	As velocidades específicas de consumo de açúcar (μs) a formação de produto (μp), apresentam perfis semelhantes, correlacionando-se assim muito bem. A velocidade específica de crescimento celular (μx) apresenta, aproximadamente, o andamento das outras duas curvas. Pode-se dizer então que a formação de produto está associada ao crescimento. Ou seja, a formação do produto está diretamente ligada ao consumo do substrato.
C5) 	No início do cultivo, onde S é alto, o microrganismo apresenta uma velocidade específica próxima à máxima, podendo a mesma situar-se nesta região durante uma boa parte do processo, mesmo que o metabolismo celular provoque uma diminuição apreciável no valor de S.
A expressão considera μx elevado e próximo do valor máximo, logo que o microrganismo é colocado na presença de um meio, com uma concentração inicial de substrato relativamente elevada. O microrganismo é, nessas circunstâncias, considerado adaptado. Uma baixa constante de saturação Ks implica em uma maior duração da fase exponencial, para Ks = 0,60 mg/L, os valores de μx logo se distanciam de μm, à medida que o substrato vai sendo consumido. Assim, a duração do "patamar" dependerá da magnitude de Ks.
2- Cap. 8 Gabi
	Cap. 9 - Fermentação Descontínua
9.1 - Introdução
9.2 - Inóculo: Fala sobre a preparação e volume do inóculo, cuidados, incubação, armazenamento dos microrganismos, manutenção da cepa.
9.3 - Mosto: Fala sobre as condições e cuidados necessários para o crescimento dos microrganismos, quais nutrientes devem ser levados em conta, composição elementar de uma célula microbiana, meios de obtenção dos nutrientes, fatores que devem levados em consideração do ponto de vista industrial, substratos e matérias primas para utilização em cultivo microbiano (último parágrafo).
9.4 - Classificação: Classificação dos processos descontínuos em 3 grupos e suas definições.
9.5 - Número de Dornas: Metodologia para o cálculo da quantidade de fermentadores que serão necessários, cálculo da capacidade útil de cada um dos fermentadores, número econômico de dornas.
	Cap.10 Brunna
	Cap. 11 Esther
Tudo sobre fermentação semicontínua
	Cap. 20 Esther
Construção de equipamentos de fermentação
3) Utilizando a informações fornecidas no item 9.5 do W.S (V2) e a lista de preços fornecida por um fabricante de dornas estabeleça o numero econômico de dornas: 
A partir da tabela anterior, dada pelo exercício, foi calculado o LN destes valores e então construído um gráfico com esses valores linearizados:
Sabendo que e com os valores da equação da reta, pôde encontrar:
a=0.6863 e k=e^(1.2571)= 3.515
Como, para este caso o número de dornas D é igual ao número econômico de dornas tem-se: . Portanto E=6,38. Arredondando para cima, pode-se considerar 7 o número econômico de dornas.
	
4- Esther
5)
a) Descreva as vantagens e desvantagens dos Processos Contínuos em Relação aos Processos Descontínuos.
b) Resuma os exemplos de Processos Contínuos apresentados no Capitulo 5 do Aiba.
c) Descreva os problemas práticos existentes nos Processos Contínuos.
d) Resolva e explique o exemplo 5.6 do Aiba.
(a) As principais vantagens apresentadas pelo processo contínuo de fermentação, em relação ao descontínuo tradicional, são decorrentes da operação em estado estacionário, podendo-se destacar:
· Aumento da produtividade do processo, em virtude de uma redução dos tempos mortos ou não-produtivos;
· Obtenção de caldo fermentado uniforme, o que facilita o projeto das operações de recuperação do produto de interesse ("downstream"); 
· Manutenção das células em um mesmo estado fisiológico, o que torna o processo contínuo uma excelente ferramenta para estudos de mecanismos de regulação metabólica ou, ainda, para estudos de otimização da composição do meio de cultura;
· Possibilidade de associação com outras operações contínuas na linha de produção;
· Maior facilidade no emprego de controles avançados;
· Menor necessidade de mão-de-obra.
(b) - Levedura
 
	O livro apresenta um exemplo de produção de fermento de pão em cultura contínua que foi conduzida em um fermentador de 5 litros do tipo jarro. A fermentação contínua foi mantida em estado estacionário durante 2 dias. Houve variação em YX/S devido à respiração endógena ineficiente a taxas baixas de diluição, sendo mais difícil manter um estado estacionário quando se está próximo da “lavagem” a altas taxas de diluição. Nesta condição de altas taxas, começaram a surgir formas miceliais de leveduras que não eram contaminantes. Embora as mesmas tivessem uma atividade respiratória alta, não constituíram bons fermentos devido ao seu caráter granuloso.
-Bactéria
	A figura a seguir mostra um exemplo de cultura de estado estacionário da bactéria Aerobacter aerogenes. Esse exemplo aplicava-se a codições onde o radical amino era o substrato limitante de crescimento S. Ambos os valores, massa de células X e o substrato S, apenas foram medidos após pelo menos 2 a 3 dias no estado estacionário para cada valor de D. 
	
· Fungos
	O crescimento contínuo de Actinomyces e fungos em fermentadores de pequena escalae em série constituem um dos exemplos, no qual o transporte de micélio de um recipiente para outro é um problema que não é verificado quando outros microrganismos, tais como leveduras e bactérias quando estes são cultivados continuamente. Outro exemplo é o estudo da cultura de Strepcomyces cureofaciens com um fermentador de 10 litros, utilizando um meio sintético. A sucrose foi escolhida como substrato limitante, e variada em dois níveis de concentração diferentes. Desta forma, os rendimentos máximos de micélios foram observados próximo a “lavagem”.
 
(c) O processo contínuo apresenta alguns problemas práticos como:
· Maior investimento inicial na planta; 
· Possibilidade de ocorrência de mutações genéticas espontâneas, resultando na seleção de mutantes menos produtivos;
· Maior possibilidade de ocorrência de contaminações, por se tratar de um sistema essencialmente aberto, necessitando pois, de manutenção de condições de assepsia nos sistemas de alimentação e retirada de meio, desde que o processo assim o exija;
· Dificuldades de manutenção de homogeneidade no reator, quando se trabalha com baixas vazões, ou quando o caldo adquire comportamento pseudoplástico, como é o caso do cultivo de fungos filamentosos;
· Dificuldades de operação em estado estacionário em determinadas situações (formação de espuma, crescimento do microrganismo nas paredes do reator, ou ainda, nos sistemas de entrada e saída de líquido).
(d) São apresentados os seguintes dados de fermentação descontínua do crescimento de Lactobacillus delbrueckii:
Dos dados de fermentação descontínua, temos que cada valor de dN/dt é calculado e locado em relação a N, como mostra o gráfico a seguir:
 	Utilizando o método gráfico para determinar a concentração de célula em cada recipiente, o valor de F requerido para a condição desejada de N = 8 U.D.O / ml pode ser determinado por um método de tentativa. Assim temos:
P/V = 0,40 1/h
P= 0,40. 100 = 40 L/h
N1=5,35 U.D.O/ml
N2=7,95 U.D.O/ml
 
6) Considerando a concentração inicial de substrato (S0) da ordem de 2,5 g/litro e que a operação foi conduzida em regime estacionário em processo contínuo. Pede-se: 
6a) Calcule a taxa de Diluição (D); 
6b) Determine µmax e KS; 
6c)Determine a taxa de diluição ótima; 
6d) os rendimentos relativos á seis últimas diluições ( YX/S ); 
6e) Para um tempo (tL) de seis horas e uma razão [(Xi/X) = 0,5], calcule: os tempos de duplicação das quatro ultimas diluições, onde [ (tg) = ln2/µx ] e 
6f) represente o gráfico de [X , S = f(D)] e calcule graficamente [Xmax/Dmax]
 a) 
D=F/V
V=20*0,6=12 litros
F=fluxo
Os resultados estão dispostos na segunda coluna da tabela
	fluxo (l/h)
	D(h-1)
	X (g/L)
	S1: glicose (g/L)
	0,0
	0,0
	1,32
	0
	4,6
	0,383
	1,33
	<0,03
	5,0
	0,417
	1,30
	<0,03
	7,2
	0,6
	1,26
	<0,03
	8,4
	0,7
	1,25
	<0,03
	10,0
	0,833
	1,29
	<0,03
	11,9
	0,999
	1,27
	<0,03
	13,9
	1,15
	1,23
	<0,03
	14,5
	1,21
	1,07
	<0,03
	15,8
	1,317
	1,26
	<0,03
	16,6
	1,383
	1,00
	<0,03
	17,3
	1,442
	0,95
	0,28
	18,3
	1,525
	0,72
	0,88
b) utilizando as duas ultimas linhas da tabela, temos
S=(ks.D)/(umax-D)
0,28=(Ks.1,442)/(umax-1,442)
0,88=(Ks.1,525)/(umax-1,525)
Resolvendo o sistema temos
umax=1,5671 h-1
Ks=0,0243 g/L
c) 
Dótima=0,383 h-1 -> maior X.
d) X=Y.(S0-S1)
S1=(ks.D)/(umax-D)
Assim temos os seguintes resultados
	F=13,9
	Y=0,5066
	F=14,5
	Y=0,4439
	F=15,8
	Y=0,5351
	F=16,6
	Y=0,4382
	F=17,3
	Y=0,4457
	F=18,3
	Y=-1,2779
e) Utilizando a equação dada, temos
	F=15,8
	t=0,5261 h
	F=16,6
	t=0,5012 h
	F=17,3
	t=0,4806 h
	F=18,3
	t=0,4545 h
f) 
	Assim, Xmax/Dmax= 1,26/1,317= 0,957
1) 7- Supondo que haja uma produção contínua de levedura na qual o liquido de alimentação contêm como substrato limitante a glicose, numa concentração (S0 = 20g/litro). Considerando uma velocidade específica de crescimento de (µx = 0,5 h-1) e que nessas condições a concentração de açúcar residual no tanque é desprezível e ainda que nessas condições o valor de Yx/S = 0,3. 
7A) Calcule a velocidade de crescimento do microrganismo, (dX/dt)c .
(a) Concentração de açúcar residual desprezível, então S = 0.
X= (S0-S) = 6 g/L
então dX/dt = = 0,5.6 = 3 g/L.h
(b)
8) Refaça o exemplo 6.5 (pg.164) do Cap.6 do AIBA e colaboradores, relativo ao exemplo de cálculo de Aeração e Agitação, interpretando os resultados obtidos.
9- Nesse Capitulo ainda , verifique quais os fatores que afetam os coeficientes de transferência de massa ( Ex. Kla )
O valor de Kla pode alterar com a adição de substâncias orgânicas, com a temperatura, presença de agentes tensoativos e o tipo de aspersório. Para caldo de fermentação miceliar, a viscosidade pode também alterar Kla.
10- Refaça o exemplo 7.5 (pg.189) do Cap.6 do AIBA e colaboradores, relativo ao exemplo de cálculo da ampliação de escala “SCALE-UP” de um reator para cultivo de bactérias, explique os resultados finais obtidos
11- Gabi
11- O Capítulo 19 do Willibaldo (V2) retrata a operação de instalações industriais de fermentação, analise-o detalhadamente, e especificamente verifique as operações com os fermentadores quanto a esterilização do meio, a influência do calor sobre o substrato, a aeração e os controles operacionais ( Temperatura, pressão e fluxo de ar, medição e controle do oxigênio dissolvido, agitação, medição e controle de pH, espumas, gases de exaustão, Reologia, Acessórios. 
 
Esterilização dos meios: a forma mais usada é pelo aquecimento. Ele atua de forma diversa sobre os organismos. Uns são mais resistentes, outros menos. A variação de comportamento em relação ao calor se dá em ampla faixa de temperatura e em relação à forma de aplicá-lo, úmido ou seco. O vapor saturado ou superaquecido é usado nas esterilizações industriais. O calor em meio úmido afeta mais do que em ambiente seco. Alguns microrganismos morrem pela exposição em autoclave a l20°C por 20 a 30 minutos (calor úmido), e resistem por 3 a 4 horas em forno a 160-180°C (calor seco). o meio influi diferentemente para cada microrganismo, havendo maior resistência nos substratos mais completos. Os constituintes, a umidade e o pH do meio afetam a resistência ao calor. Em meio ácido os microrganismos são mais sensíveis; em meio próximo da neutralidade apresentam o máximo de resistência. A alcalinidade também reduz a resistência. A esterilização dos substratos é feita nos recipientes de fermentação ou em separado. Quando é executada em separado, são empregados aparelhos de fluxo contínuo e o substrato é encaminhado aos equipamentos, já esterilizados à parte. A esterilização por fluxo contínuo evita, em certos casos, a corrosão dos recipientes pela residência do substrato quente.
Influência do calor sobre o substrato: A esterilização pelo calor pode causar alterações na composição do substrato, pela decomposição de constituintes e interação entre outros. A decomposição conduz a uma perda da capacidade nutricional e a interação ao aparecimento de substâncias inibidoras. Comumente, as temperaturas de decomposição são inferiores à de esterilização e a forma de evitá-la é provocar aquecimento rápido ao máximo de temperatura e o resfriamento imediato e rápido a baixas temperaturas. A tendência é o uso · de técnicas que permitam usar altas temperaturas em períodos curtos, fazendo fluir o substrato sob pressão para o fermentador, através de uma unidade de esterilização. A operação de aquecimento e resfriamento tarda alguns segundos. A esterilização em fluxo é superior à forma estacionária, porque permite melhor aproveitamento do calor com menor gasto de vapor e maior maneabilidade do processo, sobretudo quando se trata de coordenar o trabalho em diversas escalas de fermentadores. Conduz também à menor corrosão dos equipamentos, permite dimensionar as tubulações e bombas com maior precisão, e facilita a automação dos processos. Quando há interação entre os constituintes do substrato ou perigo de decomposição de alguns componentes, é recomendada a sua esterilização à parte e sua reunião posterior, em condições assépticas.
Aeração: O ar nos fermentadoresé usado para suprir de oxigênio a operação, para eliminar produtos metabólicos voláteis, às vezes inibidores, para reduzir o risco de contaminação, mantendo internamente urna pressão positiva e para transferir líquido de um para outro recipiente. A transferência e a condução de líquidos por pressão de ar, sem bombas, diminui a complexidade mecânica e os riscos de contaminação. Para vencer a pressão exercida pelo líquido no fermentador, é necessário comprimir o ar. A compressão aquece o ar a temperaturas que variam de acordo com a pressão exercida. Para compensar o aquecimento, o ar é distribuído nos fermentadores depois de um resfriamento, para que o aumento da temperatura não interfira com a atividade do agente de fermentação. O aumento da temperatura pela compressão pode realizar a desinfecção do ar, ou reduzir o número de contaminantes.
Temperatura, pressão e fluxo de ar: Para compensar a perda de calor e manter a temperatura adequada aos agentes de fermentação, são usadas serpentinas ou camisas para aquecer o substrato. Se houver excesso de temperatura, os mesmos dispositivos podem resfriar. O controle pode ser automático. Nos grandes fermentadores a área de irradiação decresce proporcionalmente ao aumento de volume. Quando a temperatura no interior aumenta, precisa ser resfriada. Trabalhando com água fria, os dispositivos de aquecimento funcionam como resfriadores. A temperatura pode ser medida contínua e automaticamente, registrada e corrigida da mesma forma. Controladores de ar podem regular sua vazão; a pressão interna, de preferência deve ser superior à externa, para evitar entrada de ar do exterior sem esterilização.
Oxigênio dissolvido: Nos processos aeróbios, que necessitam de injeção de ar no substrato para atender às exigências do microrganismo, é. necessário que eles recebam seu suprimento de oxigênio adequadamente. O oxigênio dissolve em água e a dissolução depende da temperatura e da ocorrência de outras substâncias também dissolvidas. A determinação do oxigênio dissolvido no substrato para fermentação, é feita por meio de eletrodos que medem continuamente o potencial gerado pelo oxigênio. Seu conhecimento permite a correção da aeração, quando houver necessidade de alterar o suprimento de oxigênio.
Agitação: As fermentações aeróbias precisam de uma boa distribuição do ar no interior do fermentador. Com agitação há uma dispersão uniforme das bolhas de ar e também dos nutrientes, que não ficam concentrados em determinadas zonas. A avaliação do desempenho da agitação é feita pelo gasto de energia, medida ou registrada pela variação da potência consumida pelos agitadores. A variação de consumo de energia é causada pela alteração da densidade, da viscosidade do meio e pela resistência oposta pelas células, geralmente crescente com o progresso da fermentação. A medida da variação da potência é adequada para o controle dessa operação.
Medição e controle de pH: A existência de eletrodos esterilizáveis permite incluir nos fermentadores, como acessório, um medidor de pH, com ou sem registrador, acoplado ou não a um sistema automático de adição de álcali ou de ácido para corrigir o meio. Os eletrodos devem ser examinados quanto à precisão de suas medidas, porque as constantes esterilizações podem alterá-los. Nem sempre há a necessidade de elevar ou reduzir o pH durante a fermentação, mesmo que ele esteja diferente do início do processo. Entretanto, há processos que só têm desempenho adequado em relação ao produto, se a reação do meio se mantiver dentro dos níveis considerados como os adequados.
Espumas: As espumas têm origem na aeração, na agitação e no desenvolvimento de gases no interior dos substratos em fermentação; seu aspecto é diverso nos diferentes meios, por razão de suas características reológicas. Reduzir a formação de espumas pela diminuição da intensidade de aeração, da agitação, ou de ambas, pode reduzir a produtividade e o rendimento. Contornar o efeito da formação de espuma por redução do volume de meio nos fermentadores, deixando grande espaço vazio, é antieconômico porque reduz a capacidade de produção ou a eficiência da fábrica. Outras formas de reduzir a formação de espumas são diluir os substratos ou modificar as características reológicas dos meios naturais, por meio de precipitação de coloides e sua decantação segui- .1 da de filtração. As espumas dificultam as operações de assepsia e de desinfecção. Por isso devem ser evitadas ou eliminadas, e a maneira mais efetiva é a adição de antiespumantes, automaticamente de preferência. Quebra-ondas, batedores, ultrassom são outros sistemas utilizados, sem a mesma eficiência. Os antiespumantes são fabricados à base de silicone, de álcoois superiores e agentes de ação de superfície dispersos em óleos. Os à base de silicone são adicionados em menor proporção que os demais.
Gases de exaustão: Os gases que saem do fermentador (C02, ou O2) permitem medir o grau de desenvolvimento do microrganismo. A existência de outros gases indica anormalidade do processo, que deve ser corrigida.
Reologia: O meio de fermentação possui características reológicas, as quais mudam à medida que o processo progride. As mudanças são causadas pelo aumento do número de células, pelo aumento da temperatura, pelo aparecimento e aumento do metabólito. As modificações afetam a agitação, a aeração e outros fatores que devem ser corrigidos, quando acusarem anormalidade.
Acessórios: Os acessórios, aqui compreendidos os equipamentos de medição, tubulações, registros, centrífugas, filtros e outros, devem estar muito limpos e instalados de forma a poderem receber e escoar facilmente a água de lavagem, acompanhada ou não de detergentes ou antissépticos. Da mesma forma, devem ser projetados para serem esterilizados, poder receber aquecimento por vapor e permitir o escoamento dos condensados. As transferências de líquidos a fermentar, de efluentes de qualquer natureza e de inóculos devem ser feitas preferencialmente por gravidade ou por pressão de ar, para evitar a circulação por bombas, o que diminui a eficiência da assepsia. As bombas devem ser facilmente desmontáveis e permitir lavagem e esterilização.
12- Avalie o exemplo de operação de uma indústria de fermentação Alcoólica (19.5) do Capitulo 19 do Willibaldo (V2).
O primeiro passo em uma destilaria de aguardente ou de álcool é obter os mostos e ter um inóculo bem preparado.
- Preparo dos substratos: Os inóculos são comumente preparados com leveduras de panificação, ou com leveduras selecionadas. Os melaços são diluídos com água, até uma concentração adequada, sem outros tratamentos. Para reduzi-las, os colmos são lavados com água, mas nem sempre ficam perfeitamente limpas. Após a moagem, o caldo costuma ainda conter solo, que deve ser eliminado por decantação. Após a clarificação, o mosto é resfriado à temperatura adequada e adicionado ou não de nutrientes, tais como sais de amônio e de fósforo. A adição de nutrientes depende das condições de maturação da matéria-prima ou da variedade. Normalmente os mostos oferecem uma reação adequada para o processo.
- Condução e supervisão da fermentação: primeira fermentação começa com o contato do mosto com o inóculo. Por maior que seja o número de leveduras trazido pelo inóculo, as primeiras fermentações são normalmente lentas, porque ainda ocorre a multiplicação do microrganismo. Ao final, o mosto fermentado, ou vinho, é encaminhado à centrífugas para separar uma parte das leveduras, ou encaminhado à destilaria, de acordo com o sistema de fermentação empregado. As leveduras separadas por centrifugação voltam aos fermentadores após tratamento adequado com ácido sulfúrico. A observação prática da marcha do processo fermentativo é acompanhada da verificação de sua regularidade e pureza, por meio da observação criteriosa de alguns fatores. Dentre eles, são muito importantes: o tempo de fermentação, cheiro, aspecto da espuma, a presença de drosófilas, temperatura, densidade do mosto, os açúcares totais contidos no mosto e residuais no vinho, o álcool no vinho e acidez.- A observação da ocorrência do fenômeno de floculação das leveduras indica uma séria irregularidade. As causas da floculação têm sido muito discutidas, mas não há uma segura definição de suas causas. É comum ser associada à presença de bactérias láticas no meio. Estudos recentes associam a floculação a causas genéticas. O aparecimento de drosófilas (mosca-do-vinagre) nos locais de fermentação ou sobre os mostos, indica infecção por bactérias acéticas.
13- De posse da aula de produção de Albumina do semestre passado, compare as principais etapas do processo de separação utilizadas e sua respectiva operação unitária.