PCR: Método de Amplificação de DNA

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Luíza Soares 19.2-2º Semestre 
 
PCR- Reação em cadeia da polimerase 
Prof Everton Batista 
 
Método in vitro de replicação do DNA; amplifica sequencias especificas; processo realizado em vários ciclos com 
diferentes temperaturas. Em que situações vai fazer o PCR? Digamos que um paciente chegue para realizar um teste 
para Hepatite C. Ele se machuca com algo perfurante e no dia seguinte vai fazer um exame de sangue. O exame 
coleta anticorpos do sangue. De um dia para o outro, não da para produzir anticorpos o suficiente para identificar no 
exame, devido a janela imunológica. 
O PCR é uma técnica mais direta. O teste utilizando anticorpos é mais indireto, você não procura o vírus, você 
procura os anticorpos. 
 
REAÇÃO DE PCR: 
• Dna a ser amplificado 
• Primers-forward e reverse 
• dNTPs-Nucleotídeos 
• DNA polimerase 
• MgCl2 
• H20 RNASE e DNASE FREE 
• Tampão. 
A nossa polimerase não existiria as variações do PCR. O PCR utilizado é o de bactérias que vivem em regiões de 
hipertermófilas, que vivem em condições extremas de temperatura. Essas bactérias apresentam enzimas que vivem 
em situações extremas. O DNA é quimicamente universal, se usarmos a enzima da bactéria, vai conseguir identificar 
o DNA de um camelo, de uma planta e humano. 
O MgCl2 é um cofator, vai funcionar como um ativador da enzima. É um do reagente que a gente mais mexe quando 
a reação não está muito boa. Ele pode ser aumentado ou diminuído para uma melhor adaptação da reação. 
RNASE e DNASE são endonucleases, enzimas que digerem material genético. Se estamos trabalhando com DNA e o 
objetivo é que ele seja duplicado, não pode ter enzima que degrada esse DNA. Por isso a água tem que ser livre 
dessas enzimas. Tem que estar livre de RNASE pois o primer tem fita simples, então essa enzima pode gerar 
degradação do primer. 
 
1ª FASE-DESNATURAÇÃO 
-Essa fase simula o trabalho da DNA helicase (quebrava pontes de hidrogênio). 
-Aquecimento a mais de 90°C para a separação da dupla fita; 
-Separa tanto a fita de DNA original quanto os produtos de amplificação. 
Se o fragmento é rico em G-C, vai usar temperaturas mais altas. Se o fragmento 
for mais rico em A-C, a temperatura pode ser menor. 
 
 
Luíza Soares 19.2-2º Semestre 
2º FASE- ANELAMENTO DOS PRIMERS 
-Hibridização; 
-Temperatura varia entre 40 a 70°C conforme o par de primers; 
-Determina a especificidade da ligação. 
Nas três fases, essa segunda fase é a que tem a maior variação de 
temperatura. 
 
Os primers são desenhados como uma sequência complementar a aquela sequência que você quer amplificar. Os 
primers são extremamente importantes para que a reação seja específica. 
3ª FASE-EXTENSÃO 
-Atividade da Taq DNA polimerase; 
-Duplicação do DNA; 
-Temperatura ótima em torno de 72°C. 
É a Taq DNA polimerase que faz a duplicação. 
 
 
Luíza Soares 19.2-2º Semestre 
ELETROFORESE: Coloca as amostras em uma matriz gelatinosa. Faz com que o DNA migre do polo negativo para o 
polo positivo. O DNA é negativo por conta do fosfato. Ele migra do polo negativo para o polo positivo, deixando sua 
marca. Não tem como ver o DNA em si, mas dá para ver as marcas que ele deixou. 
 
TIPOS DE PCR 
-PCR convencional; 
-Nested PCR; 
-PCR em tempo real (qPCR): além de dizer se tem a presença daquele DNA ou não, pode dizer quanto tem de DNA. É 
importante em casos de HIV, para saber a carga viral de um paciente que já sabe o diagnóstico. É uma quantificação 
absoluta, e não relativa; 
-RT-PCR: É um PCR que trabalha com RNA, faz a transcrição reversa. Transcreve o RNA em DNA para fazer o PCR; 
-PCR multiplex: Faz um PCR diagnóstico para várias infecções. Em um mesmo tubo, usa primer para diversas 
doenças. É um diagnóstico molecular mais complexo. 
 
APLICAÇÕES DO CONHECIMENTO 
• Diagnóstico de infecções: bactérias, vírus, fungos, protozoários. 
 
Produtos da reação de PCR visualizados em gel de eletroforese e tinção com brometo de 
etidio. M: marcador de peso molecular, C: controle da reação, CN: controle negativo, CP: 
DNA de células infectadas, CN: DNA de células não infectadas, P: amostra de DNA da 
paciente 
 
 
Quantificação de DNA ou RNA viral/célula hospedeira 
Diagnóstico de mutações gênicas e doenças genéticas 
 
• CONCLUSÃO: 
• A PCR é um processo de replicação do DNA in vitro; 
• Amplifica fragmentos específicos do DNA total; 
• Ocorre em 3 etapas; 
• O papel da maior parte das enzimas é substituído por temperaturas ou reagentes da técnica 
• É aplicada para fins diagnósticos na identificação, quantificação e análise de processos fisiopatológicos.