Biologia Molecular - Técnicas de Biologia Molecular Aplicadas à Microbiologia

Prévia do material em texto

técnicas de biologia molecular
aplicada a microbiologia
Técnicas de biologia molecular
aplicada a microbiologia
PCR (visa amplificar o material genético);
Eletroforese em gel (faz a separação dos
fragmentos que foram amplificados);
Western blot (proteínas);
Southern blot (DNA);
Northern blot (RNA)
Biologia molecular é o estudo da Biologia em nível
molecular, com especial foco no estudo da estrutura e
função do material genético e seus produtos de
expressão, as proteínas.
Nesse sentido, no âmbito da biologia molecular, o
estudo estará voltado para o DNA, o RNA e as proteínas.
A biologia molecular investiga as interações
bioquímicas celulares envolvidas na duplicação do
material genético e na síntese proteica.
Técnicas em Biologia Molecular: Muitos trabalhos
relacionam-se com a obtenção, identificação e
caracterização de:
Vale lembrar que o RNA é uma fita simples e que pode
ser traduzido em proteínas.
Assim, a sequência será sempre:
DNA → (Transcrição) → RNA → (Tradução) →
Proteína
Alguns vírus, como o HIV, são vírus de RNA. Assim, 
 para que esse RNA gere uma fita de DNA 
 correspondente, é muito importante a ação da
enzima transcriptase reversa. Nesse sentido, de RNA
para DNA também existe uma transcrição reversa.
Vale lembrar que existem alguns microrganismos que
são de difícil cultura por meio dos métodos
convencionais. Também há casos em que o
microrganismo está presente em contagens muito 
 baixas na amostra biológica para que possa ser 
 identificado. Em todos esses casos, é necessário apelar
para a biologia molecular a fim de identificar qual é
esse microrganismo presente na amostra.
O DNA é uma dupla hélice (duas fitas que se ligam) e o
processo normal de crescimento celular envolve a
duplicação desse DNA para, então, gerar novas células.
Quando for necessário fazer com que esse DNA gere um
produto, ele será transcrito em RNA.
Extração do materialExtração do material
genéticogenético
A extração do DNA ou RNA, e seu consequente
isolamento, pode ser realizada para qualquer tipo de
organismo e em diferentes tipos de amostra.
Existem vários métodos para realizar a extração DNA e
RNA, mas possuem a mesma finalidade: separar o
material genético de outros componentes celulares,
purificando-o. 
Obs.: É importante memorizar que o objetivo da
extração do material genético é purificar o DNA ou o
RNA da célula microbiana a ser trabalhada.
Lise: rompimento da célula para expor o DNA;
Ligação: uma membrana de sílica retém e
concentra o DNA;
Lavagem: quebrar e emulsionar os lipídeos e as
proteínas que formam a membrana da célula, por
meio de soluções detergentes e centrifugação; e
Eluição: DNA purificado pronto para ser utilizado
em diferentes aplicações
Em regra, a extração do material genético segue um
processo:
PCRPCR
Obs.: Em uma reação de PCR, primeiro é
necessário saber quem é o foco da pesquisa e,
também, qual é a sequência gênica da 
 bactéria para identificar qual é a sequência
específica que se busca.
Obs.: Vale lembrar que essa amplificação é de
natureza exponencial.
Polimerase Chain Reaction: amplificação gênica 
 enzimática de pequenos fragmentos de DNA
predeterminados e específicos de um determinado
organismo.
Potencial de amplificação: de um fragmento de DNA
(um gene) até cerca de um milhão de cópias.
Uma vez amplificada, a sequência de nucleotídeos 
 poderá ser detectada por eletroforese em gel de
poliacrilamida.
Obs.: É importante perceber que o RNA não possui
timina, pois em seu lugar está presente a uracila.
A enzima DNA polimerase consegue produzir uma
cópia idêntica da sequência de nucleotídeos de uma
célula. Para isso, ela precisa do molde (fita de DNA) e
de uma região de iniciação com OH livre (primer).
Vale lembrar que os vírus de RNA precisam da
transcriptase reversa para gerar uma cadeia de DNA
compatível para que, então, a DNA polimerase consiga
agir.
PCR aplicada a microbiologiaPCR aplicada a microbiologia
As técnicas de PCR utilizam iniciadores (primers) 
 para um gene específico do patógeno para analisar
amostras de DNA derivadas de tecidos infectados
suspeitos, mesmo na ausência de um agente
patogênico cultivável e observável → elevada
sensibilidade e especificidade.
Obs.: Nesse sentido, essa elevada sensibilidade 
 significa que o sinal pode ser elevado inúmeras 
 vezes. Ou seja, de uma cópia é possível chegar a 
 um milhão de cópias.
Além disso, também é grande a especificidade, pois, 
 ao utilizar um primer, somente é possível se ligar a um
ponto certo por complementariedade das bases.
Ensaios baseados em PCR são amplamente utilizados
para a identificação de patógenos.
DesnaturaçãoDesnaturação
Não dependem do isolamento ou crescimento do
patógeno, mas apenas do fato de o patógeno
estar presente na amostra, mesmo que em
baixíssimas quantidades;
Não dependem da detecção de resposta imune
contra o agente.
Padrão-ouro para algumas doenças infecciosas →
particularmente úteis na identificação de infecções
virais ou intracelulares, em que a cultura dos agentes
causadores pode ser muito difícil ou até mesmo
impossível. Exemplo: Chlamydia trachomatis e Neisseria
gonorrhoeae em amostras de urina, em casos clínicos
de DSTs.
Os métodos de biologia molecular:
Assim, serão detectados nos ensaios as sequências de
ácidos nucleicos espécie-específicas.
A técnica de PCR é composta de três etapas:
O DNA genômico, previamente extraído da amostra a
ser analisada, contendo a sequência de interesse para 
 amplificação, é aquecido acima de 94ºC por cerca de 30
segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada),
tornando-se uma fita única (ou duas fitas únicas)
Obs.: A temperatura do processo de desnaturação é
bastante cobrada em provas de concursos públicos.
Assim, vale lembrar que ele deve ocorrer em
temperaturas acima de 94ºC
Anelamento ou hibridizaçãoAnelamento ou hibridização
Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou
primers (uma pequena fita de DNA específica para o 
 gene que se quer estudar, ou seja, um oligonucleotídeo
curto) complementam a fita oposta da sequência de
DNA a ser amplificada.
Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma
fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar
à sequência na outra fita.
O molde é determinado pela posição dos iniciadores
que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma
temperatura de 60ºC (varia de acordo com o primer
utilizado).
Extensão ou PolimerizaçãoExtensão ou Polimerização
Com o molde já identificado, a enzima Taq-DNA-
polimerase adiciona as bases complementares, 
 formando uma nova fita e então tem-se novamente a 
 duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a
uma temperatura de 72ºC.
Ciclo é reiniciado → os produtos do primeiro ciclo de
replicação são desnaturados, hibridizados e novamente
replicados com DNA-polimerase. O procedimento é
repetido de 20 a 30 vezes até que o nível desejado de
amplificação seja obtido.
Visualmente, a amplificação do material nucléico por
meio do método PCR ocorre da seguinte maneira:
medicina forense;
carga viral;
diagnóstico de agentes infecciosos; ou
paternidade.
Aplicações: situações nas quais a quantidade de DNA
disponível é reduzida. Exemplos:
EletroforeseEletroforese
carga partícula;
tamanho partícula;
forma partícula;
intensidade campo elétrico (quanto maior a
intensidade, mais rápida será a migração dessas
moléculas).
Feita a amplificação do material genético por meio da
técnica de PCR, o próximo passo é visualizá-lo para 
 identificar esse material genético. Para isso, utiliza-se 
 a técnica de eletroforese.
A eletroforese é a migração de partículas carregadas 
 em um solvente condutor, sob a influência de um 
 campo elétrico = separação de fragmentos de DNA de 
 acordo com seu tamanho.
A eletroforese depende basicamente dos seguintes
elementos:
Dessa forma, a eletroforese separa moléculas comcargas diferentes e/ou moléculas com mesma carga,
mas diferentes pesos moleculares. Esse último caso é o
mais utilizado em biologia molecular.
Assim, é possível realizar a separação de fragmentos de
DNA de acordo com seu tamanho. Exemplo:
Obs.: o termociclador é um aparelho que 
 consegue gerenciar a quantidade de ciclos de
forma automática, isso por meio da realização de 
 mudanças de temperatura muito rápidas.
Vale lembrar que a primeira etapa é a de Desnaturação
e nela ocorre a aplicação de altas temperaturas (acima
de 94ºC) para separar as fitas do DNA.
A segunda etapa é a de hibridização ou anelamento. Já
a terceira etapa é a de Extensão ou Polimerização.
Ao final de um ciclo, de uma molécula de DNA fita
dupla é possível obter duas moléculas de DNA fita
dupla. Assim, na medida em que são repetidos os ciclos,
o aumento dessas moléculas de DNA dupla fita se faz 
de modo exponencial, podendo chegar, ao final de 
 30 ciclos, a mais de um milhão de moléculas.
Como cada etapa da reação ocorre em uma 
 temperatura específica, a reação pode ser
controlada.
Todos os reagentes necessários são adicionados a um 
 tubo, o qual é colocado em um termociclador, que
determina o número de ciclos, a temperatura e o
tempo de cada etapa.
O uso do termociclador é possível devido à utilização de
uma DNA-polimerase extraída de uma bactéria
termfila (Thermus aquaticus) = a enzima desses
organismos pode sobreviver à fase de aquecimento
sem ser destruída. 
PCR em tempo real (qPCR, PCR quantitativo ou PCR real
time): emprega termocicladores que, além de
ampliflcar o DNA, permitem a sua detecção, já que o 
 DNA recém-formado é marcado com um corante
fluorescente = níveis de fluorescência podem ser
mensurados após cada ciclo de PCR.
Moléculas com cargas diferentes:
Ao aplicar as moléculas no centro do gel de
eletroforese e ao aplicar uma carga elétrica nesse
material de forma que um polo fique carregado
positivamente e o outro polo fique carregado
negativamente, quando essas moléculas começarem a
migrar, aquelas que possuem uma carga elétrica 
 negativa (ânion) são atraídas pelo polo positivo. Ao 
 mesmo passo, as moléculas carregadas positivamente
(cátion) são atraídas para o polo negativo. Esse polo
positivo é denominado ânodo e o polo negativo é
denominado cátodo.
Moléculas com mesma carga:
Nesse caso, uma amostra é composta por uma mistura
de vários fragmentos de DNA de tamanhos diferentes.
Se todos estão carregados positivamente, quando o
campo elétrico começar a agir, essas moléculas
tendem a migrar para a região do cátodo. No entanto,
como o gel de eletroforese não permite uma migração
livre, pois oferece uma resistência, quanto maior for o
tamanho da molécula, menos ela conseguirá se mover
nesse gel e mais próxima ela permanecerá do ponto
inicial de aplicação. Dessa forma, é possível identificar
as moléculas presentes na amostra.
Gel de agarose/poliacrilamida: forma uma rede que 
 prende as moléculas durante a migração.
Agarose: separa moléculas maiores (DNA, RNA,
hemoglobina e lipoproteínas).
Poliacrilamida: separa moléculas menores (proteínas).
Obs.: quanto maior a concentração do polímero, mais
estreitas ficam as malhas.
Tampão de eletroforese: solução ionizada para 
 facilitar a transferência de corrente elétrica.
Corante: Se ligam à molécula permitindo visualizar 
 o resultado da corrida sob a luz ultravioleta.
Exemplo:
A detecção do produto de amplificação (amplicon) 
 normalmente é feita em eletroforese em gel de
agarose, corado com brometo de etídio, permitindo 
 a visualização do DNA em transluminador de luz UV
As amostras de DNA são depositadas nos poços em 
uma das extremidades do gel, e uma corrente
elétrica é aplicada para fazê-las avançar.
O objetivo dessa detecção pode ser totalmente
qualitativo, ou seja, dizer se uma bactéria está presente
ou ausente na amostra. No entanto, por meio da
eletroforese é possível saber quais bactérias estão
presentes no material que se está estudando.
Os fragmentos DNA estão carregados 
 negativamente, então movem-se na direção do
ânodo. Mesma carga por massa, logo os 
 fragmentos menores atravessam o gel mais 
 rapidamente do que os maiores.
Gel é pigmentado com corante que se liga ao DNA =
fragmentos podem ser vistos como bandas, após
revelação com brometo de etídio, cada uma
representando um grupo de fragmentos de DNA de
mesmo tamanho.
O EtBr penetra (intercala ) entre as bases de DNA e 
 fluoresce quando exposto à luz UV, produzindo
bandas brilhantes no gel:
Assim, é possível submeter uma amostra de material
biológico ao método PCR, com um primer específico
para uma determinada bactéria que se deseja
pesquisar. Assim, se após a PCR e a eletroforese, se
estiver presente o fragmento com tamanho 
 compatível catalogado dessa bactéria, então o
resultado da reação será positivo.
Testes de amplificação deTestes de amplificação de
ácidos nucléicosácidos nucléicos
HIV: de 19-22 dias para 10 dias com o uso do NATT;
HCV: de 60 dias para 11 dias com o uso do NATT. 
Teste de amplificação de ácidos nucleicos (do inglês
Nucleic Acid Amplification Test – NAAT): amplificação
do RNA ou DNA de vírus e bactérias por PCR, que a
partir de pequena quantidade de cópias de ácido 
 nucléico consegue detectar mais precocemente a 
 presença do agente infeccioso.
Uso mais comum: bolsas de sangue destinadas à
transfusão.
Objetivo: diminuir o período de janela imunológica 
 (período compreendido entre o contato com o 
 antígeno hemotransmissível e a produção de 
 anticorpos em níveis detectáveis pelos testes
sorológicos atuais).
Exemplos:
Em microbiologia: detecção de sequências 
 específicas de DNA ou RNA de C. trachomatis e N.
gonorrhoeae = métodos alternativos à cultura, mais 
 sensíveis e promissores, na identificação destes
microrganismos.
Obtém-se uma imagem através de autoradiografia ou
autofluorescência.
Northern Blot
Feito para detecção de uma sequência de RNA 
 específica, demonstrando a expressão de um
determinado gene de interesse.
Corrida de RNA desnaturado (formaldeído) em gel de
agarose 
O RNA é transferido do gel para uma membrana de
nitrocelulose por blotting.
Aplicação de sonda que se hibridiza com o RNA 
 (fragmento de DNA com sequência complementar à
sequência particular do RNA alvo, e que possui um
marcador, radioativo ou fluorescente).
Obtém-se uma imagem através de autoradiografia ou
autofluorescência
Obs.: em prova, uma maneira de lembrar a
diferença entre Southern Blot e Northern Blot é
utilizar o seguinte mnemônico: “Northern tem
duas letras ‘r ’, logo, se refere a DNA, já Southern
só tem uma letra ‘r ’, logo, se refere a DNA”
Na língua inglesa, o termo blotting significa “mancha”
ou “borrão”. As técnicas de blotting se dividem em três:
Southern Blot: técnica de Biologia Molecular para
detecção de uma sequência de DNA específica (gene
de interesse) em uma amostra que contém uma
mistura complexa (genoma inteiro de um organismo). 
Criada pelo biólogo britânico Edwin Southern. 
 Verifica apenas a presença do gene.
Northern Blot: técnica de Biologia Molecular que 
 visa estudar a expressão gênica, ou seja, verificar se 
 um determinado gene de um genoma é ou não
transcrito em RNA e quantificar esta transcrição. 
 Nome da técnica deriva da similaridade 
 metodológica em relação ao Southern Blot com a 
 diferença chave de que, em vez de DNA, a 
 substância analisada por eletroforese com uma
sonda hibridizadora é o RNA.
Western Blot: técnica de Biologia Molecular e 
 bioquímica para detectar proteínas em um material 
biológico. A técnica utiliza a eletroforese em gel 
 para separar as proteínas desnaturadas.
Southern Blot: Detecção de uma sequência deDNA
específica; Corrida de DNA fragmentado em gel de
agarose.
O processo funciona como se fosse um carimbo. Ou
seja, o DNA é transferido do gel para uma membrana
de nitrocelulose por blotting.
Aplicação de sonda que se hibridiza com o DNA 
 (fragmento de DNA com sequência complementar à
sequência particular do DNA alvo, e que possui um
marcador, radioativo ou fluorescente).
Técnicas de blottingTécnicas de blotting
Imagem ilustrativa que mostra a comparação entre os
processos: