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Lista de exercícios NOME: TURMA: 1 – {12 MUTAÇÃO E MECANISMOS DE REPARO DE DNA 1) Uma globina de 146 aminoácidos sofreu uma mutação no códon correspondente ao sexto aminoácido da cadeia. A análise do DNA indicou uma mudança de (5')TTC(3') para (5')TAC(3') na fita molde. Pergunta-se: a. A mutação provocou a troca de um aminoácido por outro? Em caso afirmativo, qual é este aminoácido? Resposta: Sim. Veja abaixo: TTC: códon AAG aminoácido lisina (Lys) TAC: códon AUG aminoácido metionina (Met) b. Quais as implicações para a estrutura da proteína? Resposta: A molécula de proteína apresenta dobramentos e enrolamentos determinados por atrações químicas entre os aminoácidos, o que confere às proteínas formas tridimensionais que corresponderão às estruturas secundárias e terciárias. Desta forma, a estrutura da proteína depende da sua sequência de aminoácidos, que é determinada geneticamente. Assim, mutações como esta que promovem a substituição de um aminoácido hidrofílico básico (lisina) por outro hidrofóbico (metionina) podem provocar alterações na estrutura tridimensional da proteína e, consequentemente, na sua função (veja a classificação dos aminoácidos quanto à cadeia lateral, no final desta parte). c. Qual seria o resultado se a mesma troca ocorresse na base do lado (5') do DNA? Resposta: Se a mutação ocorresse na base do lado 5’, alteraria para ATC. O códon correspondente seria UAC, codificando o aminoácido tirosina (Tyr). 2) Considere a sequência abaixo como parte de um mRNA eucariótico. O primeiro nucleotídeo do primeiro códon a ser traduzido está sublinhado e representa a posição +1 da tradução. Este tripleto determina a fase de leitura. +1 +4 +34 5’...AUG CCU CUA GGA AUG AAA GGG UCA UUA CCC CAA UAA CUA AUU UAG...3’ Pergunta-se: a. Qual a sequência do peptídeo codificado por esse mRNA? Resposta: Met – Pro – Leu – Gly – Met – Lys – Gly – Ser – Leu – Pro – Gln, pois o códon UAA é um códon de parada. b. Qual seria a sequência do peptídeo se o nucleotídeo +1 fosse substituído por “U”? Resposta: Esta mutação promoveria a substituição de Met (metionina) por Leu (leucina). A presença do códon de iniciação (AUG) é extremamente importante, pois fornece o quadro de leitura em que o mRNA será traduzido. Em eucariontes, o códon iniciador AUG (correspondente à metionina) mais próximo da extremidade 5' de um mRNA é geralmente o sinal de início para a síntese de proteínas. Se o ribossomo não identificar o primeiro AUG na sequência, ele poderá seguir até o segundo ou o terceiro. Isto produz proteínas diferentes a partir de um único transcrito, em geral com o mesmo quadro de leitura, mas sem os primeiros aminoácidos, e provavelmente, sem função biológica. Desta forma, a sequência do peptídeo seria: Met – Lys – Gly – Ser – Leu – Pro – Gln (ficaria sem os primeiros 4 aminoácidos). c. Qual seria a sequência do peptídeo se o nucleotídeo +34 fosse substituído por “A”? (duplo sublinhado) Resposta: Met – Pro – Leu – Gly – Met – Lys – Gly – Ser – Leu – Pro – Gln – Lys – Leu – Ile, pois o 15º códon é um códon de parada (UAG). d. Qual seria a sequência do polipeptídeo se houvesse a deleção do nucleotídeo da posição +4? (sublinhado tracejado) Resposta: Mudaria todo o quadro de leitura a partir da deleção, havendo a incorporação de apenas 2 aminoácidos, pois o novo terceiro códon (UAG) é um códon de parada. Veja abaixo. Assim, seria produzido um dipeptídeo ao invés de um polipeptídeo, provavelmente sem função biológica. +1 +4 5’...AUG CCU C UA G GA A UG A AA G GG U CA U UA C CC C AA U AA C UA A UU UAG...3’ Met – Leu – stop códon (parada) 3) A manutenção da estabilidade genética necessita não apenas de um mecanismo extremamente preciso para replicação do DNA, antes da célula se dividir, mas também de mecanismos para reparação das muitas lesões acidentais que ocorrem espontaneamente no DNA. Sobre o tema, responda: EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 2 – {12 a) Cite e explique três causas dessas lesões espontâneas que ocorrem no DNA. Reposta: 1- pareamentos não-usuais (incorporação de nucleotídeos errados): a incorporação de nucleotídeos errados se deve ao fato de as complementaridades padrão entre as bases nitrogenadas (A com T e C com G) não serem as únicas possíveis. Com pequenas distorções na hélice do DNA podem ocorrer outros tipos de emparelhamentos, como entre G e T. 2- tautômeros: tipo de isômero resultante do deslocamento transitório de um átomo de hidrogênio. Quando a base de um nucleotídeo assume espontaneamente sua forma tautomérica, ocorre um erro de incorporação: a base resultante passa a fazer outros tipos de pontes de hidrogênio. A (imino) emparelha-se com C (enol); T (enol) emparelha-se com G. 3- desaminação espontânea de citosina a uracila: a desaminação espontânea de citosina origina uracila. Assim, caso o erro não seja corrigido, na próxima replicação do DNA, a fita com uracila (citosina desaminada) vai se parear com adenina e não com guanina. 4- oxidação de bases: bases oxidadas no DNA leva ao surgimento de mutações espontâneas. Ao longo da vida de um indivíduo, podendo contribuir para o desenvolvimento de tumores. O produto de oxidação do DNA mais extensivamente estudado é a 8-oxodG, que leva principalmente a transversões G T. b) Cite e explique o(s) mecanismo(s) de reparo usado(s) para corrigir as lesões espontâneas respondidas no item a. Reposta: 1 e 2: reparo de mal-pareamentos (Mismatch repair): o sistema de reparo percorre o DNA recentemente sintetizado à procura de pares de base mal-pareadas e remove os segmentos de fita simples contendo nucleotídeos incorretos. Isso permite que a DNA-polimerase insira a base correta na lacuna formada. Este sistema utiliza um sinal específico que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada: o reconhecimento de sequências GATC próximas ao erro. GATC metiladas indicam a fita parental, enquanto que ausência de metilação nestas sequências caracteriza a fita recém-sintetizada, que serve como alvo para a remoção de bases mal pareadas. 3 e 4: O reparo por excisão de bases repara danos decorrentes de desaminação e oxidação de bases. A remoção da base defeituosa é feita pela clivagem da ligação base nitrogenada-desoxirribose, gerando uma extremidade 3’-OH que permite o preenchimento da região com a base correta por ação da DNA-polimerase. A integridade da fita corrigida é restaurada pela DNA-ligase. 3) Apesar de as mutações gênicas serem de extrema importância para a evolução de uma espécie, a sobrevivência do indivíduo depende da estabilidade do seu genoma. A estabilidade resulta não só de um acurado mecanismo de replicação, como também de mecanismos que reparem os danos que ocorrem continuadamente no DNA. Muitos danos sofridos pelo DNA podem ser reparados porque a informação genética é preservada em ambas as fitas da dupla-hélice, de tal forma que a informação perdida em uma fita possa ser recuperada por meio da fita complementar. Em relação ao tema, julgue os itens, marcando V para os verdadeiros e F para os falsos. Justifique os itens falsos. F (1) As mutações podem ocorrer tanto em células somáticas quanto em células germinativas, mas apenas as mutações somáticas são importantes na promoção da variabilidade genética e evolução das espécies. Apenas as mutações germinativas são herdáveis e, portanto, são as que contribuem para a variabilidade genética e evolução das espécies. F (2) Tanto as mutações espontâneas decorrentes de erro de incorporação de bases ou tautômeros quanto as mutações induzidas por agentes alquilantes provocam distorções na molécula de DNA, sendo, portanto, corrigidas pelo sistema reparo por excisão de nucleotídeos. Enquanto as mutações espontâneas decorrentes de erro de incorporação de bases ou tautômeros são principalmente reparadas pela via de reparo de pareamento errôneo (mismatch repair), as mutações induzidas por agentes alquilantes podem ser reparadas pelos mecanismosde excisão de bases ou via direta pelas enzimas O6- metil-guanina metiltransferase e O4-metil-timina metiltransferase. F (3) Entre os agentes mutagênicos de natureza física encontram-se as radiações não-ionizantes, que são capazes de provocar deleção de bases e quebras de fita simples e dupla na cadeia de DNA, estando associadas ao câncer de pele. As radiações não-ionizantes (ex.: raios UV) promovem a formação de dímeros de pirimidina, estando associadas ao câncer de pele. As radiações que provocam deleção de bases e quebras de fita simples e dupla na cadeia de DNA são as radiações ionizantes (ex.: raios X). V (4) Danos decorrentes de oxidação, alquilação, hidrólise ou desaminação são reparados pelo mecanismo de excisão de bases. F(5) Se durante a replicação do DNA humano uma forquilha de replicação encontra uma lesão (por exemplo um dímero de timina), antes da ação do reparo direto pelo sistema da fotoliase, a DNA polimerase irá parar a replicação no dímero encontrado, sendo esta região reparada por recombinação. Em humanos e demais mamíferos placentários não existe o sistema de reparo direto pela fotoliase (fotorreativação), sendo esta parte do reparo feita por excisão de nucleotídeos. V (6) No processo de reparo de bases mal pareadas, existe um sinal específico que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada: o reconhecimento de adeninas não-metiladas em sequências GATC nesta fita recém-sintetizada que estão metiladas na fita parental. EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 3 – {12 V (7) No processo de reparo por excisão de bases ocorre a remoção da base defeituosa por clivagem da ligação base nitrogenada-desoxirribose, seguida pelo preenchimento da região com a base correta por ação da DNA polimerase. 5) Sabe-se que a taxa de mutação espontânea na replicação do DNA é de aproximadamente 10 7, mas, em Escherichia coli, esta taxa é de 10 10 devido ao monitoramento pelo sistema de reparo, principalmente através da correção dos pareamentos errôneos (mal pareamentos ou mismatch repair) após a replicação. Em relação ao tema, responda: a) Por que se não houvesse a marcação do DNA velho com grupos metila, não seria possível o reparo de mal pareamentos? Resposta: Na E. coli, a metilação na posição N6 da adenina nos sítios GATC permite a diferenciação entre a fita molde (metilada) e a fita recém-sintetizada (não-metilada), durante um curto período no qual a fita nova ainda não foi metilada. Durante o período que antecede a metilação, a fita não-metilada é o alvo para a remoção de bases mal pareadas. b) O que seria esperado de acontecer se o DNA, em um teste in vitro, fosse exposto a enzimas do sistema de reparo de pareamentos errôneos em um DNA que apresentasse: b.1) ambas as fitas metiladas em uma sequência GATC? Resposta: Se ambas as fitas fossem metiladas em uma sequencia GATC, os mal pareamentos não seriam reparados porque o complexo de reparo não reconheceria a fita recém-sintetizada. b.2) nenhuma fita metilada? Resposta: Se nenhuma fita estivesse metilada haveria o reparo, mas este não seria específico para nenhuma fita de DNA, pois o sistema não conseguiria distinguir qual das bases seria a incorreta, já que não se identificaria uma fita molde para comparação da sequencia. Sendo assim, haveria a probabilidade de 50% de a base correta ser removida e a mutação poderia ser perpetuada, ao invés de ser corrigida. 6) Descreva os principais passos das seguintes vias de reparo do DNA: a) reparo direto Resposta: 1) Dímeros de pirimidina podem ser reparados diretamente por uma enzima chamada DNA fotoliase, que usa a energia da luz visível absorvida para regenerar as duas pirimidinas que sofreram dimerização por indução de radiação UV. A enzima fotoliase tem dois cromóforos que captam um fóton, cuja energia é utilizada para reverter o dímero, ou seja, quebrar a ligação covalente entre as pirimidinas, resultando na estrutura molecular original do DNA. 2) A base nitrogenada primariamente afetada pelos agentes alquilantes é a guanina, embora a timina também possa ser alquilada. As enzimas que exercem a atividade de alquiltransferase captam os grupos alquil das bases alquiladas para resíduos de cisteína de sua molécula, em um mecanismo suicida. É um mecanismo extremamente específico, mas dispendioso, já que a molécula da enzima não é regenerada após sua atividade de transferência dos grupos alquil. Em Escherichia coli, as principais enimas são a O6-metil-guanina metiltransferase e a O4-metil-timina metiltransferase, cujos ortólogos (genes homólogos) existem em várias outras bactérias e eucariontes. b) reparo de pareamento errôneo (mismatch repair) Resposta: o sistema de reparo percorre o DNA recentemente sintetizado à procura de pares de base mal pareadas e remove os segmentos de fita simples contendo nucleotídeos incorretos. Isso permite que a DNA polimerase insira a base correta na lacuna formada. Este sistema utiliza um sinal específico que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada: o reconhecimento de sequências GATC próximas ao erro. GATC metiladas indicam a fita parental, enquanto que ausência de metilação nestas sequências caracteriza a fita recém-sintetizada, que serve como alvo para a remoção de bases mal pareadas. c) reparo por excisão de bases (BER, do inglês base excision repair) Resposta: a remoção da base defeituosa é feita pela clivagem da ligação base nitrogenada-desoxirribose, gerando uma extremidade 3’-OH que permite o preenchimento da região com a base correta por ação da DNA polimerase. Um exemplo comum de reparo por excisão de base é o que acontece na correção da desaminação da citosina à uracila. O sistema de reparação reconhece a uracila como uma base estranha ao DNA. Primeiramente, a uracila-DNA- glicosilase hidrolisa a ligação entre a uracila e a molécula de desoxirribose. Nesse estágio, a cadeia de DNA está intacta, mas a base é perdida. A enzima AP-endonuclease reconhece, então, essa fenda e cliva a cadeia em regiões adjacentes à base perdida. A DNA polimerase insere novamente uma citosina, de acordo com a orientação fornecida pela fita complementar não-danificada, que contém uma guanina. Finalmente, a integridade da fita corrigida é restaurada pela DNA-ligase. Existem outras glicosilases que reconhecem e removem hipoxantina, 3-metil-adenina e purinas com anel imidazol aberto por radiação ionizante ou pH elevado. d) reparo por excisão de nucleotídeos (NER, do inglês nucleotide excision repair) Resposta: a remoção da base defeituosa é feita pela incisão endonucleolítica nos dois lados da lesão, com liberação dos nucleotídeos, seguida pelo preenchimento da região por ação da DNA polimerase. Em todos os organismos onde já foi estudado, o processo de reparo por excisão de nucleotídeos consiste em cinco etapas: EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 4 – {12 1. Reconhecimento da lesão por um complexo multienzimático. 2. Incisão da fita anormal em ambos os lados da lesão a alguma distância desta. 3. Excisão do segmento contendo a lesão. 4. Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde, por ação da DNA polimerase. 5. Ligação/restauração da molécula de DNA por ação da enzima DNA-ligase. A extensão média do fragmento de DNA removido é de 12 nucleotídeos. e) reparo por recombinação homóloga Resposta: resulta na recombinação entre duas regiões de cromossomos homólogos, de modo que a informação genética perdida pela quebra de fita dupla de um dos cromossomos homólogos é restaurada pela transferência da sequência de uma das fitas parentais do cromossomo íntegro para o sítio de quebra do cromossomo lesado. Consiste em três etapas principais: (1) corte de uma das fitas parentais e deslocamento da fita cortada; (2) a fita deslocada invade a outra molécula parental; e (3) clivagem da alça e pareamento com a primeira molécula parental. 7) Quais são os principais tipos de danos no DNA reparados por cada uma das seguintes vias: (a) fotorreativação,(b) reparo por excisão de bases, (c) reparo por excisão de nucleotídeos, (d) reparo de pareamento errôneo (mismatch repair)? Resposta: (a) dímeros de pirimidina são o único tipo de dano reparado por fotorreativação (ausente em mamíferos placentários) (b) bases danificadas por oxidação, alquilação, hidrólise ou desaminação (c) dímeros de pirimidina (em mamíferos placentários) e quaisquer danos que envolvam distorções espaciais na molécula de DNA (d) erros na replicação (erros de incorporação de bases durante a replicação do DNA) 8) A maioria dos tipos de reparo do DNA depende da presença de uma cópia separada de informação genética em cada uma das duas fitas presentes na dupla fita do DNA, onde os mecanismos capazes de corrigir uma lesão acidental em uma das fitas têm como referência a informação contida na fita não-danificada. Entretanto, danos perigosos ao DNA, tais como aqueles causados por radiação ionizante e agentes oxidantes, resultam na quebra das duas fitas de DNA, inviabilizando os mecanismos de reparo mencionados acima. Quais são os mecanismos celulares de reparo utilizados para resolver este problema? Diferencie-os. Resposta: Reparo por recombinação homóloga e reparo por junção de extremidades não-homólogas. Reparo por recombinação homóloga: resulta na recombinação entre duas regiões de cromossomos homólogos, de modo que a informação genética perdida pela quebra de fita dupla de um dos cromossomos homólogos é restaurada pela transferência da sequência de uma das fitas parentais do cromossomo íntegro para o sítio de quebra do cromossomo lesado. Reparo por junção de extremidades não-homólogas: principal mecanismo de reparação de quebras de fita dupla em mamíferos. Neste mecanismo, as extremidades de uma molécula de DNA, apesar de terem perdido alguns nucleotídeos, são justapostas para recombinar. O mesmo complexo enzimático realiza o processo de ligação entre as duas extremidades. Desta forma, a sequência original de DNA acaba sendo alterada. 9) Descreva brevemente as etapas envolvidas no reparo do DNA de mamíferos, lesado por luz UV, e as enzimas nelas envolvidas. Resposta: 1. Ocorre reconhecimento da lesão por um complexo multienzimático. 2. Helicases percorrem a hélice e desnaturam o DNA (desenovelam a dupla hélice e separam as duas fitas) no local da lesão. 3. Endonucleases fazem uma dupla incisão na cadeia em ambos os lados da lesão e a alguma distância desta. 4. O oligonucleotídeo contendo a lesão (~12 nucleotídeos) é removido e ocorre a síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde, por ação da DNA polimerase. 5. A DNA-ligase realiza a ligação da extremidade 5’ da região recém-sintetizada à sequencia original. Ou 1. As proteínas XPB, XPD e XPA estão envolvidas na detecção da lesão, sendo que as duas primeiras percorrem a hélice e a segunda reconhece a lesão. 2. Após encontrar a lesão, o DNA do local do dano é desnaturado (helicase) e as endonucleases XPF e XPG fazem a dupla incisão na cadeia. 3. O oligonucleotídeo contendo a lesão é removido e ocorre ressíntese do DNA utilizando a fita não-danificada como molde. 5. Ligação da extremidade 5’ da região recém-sintetizada à sequencia original pela DNA-ligase. 10) Qual a diferença entre os mecanismos de reparo por excisão de base e por excisão de nucleotídeos? Resposta: No mecanismo de reparo por excisão de base, a glicosilase reconhece a base trocada e retira quebrando a ligação glicosídica entre a base e a ribose. Gera-se um sítio abásico, que é substrato para a AP-endonuclease. A DNA polimerase I e a DNA ligase finalizam o reparo. Já no mecanismo de reparo por excisão de nucleotídeos, ocorre reconhecimento da lesão por um complexo multienzimático, retirada de nucleotídeos em bloco a partir da incisão da EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 5 – {12 fita anormal em ambos os lados e a alguma distância da lesão, seguida pela síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde, por ação da DNA polimerase. A DNA ligase finaliza o reparo. 11) No momento da replicação de um gene, houve um pareamento de bases errado. Como o sistema de reparo de pareamentos errôneos (mismatch repair) reconhece a fita a ser reparada? Explique o mecanismo de reparo. Resposta: O pareamento errado provoca uma distorção estrutural na molécula de DNA. O sistema mismatch repair reconhece a fita nova devido a esta não estar metilada. Ocorre uma excisão na fita nova e uma exonuclease degrada parte desta fita, logo em seguida uma DNA polimerase reconstitui a parte da fita que foi degradada fazendo o pareamento correto. 12) A ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) normalizou, recentemente, a utilização de câmaras de bronzeamento artificial, visando diminuir os riscos dessa prática, tais como lesões na retina, queimaduras, envelhecimento precoce e câncer de pele. Uma mulher que se submeteu a dez sessões intercaladas de bronzeamento, com duração de 15 a 30 minutos cada uma, apresentou, quatro meses depois, indícios de câncer de pele, uma vez que as radiações UV danificaram seu DNA. a) Em relação ao tema e conhecimentos correlatos, marque V para os itens verdadeiros e F para os falsos. Justifique os itens falsos. F (1) As radiações UV são radiações não-ionizantes que são capazes de provocar deleção de bases e quebras de fita simples e dupla na cadeia de DNA, estando por isto associadas ao câncer de pele. As radiações não-ionizantes (ex.: raios UV) promovem a formação de dímeros de pirimidina, estando associadas ao câncer de pele. As radiações que provocam deleção de bases e quebras de fita simples e dupla na cadeia de DNA são as radiações ionizantes (ex.: raios X). V (2) Os dímeros de pirimidina são as lesões mais frequentes associadas ao contexto do texto. V (3) O reparo das lesões relacionadas à radiação UV pode ser feito por dois tipos de mecanismos diferentes: durante a replicação do DNA, por recombinação com a fita parental não-danificada da mesma molécula de DNA; após a replicação do DNA, por excisão de nucleotídeos. V (4) Por não corrigir a lesão, o reparo pelo sistema de tolerância implicará em parada do ciclo celular no ponto de checagem G2/M. F (5) No processo de reparo de lesões causadas por UV, existe um sinal específico que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada: o reconhecimento de adeninas não-metiladas em sequências GATC nesta fita recém-sintetizada que estão metiladas na fita parental. Isto ocorre no processo de reparo de bases mal pareadas ou mismatch repair. b) O Xeroderma pigmentosum está entre os fatores de risco para o câncer de pele. Por quê? Resposta: Porque em indivíduos portadores de xeroderma pigmentosum o reparo por excisão de nucleotídeos é deficiente. Desta forma, não corrige as lesões provocadas pelos raios ultravioleta do sol. c) Em pessoas que não apresentam XP, o câncer de pele corresponde a cerca de 25% de todos os tumores malignos humanos registrados no Brasil, estando relacionado não só à exposição à radiação UV, mas também a outros fatores de risco, como exposição à radiação ionizante e a determinados agentes químicos. Entre os tipos de lesões no DNA que podem ser induzidas pelas radiações ionizantes podemos citar: (1) deleção de todo o nucleotídeo, levando à quebra de fita simples; (2) quebra de fita simples; (3) quebra de fita dupla; (4) dano em bases nitrogenadas, levando à quebra ou deleção da base. Qual delas é a mais grave e por quê? Inclua na sua resposta o(s) mecanismo(s) de reparo possível(is) e sua(s) consequência(s). Resposta: A mais grave é quebra de fita dupla, pois o reparo só pode ser feito por recombinação entre dois genes homólogos ou por junção de extremidades não-homólogas. Em ambos os casos a sequência original de DNA acaba sendo alterada. 13) O câncer de pele corresponde a cerca de 25% de todos os tumores malignos humanos registrados no Brasil, estando relacionado a alguns fatores ambientais de risco como exposição a químicos (arsênico), radiação ionizante e principalmente aos raios ultravioletas(UV) do sol. Em relação ao abordado tema, responda: 8) Que tipos de lesões no DNA podem ser induzidas pelas radiações ionizantes? Qual delas é a mais grave e por que? (Inclua na sua resposta o mecanismo de reparo possível e qual a sua consequência). Resposta: Deleção de todo o nucleotídeo, levando à quebra de fita simples; quebras de fita simples e de fita dupla; dano em bases nitrogenadas, levando a quebra ou deleção da base. (Pode também ser aceito: quebras de fita simples e de fita dupla, dano em bases nitrogenadas). Mais grave: quebra de fita dupla, pois o reparo só pode ser feito por recombinação (entre dois genes homólogos ou por junção de extremidades não-homólogas). Em ambos os casos a sequencia original de DNA acaba sendo alterada. b) Que tipo de lesão mais frequente no DNA está relacionada ao trecho grifado? Por que esta lesão é facilmente percebida pelo sistema de reparo? EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 6 – {12 Resposta: Dímero de timina (ou dímero de pirimidina). Porque promove distorções espaciais na molécula de DNA. c) Considerando a lesão do item b, o reparo pode ser feito por dois tipos de mecanismos diferentes, dependendo se ele ocorre depois ou durante a replicação do DNA. Cite os dois tipos de mecanismos e compare-os quanto à correção da lesão? Resposta: Durante a replicação: reparo por recombinação com a fita parental não-danificada da mesma molécula de DNA (sistema de tolerância). Após a replicação: excisão de nucleotídeos. OBS.: O reparo por recombinação não remove a lesão, apenas possibilita a continuidade da replicação. Assim, é necessário que o sistema de reparo conserte posteriormente a lesão por excisão de nucleotídeos. d) Qual dos mecanismos de reparo do item c implicaria em parada do ciclo celular no ponto de checagem? Tal ponto de checagem estaria localizado na transição entre quais fases do ciclo celular? Resposta: O reparo por recombinação com a fita parental não-danificada da mesma molécula de DNA. Por não corrigir a lesão, implicaria em parada do ciclo celular na transição G2/M. REGULAÇÃO GÊNICA: PROCARIOTOS 8) Em Escherichia coli o operon da lactose compreende 3 genes estruturais: lac Z, lac Y e lac A, cujos produtos estão envolvidos no metabolismo da lactose. O gene lac I codifica um repressor e a lactose funciona como um indutor do sistema. Descreva a sequência de processos: 8) Na ausência de lactose. Resposta: O operon permanece inativado porque a proteína repressora, sintetizada pelo gene regulador (repressor), se liga ao sítio operador, inibindo o promotor. Isto impede o acoplamento da RNA polimerase, e deste modo, não há transcrição nem tradução. b) Na presença de lactose. Resposta: Se a lactose está presente, ela estabelece um complexo com a proteína reguladora, inativando-a. Esta perde, então, a capacidade de se ligar ao operador, liberando assim o promotor, o que faz com que haja transcrição e tradução. c) Na presença de glicose no meio celular. Resposta: Com a presença de glicose, o operon lac não será ativado e não haverá produção das enzimas - galactosidase, permease e transacetilase pelos genes estruturais lac Z, lac Y e lac A, respectivamente. 2) Pesquise sobre o operon trp (triptofano) e, considerando os operons lac e trp como modelos de indução e repressão, respectivamente, responda: 8) Porque o mecanismo do triptofano é dito negativo e o da lactose é dito positivo? Resposta: Porque o operon estará ativado na presença de lactose e desativado na presença de triptofano, ou seja, a lactose é indutora e o triptofano é um repressor. b) Descreva a condição mais frequente de cada uma desses operons. Resposta: lac – O operon permanece inativado porque a proteína repressora, sintetizada pelo gene regulador, se liga ao sítio operador, inibindo o promotor. Isto impede o acoplamento da RNA polimerase, e deste modo, não há transcrição nem tradução. Trp – A proteína reguladora é inativa, não sendo capaz de se ligar ao sitio operador do operon. Assim, a RNA polimerase acopla-se ao promotor, ocorrendo transcrição e tradução. c) Descreva as alterações ocorridas quando moléculas efetoras estão presentes. Resposta: lac – Se a lactose está presente, estabelece um complexo com a proteína reguladora, inativando-a. Esta perde a capacidade de se ligar ao operador, liberando assim o promotor, o que faz com que haja transcrição e tradução. Trp – O triptofano age como co-repressor que se liga ao repressor ativando-o. O complexo repressor/co-repressor ocupa o sítio operador, inibindo o promotor, que não aceita a ligação da RNA polimerase. Não há tradução nem transcrição. 3) Diferencie repressores e indutores. Resposta: Repressor – é uma proteína sintetizada pelos genes reguladores e é especifica para cada operon. A sua função e ligar-se ao sítio operador inibindo a expressão do operon. EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 7 – {12 Indutor – é uma molécula efetora que atua nos sistemas de indução e, uma vez presente, forma um complexo com o repressor, impedindo a sua ligação ao operador. 4) Uma mutação é a alteração na sequência de nucleotídeos de um gene, de um promotor ou de um operador. Explique os efeitos de cada uma das mutações abaixo no operon lac da E. coli: 8) Mutação no operador, impedindo a ligação do repressor. Resposta: Ocorrerá a produção contínua das enzimas de metabolização da lactose, na ausência ou presença desta, gastando energia desnecessária quando a lactose não estiver presente. b) Mutação em lac I (gene regulador ou repressor), impedindo a sua transcrição. Resposta: Ocorrerá a produção contínua das enzimas de metabolização da, pois a proteína reguladora não será produzida. c) Mutação no promotor impedindo o acoplamento da RNA polimerase. Resposta: O operon da lactose não funcionará, pois não será possível ocorrer transcrição ou tradução para a produção das enzimas de metabolização da lactose. d) Mutação em lac I, inibindo o acoplamento do repressor à lactose. Resposta: O operon da lactose não funcionará, pois a proteína reguladora (repressora) estará sempre ativa, ligando- se ao operador e impedindo a ligação da RNA polimerase. e) Mutação sem sentido em lac Y. Resposta: Como a mutação sem sentido produz um códon de parada precoce, a transcrição, e consequentemente a tradução da permease (codificada pelo gene lac Y) e da transacetilase (codificada pelo gene lac A) ficarão comprometidas (término precoce), visto que o mRNA de bactérias é policistrônico (a partir do promotor todos os genes estruturais são transcritos em apenas um RNA mensageiro que dá origem, através da tradução, às três enzimas que trabalham associadas em uma via bioquímica integrada). Sendo assim, a lactose será hidrolisada em glicose e galactose (pela ação da -galactosidase, codificada pelo gene lac Z), mas a entrada da galactose na célula e sua metabolização ficarão comprometidas por falta das enzimas permease e transacetilase. f) Mutação de localização desconhecida, que impede a degradação de RNAm lac. Resposta: Acúmulo de mRNA na célula, ocorrendo produção contínua de -galactosidase, permease e transacetilase. 5) O modelo do operon, formulado por Jacob e Monod, serve para explicar a regulação gênica das enzimas que degradam a lactose em E. coli. Explique o que ocorreria se houvesse: 8) Uma mutação do tipo substituição de bases silenciosa do gene operador (O). Resposta: Os genes lac Z, lac Y e lac A continuariam se expressando, pois foi uma mutação silenciosa. Tanto o códon mutante quanto o original codificam o mesmo aminoácido, não alterando a leitura. b) Uma mutação do tipo deleção de base nos genes estruturais (lac Z, lac Y e lac A). Resposta: Ocorreria uma mudança em todo o quadro de leitura a partir da deleção de base, comprometendo assim a síntese de uma ou mais enzimas e, consequentemente, a metabolização da lactose. c) Uma mutação de sentido trocado no primeiro gene estrutural. Resposta: a lactose pode não ser degradada, pois o primeiro gene estrutural (lac Z) codifica a enzima -galactosidase, envolvida na hidrólise da lactose em glicose e galactose. 2. REGULAÇÃOGÊNICA: EUCARIOTOS 8) Os operon, que regulam eficientemente a expressão de conjuntos de genes estruturais relacionados entre si são comuns em bactérias, mas ausentes em eucariotos. Isto implica que estes não controlam a expressão de seus genes? Justifique. Resposta: Os operons são sistemas de regulação que respondem a estímulos diretos do meio externo. Sendo eficientemente tamponados contra a maioria das influencias externas os eucariotos não necessitam de mecanismos de resposta direta; por outro lado, uma vez que comportam reações metabólicas muito mais complexas, também necessitam de sistemas de regulação gênica muito mais elaborados, o que assegurados pelos chamados “circuitos pré- programados de expressão gênica”. Nestes, que comportam vários escalões de gene, a ativação sempre ocorre em cadeia, e a regulação processa-se em diversos níveis: (1) remodelamento da cromatina; (2) transcrição; (3) pós- transcrição; (5) tradução; (6) pós-tradução. EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 8 – {12 2) Que mudanças ocorrem na estrutura da cromatina e que papel essas mudanças têm na regulação gênica eucariótica? Resposta: As histonas são suscetíveis a uma grande variedade de modificações pós-traducionais, tais como acetilação, fosforilação, metilação e ubiquitinação. Enzimas como a acetiltransferase, as quinases e as metiltransferases, que depositam marcadores químicos nas histonas (acetil, fosfato e metil, respectivamente), são reguladores importantes da atividade gênica, da dinâmica dos cromossomos, da regulação do ciclo celular e da organização do genoma, pois conduzem a uma modificação da carga eletrostática das histonas alterando sua interação com o DNA e influenciando na conformação da cromatina. A metilação do DNA, isto é, a adição de grupamentos metil às suas bases (com mais frequência à citosina), também é um importante fator de regulação gênica, pois reprime a transcrição mediante inibição da ligação dos fatores de transcrição ao DNA. Há uma relação inversa entre o grau de metilação e o grau de expressão gênica, ou seja, os genes que são transcritos ativamente estão desmetilados ou com baixo nível de metilação. 3) Explique 2 funções biológicas do empacotamento da cromatina. Resposta: O material genético dos eucariontes (DNA) está organizado como uma massa compacta que ocupa um volume limitado, de maneira a permitir que as atividades sejam realizadas dentro desses limites e também acomodar transições entre os estados inativo e ativo. Desta forma, o empacotamento da cromatina tem um papel estrutural, que é o do empacotamento do DNA, e também um papel regulatório do controle do acesso da maquinaria de transcrição. A mesma fibra cromatínica pode apresentar regiões eucromáticas (ativas) contínuas com regiões heterocromáticas (inativas). Assim, o material genético é organizado de modo que diferentes estados de compactação sejam mantidos lado a lado, possibilitando a ocorrência de alterações cíclicas no nível de compactação da cromatina entre a intérfase e a divisão, e entre as diferentes fases da vida da célula. 4) A cromatina que é ativa transcricionalmente (eucromatina) tem estrutura dispersa, enquanto a cromatina que é inativa (heterocromatina) é compacta. Quando núcleos de células de galinha produzindo globina foram tratados brevemente com Dnase pancreática, os genes de globina de adultos foram seletivamente destruídos, mas os genes para globina embriônica e ovalbumina permaneceram intactos. Quando os núcleos de células de oviduto foram tratados com Dnase, os genes de ovalbumina foram destruídos. Explique estes resultados. Resposta: Nas regiões transcricionalmente ativas da cromatina, o DNA fica mais exposto à ação das DNAses, enquanto as regiões de heterocromatina, por estarem altamente condensadas e transcricionalmente inativas, estão mais protegidas da ação das DNAses. Assim, podemos inferir que nos núcleos de células de galinha os genes da globina de adultos estavam transcricionamente ativos e os genes para a globina embriônica e ovalbumina, transcricionalmente inativos e condensados, enquanto nos núcleos do oviduto, os genes de ovalbumina estavam transcricionalmente ativos. 5) Embora as células do nosso corpo possuam essencialmente os mesmos genes, explique como é que alguns só são expressos num órgão e não em todo o corpo. Resposta: Durante os processos de desenvolvimento embrionário e de diferenciação celular há alterações profundas nos padrões de expressão gênica: são ativados genes específicos e inativados muitos outros, e observa-se fundamentalmente uma remodelação dos genes em relação às regiões eucromáticas e heterocromáticas, de modo que a expressão de genes tecido-específicos irá depender do estágio de desenvolvimento e de diferenciação do organismo, do tipo celular e do metabolismo onde eles se encontram. Assim, embora as células do nosso corpo possuam essencialmente os mesmos genes, nem todos os genes são transcritos numa mesma célula. As células especializam-se em função do repertório de proteínas associadas a cada tipo de função e, embora os genes que codificam proteínas com funções gerais tais como aquelas relacionadas ao metabolismo energético, citosqueleto, polipéptidos ribossomais, histonas, etc (genes housekeeping) sejam transcritos em todos os tipos de células, a atividade dos genes tecido-específicos varia entre os diferentes tipos celulares. 6) A estrutura da cromatina é um importante ponto de regulação da expressão gênica em eucariotos. Como a estrutura da cromatina pode ser alterada? Qual o papel de modificações pós-traducionais das histonas no controle da expressão gênica de certos genes? Resposta: As histonas são suscetíveis a uma grande variedade de modificações pós-traducionais, tais como acetilação, fosforilação, metilação e ubiquitinação. Assim, enzimas como a acetiltransferase, as quinases e as metiltransferases, que depositam marcadores químicos nas histonas (acetil, fosfato e metil, respectivamente), modificam sua carga eletrostática e influenciam a conformação da cromatina por alterarem a interação das histonas com o DNA. Consequentemente, funcionam como reguladores epigenéticos (alteram a expressão gênica sem alterar a sequência de bases do DNA) importantes da atividade gênica, da dinâmica dos cromossomos, da regulação do ciclo celular e da organização do genoma. Desta forma, temos: - acetilação/desacetilação: a adição de grupamentos acetila ( COCH3) pela enzima acetiltransferase nas histonas H2A, H2B, H3 e H4 reduz a carga positiva das histonas, reduzindo sua interação eletrostática com o DNA e, consequentemente, favorecendo a transcrição. Já a remoção desses grupamentos por enzimas desacetilases aumenta a carga positiva das histonas, aumentando a interação eletrostática com o DNA e inibindo a transcrição. - metilação/desmetilação: a adição de grupamento metil ( CH3) nos resíduos de lisina e/ou arginina das histonas H3 e H4 por metiltransferases media o silenciamento da transcrição em locais de heterocromatina e afeta a regulação da transcrição em regiões de eucromatina; a desmetilaçãofavorece a transcrição gênica. EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 9 – {12 OBS.: as desacetilases podem funcionar em conjunto com metilases: se a desacetilase for inibida, a metilação não inativa os genes. - ubiquitinação: como ubiquitina é uma proteína não-histônica ácida, reduz o caráter básico das histonas H2A e H2B, levando a alterações estruturais nos nucleossomos, por reduzir sua interação eletrostática com o DNA; consequentemente, favorecendo a transcrição. Por outro lado, a ubiquitinação de H2B influencia acetilação e metilação de outras histonas para controlar a transcrição e nos telômeros, medeia o silenciamento telomérico por influenciar a metilação de H3. - fosforilação: O grupo fosfato é fortemente negativo, então sua adição induz forças na cadeia proteica que podem levar a uma radical alteração em sua conformação. Desse modo, uma proteína pode expor os aminoácidos antes escondidos em seu centro e mudar muito suas características. Por exemplo, uma proteína apolar e hidrofóbicapode se tornar polar e hidrofílica. Assim, a adição de grupamentos fosfato ( PO4) por enzimas quinases em resíduos de serina da histona H1 durante a interfase promove a descondensação cromossômica, o mesmo acontecendo com a fosforilação de H3. Porém, durante a mitose, a fosforilação adicional de H1 em resíduos de treonina conduz a uma hiper-fosforilação que leva à condensação cromossômica. 7) O livro “O Experimento”, de John Darnton, explora os mistérios microscópicos do código genético em um excelente thriller envolvendo uma misteriosa e macabra experiência científica. Em um resumo breve e sem o suspense e a emoção passados pelo livro (e já contando parte da trama), por 30 anos, uma colônia sobreviveu isolada do mundo, em uma ilha na costa americana, onde clones humanos chamados de jeminos eram abastecidos com a mais recente tecnologia genética e afastados de qualquer contato com a civilização. Os jeminos estavam sendo criados inicialmente para doação de órgãos para as matrizes, mas depois, alguns começaram a receber telomerase injetável e outros, o gene da telomerase por terapia gênica – eram as cobaias para experimentos de vida eterna (ou prolongada). Os primeiros ainda puderam se salvar com atendimento médico adequado, mas os últimos, coitados, tiveram envelhecimento precoce irreversível e morte prematura. Em relação ao tema e assuntos correlatos, julgue os itens, marcando V para os verdadeiros e F para os falsos. V (1) Os telômeros têm como função manter a integridade estrutural do cromossomo, garantindo a replicação completa das extremidades codificadoras. V (2) Uma vez que a enzima DNA polimerase só acrescenta nucleotídeos no sentido 5’ 3’ porque precisa de uma extremidade 3’OH livre da pentose para acrescentar nucleotídeos, apenas a fita de replicação contínua do DNA será completamente replicada. F (3) O sistema biológico coordenado pela telomerase gera a extremidade 3’-OH para a adição de novos nucleotídeos na fita de replicação descontínua, recuperando completamente a região telomérica. Apesar da telomerase gerar a extremidade 3’-OH para adição de novos nucleotídeos, recuperando um pouco a região telomérica, ela não controla quantos nucleotídeos serão colocados. V (4) A expressão da enzima telomerase tem papel crucial na senescência celular, uma vez que é normalmente reprimida nas células somáticas após o período pós-natal, resultando no encurtamento progressivo dos telômeros. F (5) Sequências não codificadoras de DNA com repetições em tandem (agrupadas) são encontradas tanto nos telômeros quanto em outras regiões do genoma, como as sequências LINES e SINES encontradas no genoma de eucariotos. LINES e SINES são sequências encontradas no genoma como repetições espaçadas ou intercaladas (e não como repetições em tandem), sendo elementos de transposição derivados de transcritos da RNA-polimerase II (LINES) ou de transcritos da RNA-polimerase III (SINES). F (6) A regulação da expressão da telomerase em células somáticas pode resultar em câncer. A falta de regulação da expressão da telomerase em células somáticas é que pode resultar em câncer. 8) Explique resumidamente como as proteínas ativadoras transcricionais e os repressores afetam o nível de transcrição de genes eucarióticos. Resposta: As roteínas ativadoras transcricionais estimulam a transcrição facilitando a montagem ou a ação do aparelho basal de transcrição no cerne promotor. Elas são capazes de se ligar ao DNA em uma sequência especifica de bases. Também têm a habilidade de interagir com outros componentes do aparelho transcricional e influenciar a taxa de transcrição. 9) A seguir, a coluna da esquerda apresenta o nome de elementos reguladores do genoma eucariótico; a da direita, descrições sobre alguns esses elementos. 8) Associe adequadamente a coluna da direita à da esquerda. (A) Elemento TATA (B) Elemento acentuador © Elemento iniciador © O elemento de ação cis é o ponto de início da transcrição pela RNA polimerase II. (A) Este elemento de ação cis é um sítio de ligação para um dos fatores gerais de transcrição. (B) Este elemento de ação cis pode ser localizado a milhares de pares de bases EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 10 – {12 distante do gene que regula. b) Justifique cada uma das associações feitas. Resposta: O elemento iniciador (Inr) é o local onde a RNA polimerase se liga ao DNA e inicia a síntese do mRNA. É conhecido como sítio iniciador. O elemento TATA é o sítio onde se liga o fator de transcrição TFIID. A proteína de ligação a TATA é uma das subunidades de TFIID, e se liga primeiro ao elemento TATA. Os acentuadores são sequências de ação cis situadas a grandes distâncias do cerne do promotor dos genes que eles guiam. Eles também são independentes de orientação, e podem estar situados ou a 5’ ou a 3’ do gene. Os acentuadores são sítios de ligação de proteínas ativadoras, que são colocados em proximidade ao gene pelo dobramento do DNA. 10) O que e um elemento de resposta? Como os elementos de resposta causam a expressão coordenada de genes eucarióticos? Resposta: São sequências de DNA regulatórias em comum nos promotores ou acentuadores. 11) O que e RNA anti-sentido (anti-senso)? Como ele controla a expressão gênica? Resposta: O RNA anti-sentido é completar a um mRNA. Ele controla a expressão gênica ligando-se às sequências complementares no mRNA e inibindo a tradução. 12) Defina silenciamento por RNA. Resposta: O silenciamento por RNA é iniciado por moléculas de RNA fita dupla que são cortadas e processadas. Os pequenos RNA interferentes resultantes ligam-se a sequências complementares no mRNA e causam seu corte e decomposição ou inibem a tradução. MECANISMOS DE RECOMBINAÇÃO GENÉTICA 8) Como a recombinação genética causa variação genética? Resposta: As mutações são a origem primária de toda a variação genética. A recombinação tem enorme impacto sobre a variação, pois efetivamente realiza a “mistura” entre os genes diferentes dos seres vivos. 2) Características como resistência a antibióticos e fatores de virulência podem passar de uma bactéria para outra bactéria (da mesma ou de espécie diferente). Descreva resumidamente os 3 principais mecanismos envolvidos. Resposta: Conjugação: processo unidirecional de transferência de informação genética entre bactérias, que ocorre de uma bactéria dadora (F+) para uma receptora (F-), através de pontes ou comunicações citoplasmáticas temporárias (fímbria ou pili sexual) entre as duas células. A cepa doadora contém no citoplasma um filamento circular de DNA, o fator F, que é um plasmídeo (plasmídeo F) que contém genes que codificam a fímbria sexual, responsáveis por mantém juntas as duas bactérias, possibilitando a formação da ponte de conjugação. Na conjugação, apenas um dos filamentos do plasmídeo é transferido da célula doadora para a célula receptora. O filamento que fica na bactéria doadora se mantém circular, porém o filamento que é transferido para a receptora se rompe e migra pela ponte de conjugação sob a forma de um filamento alongado com extremidades 3’ de fitas simples livres, necessárias para a recombinação homóloga com o DNA da receptora. Transformação: consiste na captação de DNA do ambiente, geralmente decorrente da lise celular, seguida de incorporação deste DNA no cromossomo da célula receptora. Bactérias que morrem em seu ambiente natural se desintegram e seu DNA, parcialmente fragmentado, pode ser captado pelas células adjacentes. O DNA que penetra na bactéria pode ser reconhecido como estranho e destruído pelas enzimas de restrição, cuja função é defender a bactéria contra invasores (bacteriófagos), destruindo seu DNA. Quando o processo de transferência de genes é bem sucedido, ocorre uma recombinação homóloga para integração, no cromossomo da bactéria receptora, do DNA exógeno. Transdução: processo pelo qual uma bactéria transmite informação genética à outra, usando como vetor um vírus bacteriófago. Durante o processo de formação dos bacteriófagos (ciclo lítico), pode ocorrer a produção de alguns bacteriófagos defeituosos, contendo DNA de bactériaem vez de somente DNA viral. Esses bacteriófagos defeituosos contendo DNA bacteriano irão injetar genes de uma bactéria dentro da outra, assim transferindo a informação genética. 3) Considere a figura abaixo para responder ao que se pede. Por que podemos interpretar o cromossomo A-B+C- como sendo resultante de dois crossing-over recíprocos, um de cada lado do gene de B? Resposta: O esquema abaixo, envolvendo as possibilidades de crossing-over recíprocos, responde a pergunta. EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 11 – {12 4) Existem três tipos básicos de mecanismos de recombinação, os quais compartilham a característica de envolverem a troca física de material entre os duplex de DNA: recombinação homóloga, recombinação sítio-específica e recombinação por transposição. Quais são as diferenças básicas entre eles, em termos do reconhecimento e homologia das sequências de DNA necessárias ao processo de recombinação? Resposta: Enquanto a recombinação homóloga resulta na troca de sequências homólogas de DNA entre os cromossomos pareados durante a meiose (eucariotos) ou na troca entre regiões homólogas mais restritas do cromossomo (procariotos; não envolve cromossomos inteiros), a recombinação sítio-específica não exige homologia extensa de DNA, ocorrendo entre sequências de DNA específicas homólogas somente em uma pequena região, e a recombinação por transposição gera repetições diretas no sítio-alvo do DNA que fornecem as regiões homólogas usadas para patrocinar os eventos de recombinação. 5) Elementos de inserção (IS) são os tipos mais simples de transposons. Em relação ao tema, responda: a) Descreva como os IS são estruturalmente organizados. Resposta: Elementos inserções têm sequências repetidas invertidas flanqueadas por repetições curtas diretas derivadas do hospedeiro. Elementos de inserção carregam um gene transposase cujo produto vincula às repetições invertidas para ajudar a patrocinar a transposição. b) Quais são as diferenças estruturais básicas entre os IS e os transposons (Tn) compostos e complexos? Resposta: Os IS são transposons mais simples que codificam apenas a transposase (responsável pela transposição), enquanto os Tn compostos contêm também genes de resistência a antibióticos ou para produção de toxinas, e os Tn complexos contêm, além desses genes, o gene para a resolvase, cuja atividade enzimática está envolvida na recombinação sítio-específica entre dois transposons. c) Como transposons se deslocam de um local para outro? Resposta: Todas as transposições inicialmente fazem um corte não-alinhado em cada uma das fitas do sítio-alvo do DNA. As repetições invertidas dos transpons são então ligadas às extremidades sobressalentes geradas e as lacunas são preenchidas para criar uma repetição direta do DNA destinatário. d) Como os transposons podem provocar rearranjo de DNA? Resposta: Várias cópias de transposons no genoma fornecem regiões homólogas que podem patrocinar eventos de recombinação. A geração de repetições diretas no sítio-alvo do DNA e excisão do DNA interveniente para gerar extremidades sobressalentes que são ligadas às do transposon, possibilita aos sistemas do hospedeiro executar uma recombinação recíproca entre duas cópias do transposon. Assim, como consequências da recombinação entre as repetições diretas do DNA do hospedeiro ou as repetições indiretas do transposon, temos as seguintes possibilidades: - deleção: se a recombinação ocorrer entre qualquer par de repetições diretas (do DNA do hospedeiro), deleta o todo material genético entre elas (a região é removida como um círculo de DNA). - inversão: na recombinação recíproca entre um par de repetições invertidas (do transposon) a região entre as repetições é invertida. e) Diferencie: transposição replicativa, não-replicativa e conservativa. Resposta: Transposição replicativa: cria uma nova cópia do transposon, a qual é inserida em um sítio receptor. Assim o sítio doador permanece inalterado. Transposição não-replicativa: permite que um transposon mova-se como uma entidade física de um sítio doador para um sítio receptor, mas deixa uma quebra no sítio doador que é letal para a molécula doadora se não for reparada pelo sistema de reparo. Transposição conservativa: o transposon é removido do sítio doador e inserido no sítio-alvo por uma série de eventos nos quais todas as ligações nucleotídicas são conservadas. EXERCÍCIOSTURMA:NOME: 12 – {12 6) Diferentemente da recombinação homóloga, a recombinação sítio-específica é capaz de alterar a ordem com que genes aparecem num cromossomo e é responsável pela movimentação de sequências nucleotídicas especiais, os chamados elementos genéticos móveis (EGM), através de sítios não-homólogos num genoma. Descreva os tipos de EGM envolvidos na recombinação sítio-específica transposicional. Resposta: EGM de classe I (retrotransposons e retroposons): utilizam um intermediário de RNA: aqueles que não são defectivos transcrevem o EGM integrado, dando origem a um RNA que é convertido em um DNA complementar (cDNA) pela enzima transcriptase reversa codificada pelo próprio transposon. Este DNA, por sua vez, se insere em um sítio genômico por um mecanismo semelhante ao da transposição conservativa. Nesta classe encontram-se as sequências intercaladas longas derivadas de transcritos da RNA-polimerase II (LINES) e as sequências intercaladas curtas derivadas de transcritos da RNA-polimerase III (SINES), comumente encontradas em grande número de cópias (sequências esparçadas) no genoma de mamíferos. EGM de classe II (transposons): utilizam um intermediário de DNA: podem se mover no genoma por transposição replicativa, não-replicativa ou conservativa (ver resposta da questão 6). EGM de classe III: possuem características semelhantes aos EGM de classe I e II, mas o mecanismo de transposição ainda não é conhecido. 7) Elementos transponíveis podem provocar mutações, quando inseridos em um sítio próximo à sua localização original, e também quebra na sequência gênica, quando inseridos no interior de um gene, por interromperem a continuidade do gene. No último caso, poder-se-ia dizer que os íntrons também interrompem a continuidade de um gene, embora ele permaneça funcional. Em relação ao tema, responda: 8) Como os transposons podem provocar mutações quando inseridos em um sítio próximo à sua localização original? Resposta: Como os transposons terminam em repetições terminais invertidas curtas e geram repetições diretas no DNA que flanqueia o sítio-alvo, quando inseridos em um sítio próximo à sua localização original podem provocar rearranjos no DNA hospedeiro, ou seja, os sistemas do hospedeiro podem executar uma recombinação recíproca entre as duas cópias do transposon. OU Várias cópias de transposons no genoma fornecem regiões homólogas que podem patrocinar eventos de recombinação. A geração de repetições diretas no sítio-alvo do DNA e excisão do DNA interveniente para gerar extremidades sobressalentes que são ligadas às do transposon, possibilita aos sistemas do hospedeiro executar uma recombinação recíproca entre duas cópias do transposon. b) Que tipos de mutações podem ocorrer quando um transposon se insere em um sítio próximo à sua localização original? Explique. Resposta: deleção: a recombinação entre qualquer par de repetições diretas deleta o material entre elas e a região é removida como um círculo de DNA. Inversão: na recombinação recíproca entre um par de repetições invertidas a região entre as repetições é invertida. c) Por que a presença de um íntron em um gene não o inativa, enquanto a inserção de um elemento de transposição pode inativá-lo? Resposta: Os introns fazem parte da estrutura gênica dos eucariotos: como uma espécie de mosaico, os genes de organismos eucariontes são divididos em porções chamadas de íntrons, as regiões não-codificadoras, e pelas regiões da sequencia do DNA que seriam responsáveis pela especificação do produto gênico, os exons. Os genes que apresentam essa estrutura são os chamados “genes interrompidos”. Não têm capacidade de transposição e não afetam a expressãogênica, uma vez que são removidos pelo splicing, processo em que são removidos os íntrons do RNA mensageiro, tornando-o maduro (gera um mRNA menor contendo uma sequência codificadora intacta). Já um elemento de transposição pode se inserir em introns e exons, e, neste último caso, podem provocar a disrupção gênica. Também podem provocar rearranjos no DNA do hospedeiro, levando à deleção ou inversão, ou então, durante a transposição, deixar uma quebra no sítio doador que é letal para a molécula doadora se não for reparada pelo sistema de reparo. 8) Embora algumas regiões do genoma exibam incomumente frequências de recombinação altas ou baixas, todas as regiões podem e participam de recombinação homóloga. Baseado em conhecimentos sobre o mecanismo de recombinação homóloga liste duas propriedades deste processo que servem assegurar que todas as sequências de DNA podem participar de recombinação. Explique suas respostas. Resposta: Propriedade 1: A iniciação da recombinação homóloga é independente de sequência. A probabilidade de ocorrer uma quebra em dupla fita é igual ao longo de todo DNA. Propriedade 2: Os componentes que inicialmente agem para reparar uma quebra em dupla fita são específicos paras estruturas e independentes de sequências. A RecBCD será carregada em qualquer extremidade de fita dupla de DNA e a RecA será carregada em uma região de fita simples. Nota: A representação excessiva de sítios Chi não é uma resposta aceitável neste caso, porque a frequência de recombinação ainda varia à medida que você se afasta de um sítio Chi.
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