ED -CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS E FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA

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ESTUDO DIRIGIDO 2
CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS E FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA
07. Indicar o número de ATPs sintetizados para cada NADH e FADH2 reoxidados na cadeia de transporte de elétrons.
1 NADH libera 10 H+ gerando 3 ATPs. 1 FADH2 libera 6 H+ formando 2 ATPs.
08. Analisar a velocidade da cadeia de transporte de elétrons em função da razão ATP/ADP.
Quando se tem muito ATP e pouco ADP, o complexo 4 funcionará lentamente, o que ocorre que menos H+ saia para a matriz aumentando o potencial intermembranas e os complexos 1, 3 e 4 não tanto H+, assim vai diminuirá a oxidação do NAH e FADH. E quando tem bastante ADP, o complexo 5 irá trabalhar mais bombeando muitos H+ para a matriz.
09.A membrana interna da mitocôndria é impermeável a ATP e NADH. Explicar como o ATP produzido na mitocôndria pode ser utilizado no citoplasma. 
Na membrana interna da mitocôndria possui um cotransportador de ADP/ATP, o ANT, que permite a saída de ATP da matriz e transporta ADP para dentro da mitocôndria.
10. Nos seus estudos sobre fermentação alcoólica por leveduras, Louis Pasteur notou que a introdução de O2 numa cultura anaeróbia de suco de uvas que estava fermentando resultava em uma drástica diminuição da velocidade de consumo de glicose. Esse fato, conhecido como "Efeito Pasteur" pode ser revertido pela adição de um desacoplador da fosforilação oxidativa. 
a) Por que as células de levedura consomem menos glicose na presença de oxigênio?
Piruvato é convertido em acetil-CoA pela enzima piruvato desidrogenase, esse Acetil-CoA se juntará ao oxaloacetato dando início ao Ciclo de Krebs, que durante o ciclo ocorrerá formação de NADH e FADH2. Sem oxigênio, NADH e FADH não conseguem doar seus elétrons, ocasionando um acúmulo de NAH e FADH que vai inibir a piruvato desidrogenase, até que o ciclo pare. E sem a conversão de piruvato em Acetil-CoA, o piruvato vai seguir a via de fermentação alcoólica para regenerar e NAD. Com o ciclo parado também há acúmulo de ADP. Este por sua vez estimula a PFK1 beneficiando a via glicolítica, que quebrará mais glicose e gerar mais piruvato para a fermentação alcoólica. Nesse caso de ausência é percebido, que como não acontece o Ciclo de Krebs a levedura terá de quebrar mais glicose para conseguir ATP. Quando há oxigénio não vai acontecer o acúmulo de NADH, pois cadeia irá trabalhar normalmente, tendo um saldo de ATP maior.
b) Por que a adição de desacoplador reverte ou evita o efeito Pasteur?
	Na respiração celular as leveduras vão consumir menos glicose do que se realizasse a fermentação, pois na respiração celular serão geradas 32 ATP para cada mol de glicose, sendo que na fermentação ela conseguiria 2 ATP.
11. Descrever os "sistemas de lançadeira" e analisar sua importância.
Lançadeira Malato-Aspartato: são transferidos 2 elétrons do NADH (que foi produzido na glicólise), que vai entrar na mitocôndria e será oxidado voltando a ser oxalato, transferindo esses elétrons para um NAD mitocondrial. O Oxalato ao receber um grupamento amina se transformará em Aspartato e vai sair da mitocôndria. Ao sair por anti porte deixa entrar um protón para dentro da matriz. 
 	Lançadeira Glicerol Fosfato: Diidrocacetona será reduzida recebendo os elétrons do NADH se transformando em Glicerol-3 fosfato. Na superfície da membrana vai passar esses elétrons para o FAD (se transformando novamente em Diidroxiacetona). O FADH2 vai entrar no complexo 2 e transferir seus elétrons. Neste caso o saldo de ATP é menor que o da lançadeira malato espartato.
01. Como você classificaria os compostos que estimularam o consumo de oxigênio em mitocôndrias isoladas quanto ao seu modo de ação na cadeia de transporte de elétrons?
Complexo I (NADH desidrogenase), um complexo enzimático capaz de oxidar a NADH e transferir seus elétrons ao “Pool de Ubiquinona-UBQ” um pequeno carregador de prótons e elétrons solúvel em lipídios e localizado no interior da membrana interna. Quatro prótons (H+ ) são bombeados para o espaço intermembranas para cada par de elétrons que passa pelo complexo (cada molécula de NADH oxidada libera um par de elétrons).
Complexo II (succinato desidrogenase) promove a oxidação do succinato à fumarato, com a produção de FADH2, que por sua vez também doa elétrons ao UBQ. Esse complexo não bombeia prótons para o espaço inter-membranas.
O Complexo III (citocromo bc1) oxida a ubiquinona reduzida (ubiquinol) e transfere elétrons ao citocromo c, uma proteína periférica, fracamente presa à membrana interna e que transfere elétrons do Complexo III ao Complexo IV. Quatro prótons (H+ ) são bombeados para o espaço inter-membranas para cada par de elétrons que passa pelo complexo. O Complexo IV (citocromo c oxidade; ou oxidase ‘normal’), contém, dentre outros, um citocromo c e um citocromo a3.
O Complexo IV é a oxidase terminal e realiza a redução do O2 a duas moléculas de H2O. Dois prótons (H+ ) são bombeados para o espaço inter-membranas para cada par de elétrons que passa por esse complexo.
2. Das substâncias “sem efeito” quais são efetivas para cada um dos substratos?
Complexo I: NADH desidrogenase (FNM e Fe-S: Transfere 4 H+ para o espaço intermembrana ; Ubiquinona oxidorredutase (Transferencia de um ion hidreto do NADH para o FMN)
Complexo II: Succinato desidrogenase (Canaliza diretamente os elétrons do succinato para a cadeia transportadora de elétron)
Complexo III: Ubiquinona: citocromo coxidorredutase (Transfere 4 H+ para o espaço intermembrana , Canaliza os 2 eletrons do Ubiquinol para o Citocromo C com a transferência de H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana)
Complexo IV: Citocromo oxidase (Os eletrons do Citocromo c são entregues ao O2)
3. Baseado na tabela acima responda: 
a) Que substância(s) atua(m) como desacoplador(es)? Justifique.
Atuam diretamente sobre uma subunidade da ATP sintase, como por exemplo o diciclohexilcarbodimida (DCCD) que liga fortemente ATP sintase que é inibida. DNP não deixa acontecer a fosforilação oxidativa por não haver gradiente eletroquímico, outro exemplo pode ser os barbitúricos que inibem o transporte de elétrons pelo Complexo I, pois bloqueiam a transferência de Fe-S para Q. A antimicina A e o dimercaprol inibem o Complexo III. Substâncias tóxicas como H2S, monóxido de carbono e cianeto inibem o Complexo IV e podem interromper completamente a respiração. O malonato é um inibidor competitivo do Complexo II. O atractilosídeo inibe o transportador de ADP para dentro e o de ATP para fora da mitocôndria. O antibiótico oligomicina bloqueia o fluxo de prótons por meio da ATP-sintetase. A termogenina que é mais associada para geração de calor.
 b) Que substância(s) atua(m) como inibidor(es) da ATP sintase? Justifique.
Atuam através da dissipação do gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna, criado pelo sistema de transporte de elétrons, como por exemplo o 2,4-dinitrofenol, dicumarol e o fluorocarbonilcianeto fenilhidrazona ou FCCP.
04. Identificar os substratos e os inibidores para cada um dos sítios referidos
	
	COMPLEXO I
	COMPLEXO II
	COMPLEXO III
	COMPLEXO IV
	ATP Sintase 
	SUBSTRATOS
	NAD reduzido
	FAD reduzido
	Elétron do NAD e FAD
	Elétron do NAD e FAD
	H+
	INIBIDORES
	Barbituratos; Rotenona (inseticida); Piericidina A Oftalmopatia hereditária de Leber, Deficiência de riboflavina (B2)
	2-tenoiltrofluoroaceton a; carboxina; malonato, metilmalonato
	Antimicina A Dimercaprol, Mutações citocromo b, bc1
	Cianeto monóxido de carbono; azida sódica; ácido sulfídrico MELAS, MERRF, Deficiência de Cobre, Ferro - CN- e CO
	Diciclohexilcarbo dimida oligomicina, atractilosídeo
05. O composto hipotético A inibe o consumo de oxigênio e a síntese de ATP por mitocôndrias isoladas. A medida destes parâmetros em presença de um desacoplador permitiria determinar o modo de ação do composto A? 
Nesse caso enzimas transferem os elétrons ao oxigênio molecular sem bombear prótons para o espaço intermembrana, assim não vai ter gradiente eletroquímico, então não irá funcionar o Complexo IV (sem síntese de ATP). Inibe consumo de O2 e síntese de ATP. Ou seja, semo O2, não vai haver o transporte e nem a síntese de ATP.	
06. Classifique as substâncias que atuam como inibidores em dois grupos quanto ao local de atuação. 
 Inibidores que agem dentro da cadeia de transporte de elétrons 
Inibidores que agem nas enzimas.
07. Preencha o esquema abaixo com um modelo que, para você, melhor represente o funcionamento da cadeia de transporte de elétrons, indicando onde devem agir as substâncias que aparecem no software.
Fonte: google images. Acesso: 8/02/2021.