Relatório - Processamento Histológico

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA - FAVET 
 
 
 
 
 
 
 
PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO VOLTADO 
PARA A MICROSCOPIA ÓPTICA 
 
 
 
 
 
 
Discentes: 
Adnilson Lima Maia 
Alessandra Oliveira Rego 
Ana Ligia Parente do Vale 
Lívia Batista Silva 
Luana Cortez Passos 
Maria Eduarda do Carmo Moura 
 
 
 
 
 
Fortaleza/CE 
2021 
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SUMÁRIO 
 
 
 
INTRODUÇÃO.................................................................................................. 2 
1. EUTANÁSIA............................................................................................ 4 
2. COLETA DE MATERIAL 
(RETIRADAO DOS ÓRGÃOS/TECIDOS)............................................... 
 
8 
3. FIXAÇÃO................................................................................................. 11 
4. CLIVAGEM.............................................................................................. 12 
5. DESIDRATAÇÃO.................................................................................... 13 
6. CLARIFICAÇÃO OU DIAFANIZAÇÃO................................................... 13 
7. INCLUSÃO.............................................................................................. 14 
8. MICROTOMIA......................................................................................... 15 
9. BANHO-MARIA....................................................................................... 17 
10. COLORAÇÃO.......................................................................................... 18 
 10.1 DESPARAFINIZAÇÃO.................................................................... 19 
 10.2 HIDRATAÇÃO................................................................................. 19 
 10.3 COLORAÇÃO.................................................................................. 19 
 10.4 DESIDRATAÇÃO............................................................................ 21 
 10.5 CLARIFICAÇÃO.............................................................................. 21 
11. MONTAGEM DA LÂMINA....................................................................... 21 
12. CONCLUSÃO.......................................................................................... 22 
REFERÊNCIA.................................................................................................... 23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
Histologia (do grego histos= tecido ou teia e lógos = tratado, estudo, teoria) é o 
estudo da formação, estrutura e função dos tecidos biológicos, bem como de sua 
organização na formação dos diferentes órgãos. 
 
O termo “tecido” foi empregado pela primeira vez ainda no século XVIII pelo 
fisiologista e anatomista francês Marie François Xavier Bichat que, ao estudar 
cadáveres humanos, percebeu que determinadas estruturas (macroscópicas) 
apresentavam diferentes texturas entre si mas mantinham estreita semelhança com a 
trama dos fios de tecidos (panos), tendo catalogado, ao todo, 21 (vinte e um) tipos de 
tecidos biológicos. Posteriormente o termo foi largamente empregado pelo anatomista 
e fisiologista alemão August Franz Josef Karl Mayer, desta feita fazendo referência às 
estruturas microscópicas atualmente estudadas pela histologia. 
 
Porém, foi com o médico e antropologista alemão Rudolf Ludwig Karl Virchow 
que a histologia passou a desempenhar papel de maior relevo nas ciências médicas 
e biológicas, particularmente na realização de diagnósticos. Foi Virchow quem 
primeiro observou que as estruturas teciduais são afetadas por quadros patológicos. 
 
Os avanços da histologia estão intimamente ligados aos avanços na 
microscopia, tendo ambas se desenvolvido paralela e conjuntamente. Em que pese o 
inegável avanço tecnológico que culminou nos microscópios eletrônicos, o presente 
estudo tem por escopo o trato de seu antecessor: o microscópio óptico (também 
conhecido como microscópio de luz ou fotônico), amplamente utilizado até os dias de 
hoje. 
 
No microscópio de luz a imagem se forma a partir dos raios luminoso de um feixe 
de luz que atravessou a estrutura nele colocada. Sua estrutura conta com três 
sistemas de lentes: o condensador (concentra a luz da lâmpada e projeta o feixe 
luminoso), as objetivas (recebem a luz que atravessou o espécime e projeta sua 
imagem aumentada para as oculares) e as oculares (ampliam novamente a imagem 
e a projetam na retina). 
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O microscópio fotônico tem poder/limite de resolução máximo de 0,2µm, esta 
resolução torna possível a obtenção de boas imagens com um aumento de 1000 até 
1500 vezes. Esse limite é o fator determinante para a riqueza de detalhes da imagem 
e depende essencialmente das lentes objetivas. Esse conjunto de lentes, 
normalmente, possui 4 componentes, cada um com um poder de aumento diferente, 
são eles: 4x essa lente é marcada por uma faixa vermelha e permite uma vista 
panorâmica do tecido), 10x (essa lente é marcada por uma faixa amarela e permite 
visualizar as diferenças entre os tecidos), 40x (essa lente é marcada por uma faixa 
azul e permite a visão de diferentes células) e 100x (essa lente é marcada por uma 
faixa preta e permite a percepção dos detalhes celulares. 
 
Mas, os avanços nos estudos dos tecidos não se deram meramente na estrutura 
física dos microscópios – tais como lentes, ajustes de foco e tipos e feixes de luz que 
possibilitam melhor visualização dos espécimes estudados. Antes, o tratamento dado 
aos materiais analisados (desde sua coleta até sua disponibilização em lâminas) 
também passou por avanços significativos – ainda que alguns métodos e substâncias 
tenham se mantido praticamente inalterados ao longo dos anos. 
 
Tal preparação é necessária para que não ocorra um processo conhecido por 
autólise - a destruição dos tecidos pela ação de enzimas digestivas existentes nas 
próprias células ou em bactérias, bem como para permitir a visualização daquelas 
estruturas ao microscópio, posto que a densidade tecidual não permite a passagem 
de luz (princípio empregado na microscopia óptica) pelo tecido íntegro, o que obriga 
ao fatiamento do mesmo em seções demasiado delgadas, chamadas cortes 
histológicos – que variam entre 1 e 10 micrômetros de espessura. 
 
As amostras coletadas – quer para fins de pesquisa, quer para fins de 
diagnóstico – devem ser submetidas a uma sequência de procedimentos antes de 
estarem prontas ao estudo, que pode se dar por anos. 
 
Entre os procedimentos realizados estão: eutanásia ou biópsia; coleta do 
material (retirada dos órgãos); fixação; clivagem; desidratação; clarificação (ou 
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diafanização); inclusão; microtomia; banho-maria; coloração (subdivida em etapas) e 
montagem da lâmina (ou selagem). A seguir, abordaremos cada uma delas 
isoladamente. 
 
1. EUTANÁSIA 
 
O primeiro passo a ser realizado é a coleta do material, que pode ser retirado de 
um animal vivo (por meio de uma biópsia ou durante uma cirurgia, por exemplo) ou 
morto (necropsia). No caso de animais criados para fins de pesquisa cuja morte seja 
indispensável, o pesquisador deve atentar para a necessidade de imposição do menor 
sofrimento ao animal, provocando sua morte da forma menos agonizante e indolor 
possível – processo conhecido como eutanásia. 
 
Tal procedimento encontra-se disciplinado pelo CONCEA – Conselho Nacional 
de Controle de Experimentação Animal. 
 
Em apertada síntese, o documento exige não apenas que se imponha o menor 
sofrimento possível aos animais, mas também aborda questões éticas e morais de 
forma que tal prática se dê da forma mais humanitária possível, com vistas à 
preservação da sanidade física e psíquica do executor do animal. Isto porque alguns 
métodos de eutanásia se caracterizam por enorme atividade motora (muscular) entre 
a inconsciência do animal e sua morte. Ainda que isso não acarrete qualquer 
sofrimento ao mesmo, apresentaum aspecto desagradável de ser presenciado, o que 
pode levar alguns indivíduos a desenvolverem mecanismos de defesa que tendem a 
reduzir sua empatia e respeito no manuseio dos animais ou, no outro extremo, 
experimentarem sentimentos de pesar e tristeza pela perda da vida. Não raro os 
executores contumazes desenvolvem maior agressividade, depressão, alienação e 
profunda insatisfação com o trabalho, dentre outros problemas. 
 
Para evitar isso, o responsável pela eutanásia deverá não apenas dominar as 
técnicas empregadas, mas entender o motivo pelo qual o animal está sendo morto e 
ser informado sobre a finalidade a que se destinará o cadáver, sendo salutar o 
revezamento dos executores, bem como que os mesmos não atuem sob pressão ou 
sejam obrigados a realizar o procedimento. 
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 Os animais devem ser acalmados para a realização da eutanásia: um ambiente 
limpo, sem a presença de outros animais, com baixa luminosidade e livre de estímulos 
estressores, quer visuais, quer sonoros, é sempre recomendado, bem como a limpesa 
do ambiente e dos objetos utilizados antes da entrada do próximo animal. 
Preferencialmente, aliás, os animais devem ser eutanasiados no ambiente em que 
vivem. 
 
A eutanásia de animais selvagens, a seu turno, constitui um desafio à parte, 
sendo recomendado o auxílio (ou a orientação) de profissionais experientes no 
manuseio da espécie objeto do procedimento. Por vezes será forçoso o emprego de 
sedativos, analgésicos e/ou anestésicos injetados por meio de dardos ou de armas de 
captura (a injeção de tais substâncias também deve causar o menor estresse 
possível). Pode-se, ainda, fazer uso de fármacos por via oral (misturados ao alimento 
ou à água). 
 
O que determinará, em grande parte, a escolha do método a ser empregado será 
sua confiabilidade, irreversibilidade e compatibilidade com a espécie, sua idade e 
estado de saúde. 
 
Havendo a necessidade de eutanasiar um grande número de animais 
simultaneamente (como no caso de roedores), é possível fazer uso de sistemas 
automatizados que fornecem agentes inalatórios. 
 
Quando a eutanásia houver de ser realizada em fetos e formas larvais, devemos 
considerar cada espécie isoladamente, levando em conta o tempo de gestação. De 
forma geral a morte da mãe culmina na morte dos fetos. Contudo, sua extração não 
deverá ser feita imediatamente, uma vez que sua maior resistência à hipóxia (baixa 
concentração de oxigênio) poderá lhe fornecer um tempo maior de sobrevida. Uma 
vez retirados os fetos, caso ainda estejam vivos, sua morte deverá se dar o mais 
rápido possível – por exemplo, por deslocamento cervical, no caso dos camundongos. 
 
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Se os fetos, porém, já tiverem ultrapassado mais de dois terços da gestação, sua 
morte induzida deverá se dar da mesma forma que seus congêneres (animais de 
mesma espécie) de idade adulta. 
 
Os métodos de eutanásia atuam em três frentes: 
 
a) hipóxia direta ou indireta 
 
Neste mecanismo os agentes devem causar inconsciência antes da perda da 
atividade motora. 
 
b) depressão neuronal 
 
Os agentes causadores de depressão dos neurônios cerebrais causam 
inconsciência seguida de depressão respiratória e parada cardíaca por 
hipoxemia. 
 
c) interrupção da atividade cerebral e destruição de neurônios vitais 
 
A interrupção da atividade cerebral e destruição de neurônios vitais podem 
ser alcançadas por trauma craniano (concussão), destruição direta do 
cérebro ou despolarização elétrica dos neurônios, o que induz à 
inconsciência de forma rápida. A morte ocorre por destruição dos centros que 
controlam as atividades respiratória e cardíaca ou pelo uso de métodos 
adicionais ou complementares para completar a eutanásia, como a 
exsanguinação, por exemplo. 
 
Em regra, portanto, a eutanásia (quer por métodos físicos, quer por métodos 
químicos) deverá seguir a seguinte sequência: inconsciência, parada 
cardiorrespiratória e perda da função cerebral. 
 
Inúmeros são os métodos de eutanásia, variando desde barbitúricos a 
compressão torácica, passando por decapitação, tiro com arma de fogo, 
atordoamento por eletonarcose, deslocamento cervical, eletrocussão etc. 
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Fonte:https://www.google.com/search?q=eutan%C3%A1sia+animal&rlz=1C1GCEU_pt-
BRBR940BR940&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=2ahUKEwji_euKsL3wAhUnGbkGHTeICX0Q_AUoA
3oECAIQBQ&biw=1920&bih=969#imgrc=c0wJKy-m0iCG4M 
 
 
Neste ponto é importante frisar que um método aceito para determinado grupo 
taxonômico não necessariamente é aceito para outro. Tomemos por exemplo, o 
deslocamento cervical. Este é aceito com restrições para aves (que apresentem peso 
inferior ou igual a 3kg) e pequenos roedores (camundongos), mas é inaceitável para 
peixes ósseos e cartilaginosos. 
 
Assim, o método a ser aplicado – considerando-se as espécies, de per si, seu 
peso e condições de saúde – está disciplinado naquela Diretriz da Prática de 
Eutanásia do CONCEA, referida anteriormente. 
 
As tabelas que instruem a referida diretriz tomaram por escopo se o método 
empregado causa pouco ou nenhum sofrimento ao animal, provocando a morte de 
forma humanitária (recebendo a denominação de “método recomendado”); se o 
método não pode ser substituído por outro sem prejuízo dos resultados experimentais 
(“método aceito com restrição”), devendo o executor ter comprovada habilidade e 
qualificação para o emprego do método; ou se o método não se enquadra nos critérios 
ideais, não é humanitário ou apresenta outros problemas significativos associados ao 
seu uso (hipótese em que é tido como “método inaceitável”). 
 
 
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2. A COLETA DE MATERIAL (RETIRA DOS ÓRGÃOS/TECIDOS) 
 
A retirada e o manuseio dos tecidos e órgãos são procedimentos que exigem 
equipamentos, técnicas e cuidados apropriados a fim de evitar lesões que dificultem 
ou inviabilizem o exame histopatológico ou que possam induzir a erro o pesquisador 
por infração de lesões até então inexistentes. 
 
A coleta de material, assim como todo e qualquer procedimento que envolva 
técnica histológica (ou mesmo qualquer outra que ocorra em âmbito laboratorial), 
requer planejamento e organização. 
 
A bem dizer, a organização é um dos principais fatores para se criar um ambiente 
seguro voltado à realização de um trabalho, evitando a ocorrência de acontecimentos 
indesejados durante a realização de qualquer etapa do mesmo, tais como óbices à 
locomoção de pessoas no ambiente ou falta de espaço para a realização dos 
procedimentos. 
 
Até mesmo a finalidade da coleta deve ser devidamente considerada. Assim, 
caso a mesma se preste à realização de diagnóstico de determinada enfermidade, 
deverá ser previamente submetida a análise por um patologista para verificação e 
anotações afetas aos aspectos macroscópicos da peça (cor, tamanho e aparência). 
 
Após a coleta, é essencial que o material seja catalogado em livro próprio, para 
fins de registro (o material será identificado por um número que o acompanhará em 
todas as fases do procedimento). Também é recomendável que se registre o 
requisitante da análise histopatológica, a identificação do órgão, as datas de fixação 
do material, a data de entrada do material no laboratório, a identificação do paciente 
(e no caso de animais, dos tutores ou responsáveis), data e tipo do procedimento que 
culminou na obtenção do órgão ou tecido; descrição da biópsia, morte ou necropsia e 
tudo o mais que puder auxiliar o histopatologista na análise do material e na 
formulação de um diagnóstico. 
 
Caso a amostra provenha de trabalhos experimentais com animais em 
instituições de pesquisa credenciadas, observados os protocolos e a legislação 
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atinentes (no Brasil, por exemplo, em se tratando de animais experimentais originários 
diretamente do meio ambiente, é necessário apresentar o projeto ao órgão ambiental 
federal -IBAMA – com vistas à obtenção de autorização para a coleta do material), o 
material coletadodeverá ser registrado em livro próprio logo após a eutanásia do 
animal. Neste livro deverá constar a identificação do laboratório, a data da eutanásia, 
os órgãos colhidos, o tipo de procedimento realizado com o animal experimental 
(infecção, por exemplo), o título do projeto e as observações necessárias para a 
avaliação do pesquisador ou tecnologista. 
 
Presentemente é necessário que tal registro seja também realizado perante o 
comitê de ética da instituição, quer fornecerá um número de protocolo a ser informado 
no trabalho científico a ser elaborado. 
 
A desatenção a tais protocolos e exigências, inclusive legais, pode não apenas 
impossibilitar a realização da manipulação do material coletado por parte dos 
laboratórios, mas também sujeitar o responsável pela coleta a processos judiciais. 
 
A coleta do material que será submetido a análise laminar pode se dar das 
seguintes formas: 
 
- Biópsia cirúrgica. Aqui, o material é coletado mediante incisão cirúrgica; 
 
- Biópsia endoscópica: utilizada para órgãos ocos – como o estômago e os 
intestinos -, através de procedimento endoscópico; 
 
- Biópsia por agulha, na qual a amostra é obtida por punção do órgão sem a 
necessidade de abertura da cavidade natural; 
 
- Cirurgias amplas: quando a amostra corresponde a um órgão – como no caso 
das mamas ou do útero, por exemplo – ou a peças grandes - como no caso de 
tumores; 
 
- Necropsia: quando a retirada ocorre em animais mortos. 
 
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Fonte: https://pt.slideshare.net/gustavofarias562114/atlas-de-anatomiadorato 
 
Por fim, vale recordar que todo material biológico coletado para análise é 
potencialmente infectante, devendo-se adotar todo o cuidado na coleta e manipulação 
dos espécimes, não apenas evitando-se a contaminação do material submetido à 
análise, como também do próprio manipulador - o que impõe a utilização dos 
equipamentos de proteção individual (EPI´s), tais como luvas, máscaras, óculos de 
proteção, e jaleco – dentre outros que se fizerem necessários – e do meio ambiente, 
evitando-se o descarte de material biológico ou seus derivados em lixo comum. 
 
 
 Fonte: https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612003000200028 
 
 
 
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612003000200028
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3. FIXAÇÃO 
 
Após a retirada é fundamental que o material coletado seja imediatamente 
imerso em uma substância fixadora a fim de manter as estruturas biológicas o mais 
intactas possível. A fixação pode se dar de forma física (frio e calor), química ou por 
uma combinação de ambas. Na fixação química diversas substâncias podem ser 
empregadas, tais como glutaraldeído, ácido pícrico, cloreto de mercúrio, trióxido de 
crômio, álcool, sais de zinco, tetróxido de ósmio ou, o mais utilizado, formol (também 
conhecido como formalina: um aldeído na forma líquida com propriedades 
conservantes, que impedem o crescimento de microrganismos). 
 
Esta etapa é importante não apenas porque interrompe o metabolismo da célula 
mas também porque estabiliza as estruturas bioquímicas intra e extra celular, permite 
a penetração de outros reagentes necessários no decorrer do processamento 
histológico, impede a colonização de microrganismos e promove o enrijecimento da 
amostra. 
 
A fixação, no entanto, não é um processo instantâneo e para que produza os 
efeitos desejados é necessário, por vezes, que a amostra seja cortada em porções 
menores ou, alternativamente, que se proceda à injeção direta do fixador na mesma 
– procedimento conhecido como perfusão intravascular – propiciando que o interior 
dos tecidos seja rapidamente alcançado através dos vasos sanguíneos. 
 
Após a fixação os tecidos conservam uma grande concentração de água (algo 
em torno de 85%). Esta água deverá ser retirada da amostra para que se possa, em 
uma próxima fase, incrustar o tecido em um bloco de parafina. 
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4. CLIVAGEM 
 
Após o processo de fixação, a clivagem é essencial para facilitar a penetração 
da substância fixadora em menor tempo, evitando, assim, o processo de autólise. A 
clivagem é feita por meio da redução do tamanho das peças, seguindo a padronização 
dos fragmentos teciduais os quais devem ter cerca de 3 mm de espessura, mas em 
alguns casos o fragmento pode chegar a 5 mm. Ademais, cabe ressaltar a importância 
da orientação do corte das peças, visto que determina como os tecidos serão incluídos 
no bloco para o corte e, posteriormente, terão influência na análise microscópica de 
acordo com suas incidências longitudinal, transversal e oblíqua. Por último, deve-se 
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lembrar de não pressionar o material fixado com pinça ou qualquer outro instrumental 
utilizado, para que não cause distorção da estrutura tecidual. 
 
Fonte: Histologando (página do facebook criada pelas estudantes de Ciências Biológicas Elivânia 
Gomes e Carolina Alves da Universidade Federal do Ceará) 
 
 
5. DESIDRATAÇÃO 
 
Antes que um material de inclusão, como a parafina, possa penetrar no tecido, 
seu conteúdo em água deve ser removido, uma vez que a parafina não se combina 
homogeneamente com a água e sem ela o tecido não ganharia a rigidez necessária 
para o corte no micrótomo. Existem vários agentes desidratantes, porém o mais usual 
é o álcool etílico, em razão, principalmente, dos bons resultados e do baixo custo. 
Assim, a desidratação é levada a efeito, imergindo o bloco de tecido em concentrações 
crescentes de álcool etílico, ou seja, é realizada com sucessivas lavagens em álcool 
em concentrações crescentes. Inicialmente em álcool 70% durante o período de 24h, 
seguido de álcool 80% durante 1h, álcool 90% durante 1h, e então duas lavagens em 
álcool absoluto durante 1h cada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: https://edisciplinas.usp.br/mod/resource/view.php?id=2850681 
 
 
6. CLARIFICAÇÃO OU DIAFANIZAÇÃO 
 
Nesse passo do processamento, para que o espécime seja preparado para a 
etapa seguinte, é necessário que o álcool usado na desidratação seja totalmente 
https://edisciplinas.usp.br/mod/resource/view.php?id=2850681
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removido, pois é imiscível em parafina. Tal processo é feito com o uso do xilol, a 
quantidade utilizada deve ser de 10 a 20 vezes o volume da peça, e a duração da 
clarificação varia de acordo com as dimensões e a constituição do material, além da 
temperatura ambiente. 
 
O xilol é, muitas vezes, chamado de agente clarificador, pois, conforme penetra 
no tecido e substitui o álcool, torna o tecido semitranslúcido, quase transparente. Essa 
também é a razão dessa etapa ser denominada de clarificação. 
 
Fonte: Histologando (página do facebook criada pelas estudantes de Ciências Biológicas Elivânia Gomes e 
Carolina Alves da Universidade Federal do Ceará) 
 
 
7. INCLUSÃO 
 
Nessa etapa ocorre a preparação do material para os cortes, removendo o 
clarificante e fornecendo a sustentação necessária para que sejam realizados os 
cortes no micrótomo. Ela é extremamente importante pois, mesmo após passar por 
todos esses processos, as amostras de tecido ainda são extremamente frágeis. 
 
Esse preparo ocorro por meio da impregnação do tecido com uma substância 
firme, normalmente é utilizada a parafina. Nele, o tecido é passado em duas trocas de 
parafina para assegurar a substituição de todo o agente clarificador, ocorre a uma 
temperatura de 56 a 60 ºC (parafina fundida), a temperatura alta também possibilita 
que o solvente utilizado na diafanização evapore. O bloco de tecido permanecerá 
imerso na parafina fundida durante o tempo necessário para a completa impregnação, 
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posteriormente será retirado da estufa e deixado à temperatura ambiente até que 
endureça, para ser levado ao micrótomo onde será seccionado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Histologando (página do facebook criada pelas estudantes de Ciências Biológicas Elivânia Gomes e 
Carolina Alves daUniversidade Federal do Ceará) 
 
 
8. MICRONOMIA 
 
Para que seja possível analisar um tecido em um microscópio óptico, é 
necessário que esteja disposta uma seção bem delgada de tecido na lâmina, na 
espessura de micrometros, já que o microscópio só consegue visualizar espécimes 
com essas dimensões. Ele é constituído de quatro peças principais: o corpo, o porta-
bloco, o porta-objeto e a navalha. 
 
Atualmente no mercado, há uma grande variedade de micrótomos, não 
limitando-se apenas a microscopia ótica, mas também a eletrônica. Vale a pena 
ressaltar alguns deles, como: 
 
Criostato/micrótomo de congelamento: é utilizado para confeccionar cortes 
de tecidos que foram congelados. Ele é muito utilizado em hospitais no intuito de se 
adquirir uma rápida analise a respeito de determinado tecido. 
 
Ultra micrótomo: é utilizado no microscópio eletrônico, possuindo uma navalha 
de vidro para realizar cortes extremamente delgados, na espessura dos nanômetros. 
 
 
 
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 corte de fragmentos incluídos em parafina 
 
Fonte: manual de técnicas histológicas do instituto biomar 
 
 
Figura 1, 2 e 3: Micrótomo manual rotativo em ilustração do processo de 
microtomia. 
 
 
 
Fonte: website vidrarias de laboratório 
 
 
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9. BANHO-MARIA 
 
Após a realização do corte pelo micrótomo, as fitas produzidas devem ser 
retiradas com o auxílio de uma pinça e encaminhadas, delicadamente, ao banho-
maria. No qual a uma temperatura de aproximadamente 40°C deve deixa-las na água 
no intuito delas se distenderem sobre a água, evitando a formação de dobras. Após 
esse processo, deve-se “pescar” esses cortes para que possam aderir as lâminas, 
que serão encaminhadas para o processo de coloração. 
 
Material necessário para a realização de cortes de parafina: A- micrótomo B -
banho frio C- banho quente 
 
Fonte: manual de técnicas histológicas do instituto biomar 
 
 
 
 
 Banho-Maria 
 
 
Fonte: manual de técnicas histológicas do instituto biomar 
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10. COLORAÇÃO 
 
Para que seja possível a observação dos cortes histológicos no microscópio 
óptico, após os procedimentos realizados, é fundamental a coloração destes devido à 
sua ausência de cor, uma vez que os cortes histológicos se encontram transparentes 
ou translúcidos. De acordo com isso, a utilização de corantes, seja por meio de 
reações químicas especiais (histoquímica), seja por meio de deposições metálicas, é 
de extrema importância para a visualização dos tecidos e das células constituídas, 
além de fazer distinção entre as diferenças das estruturas presentes nos cortes 
histológicos. Geralmente, é usado a combinação hematoxilina e eosina. Antes do uso 
de corantes, é necessária uma preparação prévia do tecido, visto que o fragmento 
histológico pode sofrer prejuízo pela falta de uma preparação, desse modo é feito 
algumas etapas antes da coloração, como a desparafinização e a hidratação. 
 
Fonte: Histologando (página do facebook criada pelas estudantes de Ciências Biológicas 
Elivânia Gomes e Carolina Alves da Universidade Federal do Ceará) 
 
 
10.1. DESPARAFINIZAÇÃO 
 
Após a microtomia, cortes dos tecidos nas lâminas estão envoltos em parafina, 
a qual não é solúvel em água, diferentemente da maioria dos corantes que são 
solúveis em água, por isso ela precisa ser removida para que os corantes possam 
penetrar e se combinar com os elementos teciduais. Desse modo, o xilol é a 
substância usualmente empregada no processo de desparafinzação. 
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10.2. HIDRATAÇÃO 
 
Após as lâminas serem desparafinadas, estas são submetidas à hidratação em 
álcool em sequência decrescente de graduação, ou seja, álcool 100%, 95%, 80%, 
70% até a forma de água destilada, com o intuito do meio ser habilitado para receber 
os corantes solúveis em água e, logo, ficam prontas para serem expostas ao corante. 
Além disso, vale ressaltar que grande parte dos corantes se encontram diluídos em 
água, devendo o último banho ser com água. Entretanto, quando se utiliza um corante 
alcoólico, deve-se interromper hidratação em álcool 70%. 
 
 
Fonte: (SHIKIRIAMA,2021) 
 
 
10.3. COLORAÇÃO 
 
Finalmente, ocorrerá a coloração da lâmina, na qual ocorre a imersão 
propriamente dita dos cortes no corante, sendo possível, posteriormente, visualizar a 
suas estruturas em um microscópio óptico. Os corantes coram os componentes 
teciduais (célula e matriz extracelular) de forma seletiva. Eles são compostos 
orgânicos aromáticos, ionizáveis e, a princípio, incolores, e para que haja cor, é 
preciso que seja adicionado um cromóforo, formando um complexo chamado 
cromógeno. Para que esse cromógeno se ligue seletivamente aos componentes 
tissulares, é necessário à sua ligação ao auxocromo, que determina o caráter ácido 
ou básico do corante. Ademais, os corantes também podem ser classificados de 
acordo com sua ação, tempo e cromatização. 
 
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Existem dois tipos de corantes os vitais e os não vitais, aqueles coram células 
em cultura e em organismos vivos, entre eles azul trypan, azul de metileno e vermelho 
neutro e, estes coram tecidos previamente fixados, como a hematoxilina e a eosina 
(HE) - combinação bicrômica considerada coloração universal em histologia e 
histopatologia. 
 
De acordo com o emprego da coloração universal (HE) nos tecidos, a 
Hematoxilina é a primeira substância a ser usada, esta por si só não é um corante, 
tornando-se um quando oxidada em hemateína e para ter afinidade com os tecidos 
precisa da utilização de um mordente, normalmente alumínio ou ferro. Dessa forma, 
ao se tornar um corante de fonte vegetal e de natureza basófila, a Hematoxilina tem 
como função corar substâncias ácidas de roxo-azulado, o núcleo da célula, por 
exemplo, é corado por essa substância em razão da presença de ácidos nucléicos, 
logo, o núcleo é um basófilo. Já a Eosina é um corante ácido a qual tem a função de 
corar substâncias básicas de rosa-alaranjado, como o citoplasma da célula, sendo 
assim um acidófilo. 
 
A lâmina é mergulhada na hematoxilina durante 3 minutos, o tempo de coloração 
para esse corante é maior devido á necessidade de mais tempo para corar as regiões 
ácidas das células. Enquanto, a lâmina mergulhada na Eosina dura, apenas, 30 
segundos. 
 
 Corador de lâminas - CITOCOLOR 
 
Fonte: Acervo próprio dos autores (2020). 
 
 
21 
 
10.4 DESIDRATAÇÃO 
 
Dando continuidade ao processo, faz-se necessário desidratar o tecido 
novamente, uma vez que a água não é miscível com os meios de selagem que são 
necessários para manter o material conservado. O procedimento é realizado utilizando 
concentrações alcoólicas crescentes: álcool 70%, 80%, 95% e 100%. 
 
10.5 CLARIFICAÇÃO 
 
Após a desidratação, o corte é banhado novamente no xilol, pois este atua como 
liquido intermediário entre o álcool e o meio de selagem. 
11. MONTAGEM DA LÂMINA (SELAGEM) 
 
Na última etapa do processamento histológico, é feito a montagem da lâmina, 
esse processo consiste em cobrir o tecido com uma lamínula de vidro. Podendo ser 
utilizado para fixar a lâmina e a lamínula, resina natural (Balsamo do Canadá) ou 
sintética (Entelan), tomando cuidado para que não haja formação de bolhas de ar 
entre as duas. Após todos esses processos, o tecido já pode ser observado através 
de um microscópio óptico. 
 
 
Adição de resina sobre a lamina para montagem. 
 
Fonte: (HISTOLOGIA VET,2007) 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte:(SHIKIRIAMA, 2021) 
 
 
 
 
12. CONCLUSÃO 
 
O processamento histológico, é um conjunto de etapas técnicas sequenciais, 
portanto, um pouco complexo. É fundamental que todas as etapas sejam executadas 
de forma correta, para obter um material de qualidade que posteriormente será objeto 
de estudo. Tendo isso em vista, é necessário que o profissional designado a realizar 
esses procedimentos tenha total atenção no manuseio dos equipamentos e produtos 
utilizados, possibilitando assim, um corte histológico de excelente qualidade, uma vez 
que o mesmo poderá ser utilizado em pesquisas acadêmicas, laboratoriais e/ou em 
diagnósticos clínicos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
 
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