12.CICLO DO ÁCIDO Cítrico

Prévia do material em texto

1 
 
Universidade Estadual do Ceará / Faculdade de Veterinária 
Bioquímica Veterinária II 
 
Prof. Dr. Genário Sobreira Santiago 
 
CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO 
1. INTRODUÇÃO 
O ciclo do ácido cítrico (também chamado ciclo de Krebs ou ciclo dos 
ácidos tricarboxílicos) desempenha diversos papéis no metabolismo. É a via final 
para onde converge o metabolismo oxidativo de carboidratos, aminoácidos e ácidos 
graxos, em que seus esqueletos carbonados são convertidos a CO2. Essa oxidação 
fornece energia para a produção da maior parte do ATP na maioria das células animais, 
incluindo humanos. 
O ciclo ocorre totalmente na mitocôndria e, portanto, está bastante próximo das 
reações de transporte de elétrons, que oxidam as coenzimas reduzidas geradas pelo 
ciclo. O ciclo do ácido cítrico é uma via aeróbia, pois o O2 é necessário como 
aceptor final dos elétrons. A maior parte das vias catabólicas do organismo converge 
para o ciclo do ácido cítrico. 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 
Origem do acetil CoA e sua 
oxidação 
2 
 
Algumas reações, tais como o catabolismo de determinados aminoácidos, 
produzem intermediários do ciclo e são denominadas reações anapleróticas. O ciclo 
do ácido cítrico também participa em diversas reações sintéticas importantes. Por 
exemplo, o ciclo funciona na formação de glicose a partir de esqueletos carbonados de 
alguns aminoácidos e fornece blocos construtivos para a síntese de alguns 
aminoácidos e do heme. Portanto, esse ciclo não deve ser visto como um ciclo 
fechado, mas sim como um ciclo de tráfego, com compostos que entram e saem de 
acordo com as necessidades do organismo. 
O grupo acetila na forma de acetil coenzima A – acetil CoA – é um intermediário 
comum no metabolismo de quase todos os compostos biológicos, podendo ser 
formado a partir de carboidratos, lipídeos e aminoácidos. Qualquer que seja a fonte, 
grande parte dela é oxidada a CO2 e H2O, mas qualquer excesso pode ser utilizado para 
a biossíntese de ácidos graxos, colesterol e corpos cetônicos, como se pode ver na 
figura 1. 
A figura 2 mostra uma visão geral do ciclo. Ele começa com uma condensação de 
acetil CoA com oxaloacetato para formar citrato e termina com a regeneração do 
oxaloacetato. Este atua como transportador para os dois átomos de carbono da acetil- 
CoA no processo cíclico, sendo regenerado em seu final. 
A oxidação completa da acetil-CoA via ciclo de Krebs, produz duas moléculas de 
CO2. Quatro pares de elétrons são retirados dos substratos e transferidos, via cadeia 
respiratória, para o oxigênio molecular. Três pares são removidos pelo NAD+ formando 
três NADH e o par restante é removido por uma flavoproteína formando FADH2. 
 A oxidação dos NADH e do FADH2, pela cadeia respiratória, produz onze 
moléculas de ATP por fosforilações oxidativas. Uma molécula de GTP é formada a 
partir de GDP, H3PO4 (Pi) e energia, fornecida pela hidrólise de um intermediário do 
ciclo rico em energia. Este processo denomina-se fosforilação em nível de substrato 
para distingui-la da fosforilação oxidativa realizada na cadeia respiratória. 
 
3 
 
2. REAÇÕES DO CICLO 
 No ciclo de Krebs o oxaloacetato é primeiramente condensado ao acetato, e a 
seguir regenerado, na medida em que o ciclo é completado. Entretanto, essas reações 
não devem ser encaradas somente como um círculo fechado, e sim como um circulo 
de trânsito, com compostos entrando e saindo conforme requerido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Ciclo do ácido cítrico 
2.1. Descarboxilação oxidativa do piruvato 
 O complexo piruvato desidrogenase é um complexo 
multienzimático localizado na matriz mitocondrial. Ele converte o piruvato, o produto 
 
 
 
 
4 
 
final da glicólise aeróbica, em acetil-CoA, um importante combustível para o ciclo de 
Krebs (figura 3). A irreversibilidade da reação impede a formação de piruvato a partir 
de acetil-CoA, e explica por que a glicose não pode ser formada a partir de acetil-CoA 
na gliconeogênese. Estritamente falando, o complexo piruvato desidrogenase não 
é parte do ciclo de Krebs, mas é uma fonte importante de acetil-CoA – o substrato de 
dois carbonos para o ciclo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.1.1. Enzimas componentes 
 
 O complexo piruvato desidrogenase é um agregado multimolecular de três 
enzimas: piruvato descarboxilase, diidrolipoil transacetilase e diidrolipoil 
desidrogenase. Cada uma delas catalisa uma parte da reação geral (figura 4). Sua 
associação física liga as reações na sequência apropriada, sem a liberação de 
intermediários. 
 
 
Figura 3 
Descarboxilação oxidativa do piruvato 
5 
 
2.1.2. Coenzimas 
 
 O complexo piruvato desidrogenase contém cinco coenzimas que agem 
como transportadoras ou oxidantes para os intermediários da reação mostrada na 
figura 4. 
 
2.1.3. Inibição pelo produto 
 
 O complexo enzimático é inibido pela acetil-CoA, que se acumula quando é 
produzida mais rápido do que pode ser oxidada pelo ciclo de Krebs. A enzima também 
é inibida por níveis elevados de NADH, o qual ocorre quando a cadeia transportadora 
de elétrons está sobrecarregada de substrato e o oxigênio é limitado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 
Mecanismo de ação do complexo piruvato desidrogenase. TPP=pirofosfato de 
tiamina; L=ácido lipóico. 
6 
 
2.1.4. Modificação covalente 
 
 O complexo piruvato desidrogenase existe nas duas formas: uma ativa, 
não fosforilada, e uma inativa, fosforilada (figura 5). As duas formas são 
interconvertidas por duas enzimas separadas, uma quinase e uma fosfatase. A quinase 
é ativada por um aumento na relação acetil-CoA/CoA ou NADH/NAD+. Um aumento na 
relação ADP/ATP, o qual sinaliza um aumento da demanda para a produção de 
energia, inibe a quinase e permite à fosfatase produzir mais enzima ativa, não 
fosforilada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.2. Síntese do citrato a partir de acetil-CoA e oxaloacetato 
 A condensação de acetil-CoA e oxaloacetato para formar citrato é catalisada 
pela citrato sintase. Essa condensação aldólica apresenta o equilíbrio bastante 
deslocado na direção da síntese do citrato. A reação utiliza um intermediário do ciclo 
 
Figura 5 
Regulação do complexo piruvato desidrogenase 
7 
 
de Krebs (oxaloacetato) e produz outro intermediário deste ciclo (citrato). Assim, a 
entrada de acetil-CoA neste ciclo não leva à produção ou consumo líquidos de 
intermediários de intermediários do ciclo. 
2.2.1. Inibidores 
 A citrato sintase é inibida por ATP, NADH, succinil-CoA e acil-CoA, derivados 
dos ácidos graxos (figura 8). A velocidade da reação também é determinada pela 
disponibilidade de substratos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6 
Formação do α-cetoglutarato a 
partir de acetil CoA e oxaloacetato 
 
 
 
Figura 7 
Formação do malato a partir do 
α-cetoglutarato 
8 
 
2.2.2. Outras funções do citrato 
 O citrato, além de ser um intermediário no ciclo de Krebs, fornece uma fonte 
de acetil para a síntese citossólica de ácidos graxos. O citrato também inibe a PFK-1, 
a enzima determinante da velocidade da glicólise e ativa a acetil-CoA carboxilase, a 
enzima limitante da velocidade da síntese dos ácidos graxos. 
 
2.3. Isomerização do citrato 
 O citrato é isomerizado a isocitrato pela aconitase (figura 6) 
2.4. Oxidação e descarboxilação do isocitrato 
 A isocitrato desidrogenase catalisa a descarboxilação oxidativa irreversível 
do isocitrato, originando a primeira de três moléculas de NADH produzidas pelo ciclo, e 
a primeira liberação de CO2 (figura 2). Esta é uma das etapas limitantes da velocidade 
do ciclo de Krebs. A enzima é ativada por ADP – níveis elevados de ADP 
mitocondrial sinalizam uma necessidade de geração de um fosfato de 
energia mais alta (ATP). A enzima é inibida por ATP e NADH, cujos níveis estão 
elevados quando a célulapossui depósitos abundantes de energia (figura 8). 
 
 
 
Figura 8 
A. Produção de coenzimas reduzidas e CO2 no ciclo de Krebs. B. 
Inibidores e ativadores do ciclo 
9 
 
2.5. Descarboxilação oxidativa de α-cetoglutarato 
 A conversão de α-cetoglutarato em succinil-CoA é catalisada pelo complexo α-
cetoglutarato desidrogenase (figura 7). O mecanismo desta descarboxilação é 
similar àquele usado para a conversão de piruvato em acetil-CoA. A reação libera o 
segundo CO2 e produz o segundo NADH do ciclo. O equilíbrio da reação está deslocado 
na direção do succinil-CoA, um tioéster de alta energia semelhante ao acetil-CoA. 
2.5.1. Coenzimas 
 As coenzimas requeridas são o pirofosfato de tiamina, ácido lipóico, 
FAD, NAD+ e CoA. Cada uma funciona no mecanismo catalítico de forma análoga à 
descrita para o complexo piruvato desidrogenase. 
2.5.2. Inibidores 
 A enzima é inibida por ATP, GTP, NADH, succinil-CoA, mas não é regulada pelas 
reações de fosforilação/desforilação, como descrito para o complexo piruvato 
desidrogenase. 
 
2.6. Clivagem de succinil-CoA 
 A succinato tioquinase cliva a ligação tioéster de alta energia do succinil-
CoA (figura 7). Esta reação e acoplada a fosforilação de GDP a GTP. O conteúdo de 
energia do GTP é o mesmo que do ATP, e os dois nucleosídeos são interconversíveis 
pela reação da nucleosídeo difosfato quinase: 
GTP + ADP ⇌ GDP + ATP 
 
2.6.1. Fosforilação em nível de substrato 
10 
 
 A geração de GTP a partir de succinil-CoA é um exemplo de fosforilação em 
nível de substrato, no qual a produção de um fosfato de alta energia é acoplada à 
conversão de substrato em produto, em vez de resultar da fosforilação oxidativa. 
2.6.2. Fontes e destinos do succinil-CoA 
 O succinil-CoA também é formado a partir de ácidos graxos com número ímpar 
de átomos de carbono, e do propionil-CoA derivado do metabolismo dos aminoácidos 
de cadeia ramificada. O succinil-CoA é usado na biossíntese do heme. 
 
2.7. Oxidação do succinato 
 O succinato é oxidado a fumarato pela succinato desidrogenase, 
produzindo a coenzima reduzida FADH2. O FAD, e não o NAD+, é o aceptor de elétrons, 
pois o poder redutor do succinato não é suficiente para reduzir o NAD+. O malonato, 
um ácido carboxílico, inibe reversivelmente a succinato desidrogenase. 
2.8. Hidratação do fumarato 
 O fumarato é hidratado até malato em uma reação livremente reversível, 
catalisada pela fumarase. 
2.9. Oxidação do malato 
 O malato é oxidado a oxaloacetato pela malato desidrogenase. Esta reação 
produz o terceiro e último NADH do ciclo (figura 9). 
 
 
 
 
 
 
Figura 9 
Formação de oxaloacetato a partir do malato 
11 
 
3. ESTEQUIOMETRIA DO CICLO DE KREBS 
 A equação geral balanceada para a oxidação completa da acetil CoA é: 
Acetil CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O ⟶ 
2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + 3 H+ + CoA 
 
Quadro 1. Reações do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória 
Acetil CoA + oxaloacetato + H2O ⇌ Citrato + CoA-SH 
Citrato ⇌ Isocitrato 
Isocitrato + NAD+ ⇌ α-cetoglutarato + NADH + H+ 
NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + 1/2O2 ⟶ NAD+ + 4 H2O + 3 ATP 
α -cetoglutarato + NAD+ + CoA-SH ⟶ Succinil-CoA + NADH + H+ + CO2 
NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + 1/2O2 ⟶ NAD+ + 4 H2O + 3 ATP 
Succinil CoA + GDP + Pi + H2O ⇌ Succinato + GTP + CoA-SH + H2O 
GTP + ADP ⇌ GDP + ATP 
Succinato + FAD ⇌ Fumarato + FADH2 
FADH2 + 2 ADP + 2 Pi + 1/2O2 ⟶ FAD + 3 H2O + 2 ATP 
Fumarato + H2O ⇌ L-malato 
L-malato + NAD+ ⇌ Oxaloacetato + NADH + H+ 
NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + ½ O2 ⟶ NAD+ + 4 H2O + 3 ATP 
Acetil CoA + 12 ADP + 12 Pi + 2 O2 ⟶ 2 CO2 + 13 H2O +CoA-SH + 12 ATP 
Fonte: FIGUEIREDO (1999) 
 
 Como esta reação é realizada em etapas pelas reações do ciclo do ácido cítrico, 
é útil examinar-se a estequiometria em detalhes. 
 Há quatro reações de oxidação. Em cada uma delas, um par de elétrons e um 
par de prótons são removidos dos substratos e transferidos para três moléculas de 
NAD+ e uma molécula de FAD. Como vemos no quadro 1, a oxidação destas quatro 
coenzimas, por meio da cadeia respiratória, resulta na redução de quatro átomos de 
12 
 
oxigênio, formando-se quatro moléculas de H2O. Onze outras moléculas de água são 
formadas nas reações de fosforilação de onze moléculas de ADP (quadro 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10 
Principais origens da acetil CoA na célula e seu mais importante destino metabólico 
via ciclo de Krebs e cadeia respiratória 
 
 Examinando-se as reações do ciclo, pode-se notar que duas moléculas de água 
foram consumidas nas reações de formação do citrato e do L-malato. 
13 
 
 Duas moléculas de CO2 são produzidas nas reações do ciclo, exatamente nas 
etapas de formação do α-cetoglutarato e da succinil-CoA. Estas duas moléculas de CO2 
são equivalentes aos dois átomos de carbono do acetil-CoA (figura 1 e quadro 1). 
 A reação de descarboxilação do α-cetoglutarato, análoga à reação de 
descarboxilação do piruvato, é irreversível; as demais reações do ciclo de Krebs são 
reversíveis. Por isso, embora apresentando reações reversíveis, o ciclo de Krebs não 
pode funcionar na direção reversa. 
 Onze moléculas de ATP são biossintetizadas a partir de ADP, Pi e energia 
fornecida pela oxidação de três moléculas de NADH e uma molécula de FADH2, através 
da cadeia respiratória. A molécula restante de ATP é biossintetizada a partir de GTP e 
ADP; o GTP formou-se, por fosforilação em nível de substrato quando da hidrólise de 
succinil-CoA. O quadro 1 mostra as reações do ciclo de Krebs e o armazenamento de 
energia, na forma de ATP. 
 A oxidação completa do ácido acético no calorímetro libera 209.000 cal. 
Quando uma molécula de ácido acético, ativada sob a forma de acetil-CoA, é oxidada 
até CO2 e H2O no ciclo de Krebs, 144.000 cal são armazenadas em doze moléculas de 
ATP, correspondente a um rendimento de 66 %. 
 A figura 10 mostra as principais origens do acetil-CoA, o ciclo de Krebs e a 
cadeia respiratória integrados. 
 
4. REGULAÇÃO DO CICLO DE KREBS 
4.1. Regulação por ativação e inibição da atividade enzimática 
 Em contraste à glicólise a qual é regulada primariamente pela fosfofrutocinase, 
o ciclo de Krebs é controlado pela regulação de várias atividades enzimáticas (figura 8). 
As mais importantes destas enzimas reguladoras são a citrato sintase, isocitrato 
desidrogenase e complexo α-cetoglutarato desidrogenase. 
14 
 
4.2. Regulação pela disponibilidade de ADP 
4.2.1. Efeitos do ADP elevado 
 O consumo de energia devido à contração muscular, reações biossintéticas ou 
outros processos resulta na hidrólise de ATP em ADP e Pi. O resultante aumento na 
concentração de ADP acelera a velocidade das reações que utilizam ADP para gerar 
ATP, a mais importante das quais é a fosforilação oxidativa. A produção de ATP 
aumenta até que atinja a velocidade de consumo de ATP pelas reações que requerem 
energia. 
4.2.2. Efeito do ADP de baixo 
 Se o ADP está presente em concentrações limitantes, a formação de ATP por 
fosforilação oxidativa diminui devido à falta de aceptor de fosfato (ADP). A velocidade 
da fosforilação oxidativa é proporcional à [ADP][Pi]/[ATP]. Isto é conhecido como 
controle respiratório da produção de energia. A oxidação de NADH e FADH2 pela 
cadeia respiratória também cessa se o ADP é limitante. Isto ocorre porque os 
processos de oxidação e fosforilação são intimamente acoplados e devem ocorrer 
simultaneamente. À medida que o NADH e FADH2 se acumulam, suas formas oxidadas 
tornam-se depletadas, provocando a inibição da oxidação de acetil-CoA no ciclo de 
Krebs, devido à falta de coenzimas oxidadas. 
 
5. LEITURA 
“Como nasceu a idéia do ciclo do ácido cítrico” 
 Esta é uma questão muito natural, pois a existência de um ciclo tão complexo 
para a oxidação dos grupos acetil de dois carbonos até CO2, através do ácido cítrico de 
6 carbonos, pode parecer desnecessariamente complicada e em desacordo com o 
princípio daeconomia máxima da lógica bioquímica das células vivas. 
 O ciclo do ácido cítrico foi, pela primeira vez, postulado como a via de oxidação 
do piruvato nos tecidos animais em 1937 por Sir Hans Krebs. A ideia do ciclo 
15 
 
ocorreu-lhe durante um estudo sobre o efeito apresentado pelos ânions de vários 
ácidos orgânicos sobre a velocidade de consumo do oxigênio por suspensões de 
músculos peitorais de pombo durante a oxidação do piruvato. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 O músculo peitoral do pombo é usado durante o vôo e tem uma velocidade de 
respiração muito alta, sendo, assim, especialmente apropriado para o estudo da 
atividade oxidativa. Investigações anteriores realizadas por Albert Szent-Györgyi, na 
Hungria, haviam demonstrado que certos ácidos orgânicos dicarboxílicos com 4 
átomos de carbono na molécula e sabidamente presentes em tecidos animais, os 
ácidos succínico, fumárico, málico e oxaloacético estimulavam o consumo de 
oxigênio pelo músculo. 
 Krebs confirmou estas observações e descobriu que os mesmos ácidos também 
estimulavam a oxidação do piruvato. Além disso, ele verificou que a oxidação do 
piruvato pelo músculo também era estimulada pelos ácidos de 6 átomos de carbono e 
tricarboxílicos – cítrico, cis-aconítico e isocítrico, como também pelo ácido α-
cetoglutárico que tem 5 átomos de carbono na molécula. As estruturas desses ácidos 
estão mostradas na figura 2. Nenhum outro ácido orgânico de ocorrência natural, 
quando testado, mostrou possuir tal atividade. A ação estimuladora dos ácidos ativos 
era notável uma vez que mesmo a adição de diminutas quantidades de qualquer um 
deles podia promover a oxidação de quantidades várias vezes maior de piruvato. 
16 
 
 A segunda observação importante feita por Krebs foi a de que o malonato 
(figura 11), um inibidor competitivo da desidrogenase succínica inibia a utilização 
aeróbica do piruvato pelas suspensões, não importando a adição de qualquer um dos 
ácidos orgânicos possuidores de atividade estimuladora. Isto indicava que o succinato 
e a desidrogenase succínica deviam ser componentes essenciais das reações 
enzimáticas envolvidas na oxidação do piruvato. Mais ainda, Krebs encontrou que 
quando o malonato é usado para inibir a utilização aeróbica do piruvato por 
suspensões de tecido muscular ocorre um acúmulo de citrato, de α-cetoglutarato e de 
succinato no meio de suspensão, sugerindo que o citrato e o α-cetoglutarato são 
convertidos normalmente em succinato quando o malonato não está presente. 
 
 
 
 
 
 
Destas observações básicas e de outas evidências, Krebs concluiu que os ácidos 
di e tricarboxílicos citados acima podiam ser arranjados em uma sequência química 
lógica, onde cada passo é uma transformação química simples catalisada por uma 
enzima específica. Além disso, como a incubação de piruvato e oxaloacetato com 
tecido muscular macerado resultava no acúmulo de citrato no meio, Krebs também 
concluiu que esta sequência funciona de forma circular antes que linear, de tal forma 
que o seu início e o seu fim estão unidos. Para o elo que fechava o ciclo, e que estava 
faltando, ele propôs a reação: 
𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 𝑜𝑥𝑎𝑙𝑜𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑡𝑜 → 𝑐𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 + 𝐶𝑂2 
 A partir destes experimentos simples e do raciocínio lógico, Krebs postulou o 
que ele chamou de ciclo do ácido cítrico como a via principal de oxidação dos 
Figura 11 
Malonato é análogo do 
succinato e potente 
inibidor competitivo da 
enzima succinato 
desidrogenase 
17 
 
carboidratos do músculo. Nos anos seguintes a sua descoberta o ciclo do ácido cítrico 
tem sido encontrado não apenas no músculo, mas em virtualmente todos os tecidos 
dos animais e plantas superiores e em muitos microrganismos aeróbicos. Por esta 
importante descoberta, Krebs recebeu o Prêmio Nobel de 1953, juntamente com Fritz 
Lipmann, o “pai” do ciclo do ATP. 
 
6. BIBLIOGRAFIA 
CHAMPE, P. C., HARVEY, R. A. Bioquímica Ilustrada. Porto Alegre: Artes Médicas, 1996, 
446p. 
FIGUEIREDO, A. F. S. Oxidações biológicas. In: VIEIRA, E. C., GAZZINELLI, G., MARES-
GUIA, M. Bioquímica celular e biologia molecular. São Paulo: Atheneu, 1999. p. 151- 
178. 
LEHNINGER, A. L., NELSON, D. L., COX, M. M. Princípios de bioquímica. São Paulo: 
SARVIER. 1995, 839p.