Como é feito pcr em tempo real ?

Bioquímica I

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IBMR

Luciene Barbosa de melo

05/10/2022

Respostas

Estudante PD

05.10.2022

DESNATURAÇÃO
DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
ANELAMENTO OU HIBRIDIZAÇÃO

Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.
EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO

Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C.

AULAS VÍDEO

05.10.2022

mUITO

Estudante PD

06.10.2022

A tecnologia de PCR em Tempo Real (qPCR) é uma evolução do método de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase). Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias.

A PCR foi desenvolvida no final dos anos 80 por Kary Mullis que posteriormente ganhou o Prêmio Nobel de Química pelo feito. Além de revolucionar as técnicas de genética molecular, sua aplicação compreende várias áreas como identificação genética, medicina forense, análises clínicas, diagnóstico de doenças, controle de qualidade industrial, entre outros.

Os ensaios de PCR em Tempo Real são muito mais sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais, levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado.

Para diagnósticos, são amplamente utilizados na infectologia clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções virais e bacterianas, em que a cultura dos agentes causadores pode ser muito difícil ou até mesmo impossível. Este método não depende do isolamento ou crescimento do patógeno ou da detecção de uma resposta imune contra o agente.

Em vez disso, o que é detectado nos ensaios são as sequências de ácidos nucleicos dos patógenos. Alguns exemplos de sua aplicação consistem no diagnóstico de dengue, infecções respiratórias, ISTs, anteriormente chamada de DSTs, e meningites.

É utilizada também no diagnóstico de doenças genéticas, identificando mutações e pré-disposição genética para determinadas doenças, como é o caso da trombose.

Essa técnica molecular também é utilizada na oncologia para identificação do cromossomo Philadeplhia, uma alteração citogenética que está associada a algumas formas de leucemia.