05 PCR, ELETROFORESE, SEQUENCIAMENTO

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PCR, ELETROFORESE, 
SEQUENCIAMENTO
PCR (Polimerase Chain Reaction)
Precisa-se de fragmentos de DNA de cadeia dupla, primers para a sequência de DNA que precisam ser 
replicadas, desóxinucleotídeos trifosfatados livres (nucleotídeos de DNA com grupamentos de 3 
fosfatos, também necessários in vivo, pois as DNA-polimerases só agem na existência desses 
nucleotídeos) e Taq-Polimerase (polimerase retirada de bactérias resistentes ao calor, termófilas, fontes 
termais), um tipo de DNA-polimerase que permanece estável às temperaturas do processo.
Em laboratório, uma máquina chamada termociclador aquece as amostras de DNA até cerca de 94-98 
ºC, separando as duas fitas (quando mais pares G-C, mais pontes de hidrogênio, necessitando de mais 
energia para serem separadas).
A temperatura é reduzida até 45-65 ºC primers se ligam às fitas (anelamento) e iniciam a síntese de 
novas fitas (65-75 ºC, sendo 72 ºC a temperatura ótima da Taq-Polimerase).
Esses ciclos são repetidos diversas vezes, fazendo várias cópias de determinada sequência do DNA.
OBS: na replicação in vitro (no laboratório), há a necessidade de cloreto de magnésio, uma vez que o 
magnésio é um cofator importante da Taq-Polimerase.
Esquema de PCR
Como seria a programação de um termociclador
O indivíduo que programa o 
termociclador pode escolher as 
temperaturas nas diferentes partes 
do ciclo e quantas vezes o ciclo deve 
ser repetido.
Eletroforese
Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços 
de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente 
carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA 
deve migrar através do gel de agarose. 
Quando inicia-se esse processo, fala-se em “correr” as amostras no gel.
Sabe-se que a velocidade da amostra no gel é inversamente proporcional ao tamanho de cada fragmento 
(quanto menor o fragmento mais rápido). E isso permite que possamos determinar o tamanho de cada 
fragmento em relação à sua distância do ponto inicial no final da corrida.
Esquema de eletroforese
Os marcadores de peso molecular 
ajudam a determinar o tamanho 
dos fragmentos
Sequenciamento (Método de Sanger)
Desenvolvido por Friederich Sanger e colaboradores na década de 70.
Esse método usa didesóxinucleotídeos trifosfatados(ddNTPs, os mesmos 
usados no PCR usual mas sem o grupamento hidroxila no carbono 3’), que 
quando se juntam à fita polimerizada não deixam que se faça uma ligação 
fosfodiéster, justamente pela ausência da hidroxila no carbono 3’, “travando” a 
polimerização da cadeia.
Sequenciamento (Método de Sanger)
As cadeias são elongadas por métodos parecidos com o PCR atual, ainda pouco 
desenvolvidos na época, utilizando um primer, uma fita simples, DNA-
polimerase, desóxinucleotídeos trifosfatados (dNTPs) e 
didesóxinucleotídeos trifosfatados (ddNTPs). Durante o elongamento 
(polimerização da cadeia), quando um ddNTP se liga à cadeia, a polimerase não 
realiza mais a ligação entre outros nucleotídeos. Esse processo gera fragmentos 
de diversos tamanhos.
As amostras são preparadas realizando esse processo com cada tipo de ddNTPs 
(um de A, um de T, um de C, um de G), e cada amostra é corrida em um poço de 
gel de agarose diferente na eletroforese.
Esquema do Método de Sanger
Como já sabemos a sequência do 
primer, podemos determinar o DNA 
complementar e, consequentementem a 
cadeia original.
Veja que os fragmentos menores estão 
mais embaixo no esquema ao lado (a 
ordem correta se lê do último ddNTP do 
menor fragmento até o o do maior, 
debaixo para cima no caso).
A sequência da cadeia complementar 
seria: 5’-GATTCGAGCTGA-3’
Sequenciamento atualmente
Hoje em dia, o processo de Sanger foi aprimorado. Os ddNTPs são marcados por 
fluorescências diferentes e os fragmentos são “lidos” por lasers que detectam a 
diferença das cores emitidas ao passar por pequenos capilares.
Esses dados são computados e emitidos como no seguinte esquema, mostrando 
a sequência já pronta de forma rápida e precisa (veja que cada nucleotídeo é 
marcado com uma fluorescência diferente):
Técnica do cDNA
Para medir quantitativamente o nível de expressão 
de certo gene em determinado 
tecido/órgão/indivíduo unicelular, utiliza-se a 
técnica do cDNA.
Um mRNA, já sem os íntrons (ou seja, já 
processado), é colocado junto a um primer que 
permite com que uma transcriptase reversa 
sintetize uma cadeia de DNA complementar 
(cDNA) que pode ser amplificado diversas vezes 
por PCR. A partir da quantidade de cadeias 
sintetizadas e pela quantidade de ciclos, pode-se 
quantificar a expressão daquele gene.