A energia gerada pelo metabolismo dos ácidos graxos é mais lenta, porém mais eficiente porque os ácidos graxos livres, liberados da quebra dos triglicerídeos, precisam passar por etapas antes de gerar ATP. Primeiro, esses ácidos graxos são ativados no citoplasma, formando acil-CoA, e depois transportados para a mitocôndria via a carnitina (transporte carnitina-shuttle). Dentro da mitocôndria, os ácidos graxos passam pelo processo de β-oxidação, que quebra as moléculas em unidades de acetil-CoA. O acetil-CoA então entra no ciclo de Krebs, gerando NADH e FADH2, que alimentam a cadeia respiratória para a produção de ATP. Esse processo é mais lento que a glicólise, mas produz muito mais ATP por molécula de substrato, tornando-o energeticamente eficiente.