trabalho proteomica

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3 PERGUNTAS E RESPOSTAS SOBRE OS ARTIGOS:
Grupo 1: Luciane, Maria Cristina, Sabrina e Mariana
Comparative Serum Proteomic Analysis of the Effects of Sodium Selenate on a Mouse
Model of Alzheimer’s Disease
1) Qual a importância da utilização de Eletroforese 2D e MALDI, TOF e MS/MS ?
Baseado no estudo descrito neste artigo fica claro que a utilização destes
métodos foram aplicados com objetivo de identificar as proteínas para compará-las.
Estes métodos de eletroforese foram escolhidos no estudo em questão, por serem
altamente sensíveis e reprodutíveis, auxiliando na análise da expressão das
proteínas séricas e das possíveis diferenças de expressão que o uso do selenato de
sódio pode ocasionar.
2) Como foi feita a determinação dos efeitos específicos do selenato de sódio nos ratos
que apresentavam a Doença de Alzheimer? Descreva brevemente sobre o método
utilizado.
A determinação dos efeitos do selenato de sódio nos ratos que
apresentavam a Doença de Alzheimer foi feita através de análise proteômica
2D-DIGE das amostras de soro dos grupos de ratos transgênicos-AD que haviam
sido tratados com ou sem o selenato de sódio, que demonstraram a expressão
diferenciada das proteínas nos 3 grupos testados.
O método 2D-DIGE foi realizado a partir de amostras de sangue dos 3
grupos testados, 1 fração das proteínas pouco comuns do soro foi coletada e eluida
em tampão especial de DIGE. Após, a concentração das proteínas foi medida
através de kits 2D. Elas então foram marcadas e coradas com CyDyefluors (Cy2,
Cy3 e Cy5), e foram comparadas entre elas. Usando-se 50 µg de proteína corada
com 400 pmol de fluorocromo, reagindo por 30 minutos, no gelo e no escuro,
seguidos de arrefecimento brusco com adição de 1µL de lisina 10 mM e incubação
no gelo por 10 minutos. Após, as proteínas marcadas foram misturadas e
adicionadas à um igual volume de tampão DIGE, e passaram por focalização
isoelétrica. Após a execução da focalização isoelétrica, as proteínas foram reduzidas
e alquiladas por 15 min no mesmo tampão contendo 0,03 g mL − 1 de
iodoacetamida. E foi realizada a separação das proteínas através de eletroforese
2D.
3) Segundo o artigo, como foram medidos os efeitos do selênio nos grupos teste e
como estes resultados podem ser interpretados?
No artigo o método usado para analisar a expressão diferencial das proteínas
foi o 2D-DIGE, um método bastante sensível. Assim, os efeitos específicos do
selênio foram medidos de acordo com as alterações nos padrões de expressão das
proteínas, comparando-se os soros dos 3 grupos testados. Estas análises
mostraram 15 proteínas séricas com expressão diferencial entre os ratos
transgênicos-AD que foram tratados com ou sem selenato de sódio, sendo que, a
expressão de algumas destas proteínas foi modulada com o uso do selenato de
sódio.
Grupo 2: Rafael, Mabelle, Lucas, Gustavo e Hadassa.
The molecular make-up of a tumour: proteomics in cancer research
1) Por que a eficiência da ionização é um fator importante a ser aprimorado em
análises de espectrometria de massa?
2) Qual a importância do 2DGE ( two-dimensional gel electrophoresis ) e suas
aplicações ? Por mais de 30 anos a base das expressões de proteínas tem sido o
2DGE, onde as proteínas são separadas de acordo com seu ponto isoelétrico e
usando o seu foco isoelétrico na primeira dimensão, e pelo tamanho utilizando
SDS/PAGE na segunda dimensão. Muitos estudos têm sidos realizados mostrando
que 2DGE pode detectar diferenças entre os proteomas de células normais e
células cancerígenas.
3) Qual a importância do desenvolvimento de matrizes de proteínas e seus designs ?
O desenvolvimento é muito importante, pois permite estudar mudanças na
expressão ou modificação de proteínas em escala global. Basicamente tem 2
designs: FPA ( matriz de fase direta), onde os anticorpos são dispostos e sondados
com lisados celulares, ou o RPA ( matriz de fase reversa ), onde os anticorpos são
dispostos e sondados com lisados celulares.
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Grupo 3: Ana, Ilana, Luiza e Andrielle;
Proteomic Analysis of the Breast Cancer Brain Metastasis Microenvironment
1) .No que se baseia a cromatografia de imunoafinidade?
Cromatografia de afinidade que na fase estacionária consiste de um
anticorpo relacionado a um antígeno. Essa técnica fundamenta-se na
interação fraca que envolve apenas ligações covalentes, principalmente de
Van der Waals e eletrostáticas, entre um anticorpo e um antígeno.
2) .Qual a importância da via da pentose fosfato?
A via da pentose fosfato é importante para atender aos requisitos de energia
e purinossíntese em metástases cerebrais, utilizando glutamina e substratos
BCAA no líquido intersticial cerebral
3) . Explique a técnica de Sequential Window Acquisition of All Theoretical
Mass Spectra (SWATH-MS):
SWATH-MS é um método de aquisição independente de dados (DIA) que
visa complementar as técnicas proteômicas tradicionais baseadas em
espectrometria de massa, como os métodos Shotgun e SRM. Em essência,
permite um registro completo e permanente de todos os íons fragmentos dos
precursores de peptídeos detectáveis presentes em uma amostra biológica.
Grupo 4:
Ilana da Silva, Vinícius, Laís, Jean
Proteomic maps of breast cancer subtypes
1.De que forma a tecnologia super-Silac auxilia na quantificação de proteínas de
células tumorais?
Nessa tecnica utiliza-se uma mistura de células marcadas com SILAC, que
consiste de um lisado combinado de diferentes linhagens celulares de câncer
de mama, a partir da marcação de isótopos estáveis dos aminoácidos lisina e
arginina. Essa mistura de células marcadas é utilizada como padrão de pico,
permitindo assim a quantificação precisa dos proteomas do tumor.
2.Em que etapa da análise proteômica é utilizado o protocolo FFPE-FASP e qual é a
principal protease utilizada no processo?
O protocolo FFPE-FASP é utilizado para extração de proteínas e posterior
obtenção de peptídeos de amostras de tecido oriundas de biobancos, onde
geralmente estão conservados por FFPE, ou seja, fixados em formalina e
embebidas em parafina. A principal protease utilizada é a tripsina.
3.De acordo com a análise de dados proteômicos já descritos, que conjunto de
genes destaca o potencial de distinção entre os subtipos do câncer de mama a nível
proteômico?
As análises demonstram diversas similaridades entre mRNA e níveis
proteicos para o os genes PAM50, e destacam o potencial para distinguir
entre os subtipos clássicos de câncer de mama a nível proteômico.
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Grupo 5 Lucas, Mabelle, Rafael, Hadassa, Gustavo
1-Qual a importância do 2DGE ( two-dimensional gel electrophoresis ) e suas aplicações ?
Por mais de 30 anos a base das expressões de proteínas tem sido o 2DGE, onde as
proteínas são separadas de acordo com seu ponto isoelétrico e usando o seu foco
isoelétrico na primeira dimensão, e pelo tamanho utilizando SDS/PAGE na segunda
dimensão. Muitos estudos têm sidos realizados mostrando que 2DGE pode detectar
diferenças entre os proteomas de células normais e células cancerígenas.
2-Qual a importância do desenvolvimento de matrizes de proteínas e seus designs ?
O desenvolvimento é muito importante, pois permite estudar mudanças na expressão ou
modificação de proteínas em escala global. Basicamente tem 2 designs: FPA ( matriz de
fase direta), onde os anticorpos são dispostos e sondados com lisados celulares, ou o RPA
( matriz de fase reversa ), onde os anticorpos são dispostos e sondados com lisados
celulares.
3-no que consiste a tecnologia de eletroforese capilar (CE) ?
consiste na migração de substâncias carregadas eletricamente, isto ocorre quando as
mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente
elétrica é aplicada. Esta técnica combina o alto poder de separação com a alta resolução e
sensibilidade do TOF MS.