Espectrometria

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Universidade Estadual Paulista “Julio Mesquita Filho”Unesp Rio Claro
 Relatório 2
Cromatografia Líquida e Espectrômetro de Massas 
Discente:	
Vivian Batista Purificação
Docentes:
Mario Palma
Disciplina:	
Proteômica
Rio Claro – Jun/2016
1. Introdução:	
A cromatografia é uma técnica de extrema importância, pois em uma única etapa consegue separar os componentes individuais de uma amostra. Tal separação é conseguida a partir da distribuição dos componentes de uma mistura entre duas fases, uma fase estacionária e uma fase móvel.
A cromatografia pode ser dividida em três diferentes técnicas, a cromatografia gasosa (GC) que separa, como o próprio nome diz, gases e substâncias voláteis, e cromatografia líquida (LC) ou cromatografia de camada fina (TLC), que separa produtos químicos voláteis e materiais de alta e baixa massa molecular.
Hoje em dia é comum o acoplamento de técnicas de separação com técnicas de identificação, sendo que um dos acoplamentos mais comuns é entre um cromatografo liquido e um espectrômetro de massas.
Com relação a espectrometria de massas, ele é um instrumento analítico que converte componentes de uma amostra em íons gasosos e mede suas massas, nele os íons são separados de acordo com sua relação massa/carga (m/z). ESI e MALDI são, atualmente, as duas interfaces mais utilizadas, juntamente com recursos para acompanhar as fragmentações.	Tal equipamento é composto por cinco partes principais: um sistema de injeção de amostra, uma fonte de íons, um analisador, um detector e um processador de dados.
2. Objetivo:
	A aula prática teve como objetivo mostrar a utilização de um Espectrômetro de massa em conjunto com um aparelho de cromatografia líquida, e como analisar os resultados obtidos.
	Vale ressaltar que nenhuma das etapas do espectrômetro ou do cromatografo foram realizadas, a aula prática foi uma explicação do funcionamento dos aparelhos. 
3. Materiais e Métodos:
3.1 Cromatografia:
3.1.1 Cromatografia Líquida:
A cromatografia líquida, pode ser resumida, de forma geral, da seguinte maneira:
• A amostra é solubilizada em um solvente específico e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE).
• A fase móvel (FM) é bombeada com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades.
• As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente.
• Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.
• O material deste pico é então coletado e posteriormente submetido à análise estrutural.	
3.2 Técnicas de Cromatografia:
3.2.1 Cromatografia de gel filtração:
Nesse método a separação de proteínas é feita com base em suas características hidrodinâmicas. Dessa forma, deixa-se fluir a mistura através de uma coluna preenchida com gel, equilibrada em eluente adequado, na coluna as proteínas maiores não passam pelos poros das partículas de gel e são eluidas mais rapidamente do que as proteínas menores.
3.2.2 Cromatografia de Troca iônica:
Como as proteínas são moléculas portadoras de carga, tal técnica se baseia nas interações eletrostáticas que podem ocorrer com resinas ligadas a grupos ionizáveis. Logo, a escolha da resina a ser utilizada é de grande importância, sendo que ela deve ser adequando ao seu empacotamento na coluna e ao tampão que será utilizado. Quando se aplica a amostra na coluna, todas as proteínas serão ligadas a ela e a partir daí se aplica um aumento de força iônica ao meio através do uso de um gradiente de sal.
3.2.3 Cromatografia de Afinidade:
Tal técnica se baseia na interação das proteínas com um ligante de alta especificidade físico-química. Na cromatografia de afinidade hidrofóbica as proteínas são separadas segundo seu grau de hidrifobicidade superficial e podem ser desacopladas da resina por alterações (aumento ou diminuição) da força iônica do meio ou da polaridade do sistema.
3.2.4 Cromatografia de fase reversa:	
Essa técnica se baseia na hidrofobicidade das moléculas a serem analisadas. Além de sua utilidade analítica, a cromatografia de fase reversa, também pode ser utilizada para a purificação de moléculas. Logo a cromatografia liquida sob fase reversa tem sido uma das mais utilizadas, atualmente. 
3.2.4.1 Principais etapas do processo de separação por cromatografia de fase reversa:
A cromatografia de fase reversa pode ser simplificada em algumas etapas, sendo elas:
- A coluna deve ser equilibrada com a fase móvel, sendo que a polaridade desta fase móvel pode ser controlada pela adição de solventes orgânicos tal como acetonitrila.
- A amostra deve ser aplicada, sendo o ideal, que a amostra seja dissolvida na mesma fase móvel utilizada para equilibrar a coluna.
- Os compostos que ficarem absorvidos na matriz cromatográfica eluirão da coluna de acordo com a variação da hidrofobicidade da fase móvel. Este passo é concluído mantendo-se constante uma alta concentração de solvente orgânico na fase móvel a fim de promover a remoção de compostos que ainda permanecem adsorvidos na matriz da coluna.
- Por último, ocorre o re-equilíbrio da coluna. Para isso, as condições iniciais da fase móvel são restabelecidas.
3.3 Espectrômetro de Massas:
Um resumo simples de como ocorre o funcionamento de tal equipamento, é: 
- Amostras são introduzidas no espectrômetro de massas através do sistema de injeção.
- Ao alcançar a fonte de íons, a amostra é convertida em íons, através do método de ionização, que pode ser feito por bombardeamento de elétrons, íons, moléculas ou fótons, ou por energia termo elétrica.
- O resultado da etapa anterior é uma nuvem de íons carregados positiva ou negativamente, que deixam a fonte e são acelerados para dentro do analisador de massas.
- O espectrômetro é classificado de acordo com o tipo de analisador e de separação que faz, um dos mais comuns é o TOF que separa os íons de acordo com o tempo que os íons levam para viajar dentro de um tubo de voo.
- Depois de separados, os íons vão para o detector. 
- Por último, após ser detectado, o sinal é processado e analisado por sistemas modernos de computadores.
	3.3.1 Equipamentos:
		3.3.1.1 MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption):
MALDI é um método que produz vaporização e ionização de macromoléculas biológicas não voláteis, direto da fase sólida para a fase gasosa. O analito é misturado com uma matriz, a presença da matriz protege o analito de degradação, transferindo parte da energia vinda do laser às macromoléculas, resultando em uma leve ionização, permitindo assim, a detecção numa forma intacta.
		3.3.1.2 Reflectron:
Os espectrômetros do tipo TOF, podem ou não possuir em reflectron (reflector) harmônico, que age como um espelho de íons. O reflector é um instrumento importante, pois permite aumentar o curso de voo dos íons.
O detector por sua vez fica localizado na entrada do reflector para poder capturar a chegada dos íons após eles serem refletidos. Existem dois métodos comuns para o posicionamento do detector: (1) coaxial em relação à direção inicial do feixe de íons e (2) não-axial com respeito à direção inicial do feixe de íons.
3.3.1.3 Ion Trap:
O método por ion trap, consiste no armazenamento de todos os íons criados por um período de tempo em uma armadilha e então sequencialmente expulsos da desta para o detector. Assim, todos os íons são armazenados enquanto a análise de massa é executada.
As armadilhas são formadas por um conjunto de eletrodos de seção hiperbólica, sendo dois centrais e dois terminais, formando uma espécie de câmara entre os eletrodos. O espectro de massas é obtido aplicando-se voltagens RF de amplitude variável e frequência fixa no eletrodo central, sendo os eletrodos terminais aterrados. Os íons que apresentam m/z acima de certo valor determinado pela amplitude RF, têm trajetórias que os mantêm dentro do eletrodo, os demais íons vão sendo expulsos sequencialmente.
3.3.1.4 Processadores:
Todo o equipamento do espectrômetro e os dados obtidos são controlados por uma estação de trabalho. 
Ao serem detectados, os íons são entendidos como sinais, pelo detector, e transformados em sinais analógicos. Logo após serem obtidos e interpretados, os dados são tratados através de um software que converte tais dados para um formato adequando para cada tipo de análise.
Os dados por fim são organizados e transformados em gráficos de intensidade por m/z chamados de espectros de massas, a partir deles é possível obter informações sobre a massa dos compostos, a massa dos fragmentos, presença de isótopos, padrão de fragmentação de determinados compostos e mais recentemente, com a técnica de PSD, o sequenciamento primário de cadeias polipeptídicas. 
4. Resultados e Discussão:
Ao final da explicação sobre o funcionamento dos aparelhos, um espectro de massa obtido a partir de uma Espectrometria de Massas de Peptídeos, já preparado foi entregue para os alunos para explicação e análise dos resultados de uma amostra já conhecida.
Segue abaixo a imagem do espectro de massa obtido como resultado.
Imagem 1: Espectro de massa dado em aula prática para ensinamento da análise de resultados.
No gráfico, pode ser observado, no eixo x, a representação da massa/carga dos peptídeos identificados, e no eixo y, a intensidade com que o peptídeo aparece na amostra.
A análise do gráfico é feita, subtraído os valores das massas uma da outra, da direita para a esquerda, por exemplo, do último pico de valor 628,38 é subtraído 612,40 (penúltimo pico), dando um resultado de 15,98, aproximadamente 16, logo sabe-se que o peptídeo analisado se inicia em uma região N-terminal, caso a subtração tivesse dado 18, o peptídeo se iniciaria em um ramo C-terminal.
As subtrações continuam sempre subtraindo o pico anterior do próximo, ou seja, antepenúltimo do penúltimo e assim por diante.
Os valores encontrados são relacionados com valores de uma tabela, que também foi dada em aula, imagem a seguir:
Imagem 2: Tabela contendo os valores das massas médias dos aminoácidos.
Com base em tal tabela, é possível saber quais são os aminoácidos que formam o peptídeo que está sendo analisado.
Os resultados das subtrações, fez com que se chegasse no seguinte peptídeo:
HO- Leu; Ile; Thr; Gly; Leu; Ile -NH2.
5. Conclusão:	 
A aula foi muito produtiva, com ela foi possível entender a importância de tais aparelhos na descoberta de novas proteínas/peptídeos e na identificação dos já existentes que compõe diversos tipos de substancia biológicas.
6. Referências:
PALMA, M.S et. al. Material de Apoio: Curso de formação de Recursos Humanos em Análise Proteômica. Centro de Estudos de Insetos Sociais –CEIS, Departamento de Biologia UNESP – Rio Claro, p. 23-37 e 46-73. 
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