AD2 Aula 8 - Testes Sorológicos

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Testes Sorológicos
Prof. Dr. Ed Wilson Santos
	São testes realizados com base nas reações Ag-Ac in vitro
O que são testes sorológicos?
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Segundo nível
Terceiro nível
Quarto nível
Quinto nível
Conceitos gerais
Testes qualitativos
X
Testes quantitativos
Resultados: 
+ ou –
Reagente ou Não-reagente
Resultados: 
Em título do soro ou diluição
Algumas situações em que podem ser utilizados...
 Como exames complementares no fechamento de diagnóstico
 Para diferenciar a fase da doença 
 Para avaliar o prognóstico da doença
 Na avaliação de tratamento de doenças
 Na avaliação da resposta imune adquirida de forma natural ou artificial
 Para estabelecer prevalência da doença em inquéritos epidemiológicos
Principais exames sorológicos
Imunofluorescência
Radioimunoensaio
ELISA
Citometria de fluxo
Western blotting
Aglutinação
Precipitação
Fixação do complemento
Imunocromatografia
Podem ser feitas identificações de Ag ou de Ac
Antígeno padrão conhecido
Anticorpos de especificidade conhecida
Reação macroscópica
Reação macros-cópica
Reação molecular
Reação molecular
Colônia bacteriana isolada
Pergunta: os Ags do microrganismo da amostra clínica reagem com Ac conhecido?
Soro do animal
Pergunta: tem Ac específicos para o agente suspeito?
Imunofluorescência (IF)
Utiliza Anticorpo ou Antígeno conjugados a moléculas reveladoras chamadas fluorocromos.
 Visualização em microscópio de fluorescência
Imunofluorescência
Imunofluorescência Direta
Aplicações:
 Detecção direta de microrganismos 
(secreções, urina, cortes de tecidos); 
 Identificação de subpopulações de linfócitos;
 Fenotipagem de células tumorais
Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis 
em secreção uretral
Utilizam substâncias conjugadas com radioisótopos para quantificar os ensaios.
O marcador (substância) pode ser tanto o antígeno como  anticorpo
 • Vantagens:
– Alta sensibilidade
– Permite medidas rápidas e precisas
• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
Radioimunoensaio (RIA)
	São utilizados radioisótopos como marcadores (ex.: títrio, carbono 14, iodo 125)
Radioimunoensaio
Sensibilidade do teste permite dosar ng/mL, pg/mL e até fg/mL 
12
ng = 10-9; pg = 10-12; fg = 10-15
Utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. 
Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra
Radioimunoensaio (RIA)
Reação de competição por um receptor comum entre uma substância a ser determinada e a mesma substância marcada radioisotopicamente.
A quantificação é feita em aparelho específico para a leitura de radioatividade. A concentração das moléculas antigênicas presentes na amostra é inversamente proporcional à leitura de radioatividade.
Radioimunoensaio (RIA)
Os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) são testes que utilizam anticorpos ligados às enzimas. 
Ensaios Imunoenzimáticos
O teste ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) é um ensaio imunoenzimático ligado à enzima.
Como a sensibilidade da maioria dos imunoensaios enzimáticos é alta, eles costumam ser utilizados para triagem. 
ELISA
Elisa Indireto  Busca de Anticorpo
Elisa Direto (sanduiche)  Busca de Antígeno
Elisa Direto  Busca de Antígeno
Elisa Indireto  Busca de Anticorpo
ELISA
Ag adsorvido
Conjugado
Ac anti Ag
Ag adsorvido
enzyme-linked immunosorbent assay
ensaio de imunoabsorção enzimática
Controle positivo
Controle negativo
Amostra A
Amostra B
Amostra C
Controle do ensaio
1.689
0.153
O.055
0.412
1.999
0.123
Controle positivo
Controle negativo
Controle do ensaio
Amostra A
Amostra B
Amostra C
	 	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	A	0,033	0,036	0,034	0,036	0,038	0,043	0,043	0,072	0,114	0,045	0,044	0,033
	B	0,036	0,033	0,035	0,038	0,037	0,043	0,044	0,069	0,123	0,045	0,046	0,036
	C	0,033	0,035	0,035	0,038	0,04	0,043	0,039	0,083	0,117	0,044	0,046	0,033
	D	0,033	0,034	0,034	0,037	0,038	0,046	0,044	0,068	0,112	0,049	0,049	0,033
	E	0,033	0,033	0,033	0,038	0,036	0,044	0,043	0,073	0,196	0,059	0,059	0,033
	F	0,033	0,033	0,033	0,055	0,053	0,044	0,042	0,078	0,15	0,062	0,055	0,033
	G	0,033	0,033	0,033	0,052	0,06	0,043	0,042	0,071	0,194	0,055	0,057	0,033
	H	0,033	0,033	0,034	0,045	0,042	0,043	0,042	0,076	0,195	0,059	0,058	0,033
		X	X	X	X	X	X	B	5	20	A	A	X
		X	X	X	X	X	X	B	5	20	A	A	X
		X	X	X	X	X	X	B	5	20	A	A	X
		X	X	X	X	X	X	B	5	20	A	A	X
		X	X	X	X	X	X	B	10	40	A+PMA	A+PMA	X
		X	X	X	X	X	X	B	10	40	A+PMA	A+PMA	X
		X	X	X	X	X	X	B	10	40	A+PMA	A+PMA	X
		X	X	X	X	X	X	B	10	40	A+PMA	A+PMA	X
FACS = fluorescence-activated cell sorter
Citometria de fluxo
CONTROLE
DESNUTRIDO
MACRÓFAGOS
Citometria de fluxo
FACS Canto II
Western blotting
O termo “blotting” refere-se à transferência de amostras biológicas de um gel para uma membrana e sua subsequente detecção. 
Um experimento western blot ou western blotting ou protein immunoblotting foi introduzido por Towbin, em 1979 e tornou-se uma técnica de rotina muito utilizada na biologia molecular para análise de proteínas. 
A técnica western blotting baseia-se na separação das proteínas por peso molecular através de uma eletroforese, seguindo-se da transferência para uma membrana e a detecção da proteína de interesse com um anticorpo específico.
Os passos para a elaboração dessa técnica podem ser resumidos em cinco etapas: 
Extração e quantificação das proteínas
Eletroforese em gel de poliacrilamida 
Transferência das proteínas para uma membrana 
Incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada 
Revelação dessa membrana para análise dos dados
Western Blotting
Separação eletroforética das proteínas
Anticorpos específicos se ligam às proteínas
Western blotting
Exames de aglutinação
Nos testes de aglutinação (p. ex., aglutinação do látex; coagregação), uma partícula (gota de látex ou bactéria) é adicionada a um antígeno ou anticorpo reagente. 
O complexo resultante é misturado ao espécime (p. ex., LCR, soro); se o anticorpo ou antígeno-alvo estiver presente no espécime, liga-se às partículas, produzindo aglutinação mensurável.
Os testes de aglutinação na maioria das vezes são rápidos, contudo, menos sensíveis do que outros métodos. Podem determinar também sorotipos de algumas bactérias.
Exames de aglutinação
Reação de aglutinação
Direta  eritrócitos (hemaglutinação), bactérias, fungos
Indireta / Passiva  látex	
(Ag insolúvel)
Qualitativos
Semi-quantitativos
Ex.: classificação sanguinea
Ex.: detectar infecções 
Diferença entre direto e indireto
Indireto
Adsorção de anticorpos ou antígenos solúveis proteicos ou polissacarídeos na superfície de micropartículas inertes (suportes) que não interferem na interação antígeno-anticorpo, como plásticos, gelatina, carvão e hemácias formolizadas de aves e carneiros.
Direto
O antígeno faz parte naturalmente da célula, e haverá aglutinação dessas células promovida por anticorpos contra esses antígeno.
Células bacterianas também podem ser utilizadas como antígeno para a pesquisa de anticorpos em amostras de soro de pacientes, como por exemplo na leptospirose, brucelose e salmonelose
Inibição de aglutinação
As reações de inibição da aglutinação são baseadas na competição entre antígenos particulados e solúveis por um numero limitado de sítios combinatórios em moléculas de anticorpos. 
A inibição da aglutinação é um indicador de reação positiva. 
Um exemplo de técnica de inibição da aglutinação é a testagem para a presença do hormônio da gonadotrofina coriônica (hCG) como teste de gravidez. 
Fixação de Complemento
Há necessidade de Acs, Ags e hemácias de carneiro sensibilizadas e uma fonte de Complemento
O complemento é fixado ao complexo Ag-Ac
O complemento fixado não pode participar na lise das hemácias = reação positiva
Precipitação
Os Ags são solúveis
A ligação de Ag e Ac promove formação de um complexovisível
Exames de precipitação
Em geral, a amostra sanguínea é misturada com o antígeno testado para detectar anticorpos do paciente
A sensibilidade é baixa, pois resultados positivos requerem grande quantidade de anticorpo ou antígeno.
Aglutinação
Precipitação
A diferença entre precipitação e aglutinação está relacionada com a forma de agregação das moléculas e o tipo de antígenos.
A aglutinação compreende o agrupamento de antígenos particulados, como por exemplo as bactérias ou eritrócitos através da ação dos anticorpos. Promovendo a fixação dos anticorpos na superfície das hemácias.
Já a precipitação é o agrupamento de moléculas de antígenos que possuíam solubilidade através dos anticorpos visando a produção de precipitados visíveis.
Teste imunocromatográfico
ou imunocromatografia
Testes dispensam o uso de reagente adicional ou equipamentos. 
São testes de triagem  elevada sensibilidade, e consequentemente elevado custo. 
Alguns deles, como a determinação da glicemia (glicosímetros), usam métodos enzimáticos químicos, e outros são imunológicos como para o teste de gravidez.
O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a visualização do teste. 
O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).
Teste imunocromatográfico
ou imunocromatografia
POSITIVO: Duas linhas são visíveis, sendo uma linha na região controle (C) e outra na região teste (T). A intensidade de cor da linha teste (T) poderá variar de acordo com a concentração presente na amostra. Todavia, qualquer intensidade de cor na linha teste indica resultado positivo.
NEGATIVO: Apenas uma linha é visível na região controle (C), não sendo observada linha na região teste.
INVÁLIDO: Não é evidenciada a linha controle (C). As razões mais comuns de falha são o volume insuficiente de amostra ou falha no procedimento técnico. Neste caso, reler a técnica e repetir o teste com uma nova tira.
Teste imunocromatográfico
ou imunocromatografia
Teste imunocromatográfico ou imunocromatografia
Características dos testes sorológicos
Sensíveis e específicos
A sensibilidade de um teste é definida pela proporção de animais com a doença de interesse que têm o resultado do teste positivo. Indica a veracidade do teste em identificar os indivíduos infectados.
Percentual de resultados positivos em pacientes com a infecção.
Uma sensibilidade de 95% significa que 95% dos pacientes com a infecção serão identificados e que 5% dos pacientes terão um resultado “falso negativo” 
Sensibilidade
A especificidade de um teste é a proporção de animais sem a infecção que tem o teste negativo. Indica a veracidade do teste em identificar os indivíduos  que não estão infectados.
Percentual de resultados negativos em pacientes sem a infecção.
Uma especificidade de 95% significa que 95% dos animais sem infecção serão identificados como negativos e que 5% terão um resultado “falso positivo”
Especificidade
Sensibilidade e Especificidade
			Infecção		
			Presente	Ausente	Total
	Teste	Pos.	A
Verdadeiro positivo	B
Falso positivo	A+B
		Neg.	C
Falso negativo	D
Verdadeiro negativo	C+D
	Total		A+C	B+D	
Sensibilidade
= A/ (A+C) 
Especificidade
= D/ (D+B)
Hora de descansar
Perguntas
Qual a principal diferença entre os métodos de ELISA e imunofluorescência?
2. Em uma tipagem sanguínea houve aglutinação ao se misturar o sangue pesquisado e os soros anti-AB e anti-Rh. Determine o tipo sanguíneo e faça um esquema explicando a reação ocorrida. 
Quais as características do anticorpo que podem influenciar a sua ligação ao antígeno? 
Ao realizar os exames pré-natais, a gestante J.A.C, 26 anos, apresentou teste ELISA positivo para HIV. Como você interpreta este resultado? Descreva suscintamente a reação ocorrida. 
 Qual imunoensaio você escolheria para o acompanhar o prognóstico de um paciente com linfoma? Justifique sua resposta.