Fundamentos e Técnicas Imunológicas

Prévia do material em texto

Fundamentos e Técnicas Imunológicas
Objetivo
· Conhecer os ensaios utilizados para detecção e a quantificação de antígenos e anticorpos, ou outras substâncias que desempenham a mesma função;
· Identificar as técnicas mais utilizadas em diagnóstico imunológico;
Introdução
· Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas utilizados para detecção e a quantificação de antígenos e anticorpos, ou outras substâncias que desempenham a mesma função, como citocinas, drogas, hormônios, ácidos nucléicos, receptores de células etc.
· Uso de soro ou outros fluidos biológicos de paciente p/ diagnóstico laboratorial; 
· Demonstração de anticorpos específicos = diagnóstico presuntivo (indireto);
 
· Demonstração de agente infeccioso ou antígeno do agente 
 diagnóstico direto
Antígeno Direto
Os antígenos são as substâncias que estimulam a produção dos anticorpos e, além disso, que reagem especificamente com eles.
Essa substância pode ser uma proteína, um polissacarídeo ou um complexo que contenha as duas substâncias citadas. 
Os antígenos, normalmente, são os vírus, as bactérias, substâncias presentes na saliva de insetos inoculadas por suas picadas, ou ainda por porções de alimentos que não são totalmente digeridas.
Anticorpo
Os anticorpos são glicoproteínas produzidas quando a célula-mestra reconhece a presença de um antígeno. 
Essa, um linfócito, é um tipo de leucócito dividido em dois grupos que irão variar de acordo com a necessidade ou não da passagem pelo timo para a maturação
As moléculas de anticorpos tem a forma de um Y e são constituídas de quatro cadeias de aminoácidos, sendo duas delas leves e curtas, e duas pesadas e longas, que são unidas por pontes dissulfídicas.
Interação AG e AC
· É uma associação bimolecular semelhante à interação de enzimas com seus substratos ou de hormônios com seus receptores, com uma distinção bem evidente.
 O Ac não provoca nenhuma alteração química irreversível na molécula de Ag, podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se dissociar nos seus 2 componentes; isto é, Ag e Ac livres /solução/suspensão. 
Vantagens
· Rapidez 
· Simplicidade 
· Possibilidade de automação 
· Armazenamento de material biológico
· Baixo custo operacional 
· Oferta de kits comerciais padronizados
Aplicações
· Diagnóstico presuntivo e diferencial;
· Diferenciação de fases da doença; 
· Diagnóstico de alergias; 
· Diagnóstico de doenças autoimunes; 
· Diagnóstico de imunodeficiências congênitas; 
· Seleção de doadores de sangue; 
· Seleção de doadores de órgãos para enxertos; 
· Dosagens hormonais; 
· Prognóstico da doença; 
· Avaliação da eficácia da terapêutica instituída; 
· Avaliação da imunidade específica (vacinação);
· Pesquisa de antígenos em células ou tecidos; 
· Pesquisas epidemiológicas; 
· Pesquisa básica e aplicada;
APLICAÇÕES- ÁREAS
· Imunologia 
· Patologia 
· Alergologia 
· Microbiologia (bact., vírus, fungos) 
· Morfologia 
· Hematologia 
· Endocrinologia
FORÇAS DE LIGAÇÃO – AG/AC
Conjunto de reações fracas que estabilizam a ligação entre moléculas de antígenos e de anticorpos:
 
· Pontes de hidrogênio
· Ligações iônicas 
· Forças hidrofóbicas 
· Forças de Van der Waals
FATORES QUE INTERFEREM NA LIGAÇÃO AG/AC
· Especificidade dos anticorpos 
· Afinidade dos Ac 
· Avidez dos Ac
· Concentração dos Ac e antígenos
· Classe dos anticorpos envolvidos
Pureza dos antígenos utilizados
· Concentração dos anticorpos (equilíbrio entre concentração de Ag e Ac) 
· pH do meio de reação: pH ácido=desfaz reação
· Temperatura de reação: em geral o aumento de temperatura torna a reação mais rápida. 
Cuidado: não deixar denaturar os componentes da reação. Reações com complemento devem ser à baixa temperatura. 
· Tempo de reação: 
Quanto maior o tempo, mais fortes as ligações Ag-Ac e maior a probabilidade de dar reação positiva. 
Algumas reações ocorrem em minutos, outros requerem muitas horas. 
Em geral dependem da quantidade de reagentes usados na reação.
Reagentes
NÃO MARCADOS
· Precipitação: sensibilidade de detecção menor, pois é necessário que formem grandes complexos.
· Alguns métodos automatizados por precipitação tem uma sensibilidade maior
· Serve para mensurar: Anticorpos ou Antígenos no organismo vertebrado suspeito de estar infectado com um determinado agente infeccioso, usando-se técnicas sorológicas de Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento, Neutralização
MARCADOS
· Ampliação da sensibilidade;
· Imunoensaios com Acs ou Ags marcados que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac com conjugados ligantes, como: Imunofluorescência, Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos, Imunofluorimétricos e Quimioluminiscência 
ANTÍGENOS SOLÚVEIS
Reações com antígenos Solúveis:
 
· Precipitação em gel 
· Precipitação em meio líquido 
· ELISA 
· Radioimunoensaio 
· Quimioluminscência 
· Western-blot
ANTÍGENOS PARTICULADOS
Reações com antígenos particulados:
 
· Hemaglutinação 
· Aglutinação de látex Antígenos solúveis e antígenos particulados 
· Imunofluorescência (citometria de fluxo) 
 Imuno-histoquímica
Metódos
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO
PRECIPITAÇÃO EM GEL
Imunodifusão Radial (Mancini) 
Na imunodifusão radial o anticorpo é incorporado no gel de ágar quando este for derramado e diluições diferentes do antígeno são aplicadas nos poços perfurados no agar. 
À medida que o antígeno se difunde no gel ele reage com o anticorpo e quando o ponto de equivalência é atingido é formado um anel de precipitação.
Imunodifusão Dupla
As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: 
 Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
PRECIPITAÇÃO
Imunoeletroforese
Em imunoeletroforese, uma mistura complexa de antígenos é aplicada em um poço perfurado em um gel de ágar e os antígenos são submetidos à eletroforese, de forma que os antígenos são separados de acordo com suas cargas. 
Após a eletroforese, um sulco é feito no gel e os anticorpos são adicionados. À medida que os anticorpos se difundem no ágar são produzidas linhas de precipitina na zona de equivalência quando ocorre uma reação antígeno/anticorpo
Aglutinação
Aglutinação/Hemaglutinação
 Quando um antígeno é particulado, a reação de um anticorpo com o antígeno pode ser detectada pela aglutinação (agrupamento) do antígeno.
 O termo geral aglutinina é usado para descrever anticorpos que aglutinam antígenos particulados. 
Quando o antígeno é um eritrócito é usado o termo hemaglutinação. 
Todos os anticorpos podem teoricamente aglutinar antígenos particulados mas IgM, devido à sua elevada valencia, é particularmente uma boa aglutinina e se pode às vezes inferir que um anticorpo deve ser da classe IgM se for um bom anticorpo aglutinador. 
Teste de Fixação do Complemento
Características
É um método sorológico usado para pesquisar Ac no soro do paciente, utilizando a ação das proteínas do Sistema Complemento.
O sistema complemento é um conjunto de proteínas séricas que tem por função ajudar na eliminação de micro-organismos invasores. O teste de fixação do complemento tem como base a via clássica, onde o complemento se liga ao complexo antígeno-anticorpo.
Fundamento
Se baseia na propriedade que tem o Ac de se combinar com o Ag e consumir o complemento, evitando a hemólise do sistema revelador.
É um teste qualitativo ou semi-quantitativo (diluições seriadas da amostra,observando-se a máxima diluição onde ocorre reação positiva)
Desvantagens
Atualmente é teste muito pouco utilizado, devido ao surgimento de técnicas (IF, ELISA) mais sensíveis.
Complexo e trabalhoso
Deve-se realizar uma etapa de pré-aquecimento do soro do paciente (56°C) para evitar resultados falso-positivos. Nesta operação ocorre a desnaturação do complemento, principalmente da fração C3.
IMUNOENSAIOS
Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos) 
Tipos: 
· RIA (RADIOIMUNOENSAIO)
· IFA 
· Testes Imunocromatográficos
· CITOMETRIA DE FLUXO
· ELISA· WESTERN BLOTTING 
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Características
É um método sorológico que permite a detecção de Ag ou Ac em tecidos ou células a partir de uma marcação com anticorpos conjugados a uma molécula fluorescente
Princípio da técnica: 
 Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. 
 Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa. 
A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência). 
Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).
Microscopia de fluorescência
A visualização dessa reação é feita 
em um microscópio de fluorescência.
	
É um tipo de microscópio capaz de energizar a amostra, que está marcada com anticorpos conjugados a moléculas fluorescentes, e de captar a luz emitida pela a amostra, tornando assim o resultado visível aos olhos.
Existem 2 tipos de imunofluorescência
Imunofluorescência direta e Imunofluorescência indireta
Tem relevância no diagnostico de doenças humanas e veterinárias, e no campo da pesquisa para a detecção de micro-organismos e moléculas em diversos materiais. Também pode ser usada na fenotipagem de células tumorais.
Imunofluorescência direta
É colocado apenas um Ac e esse é conjugado ao fluorocromo, ou seja, o antígeno é detectado diretamente pelo anticorpo primário.
É aplicado nos casos em que temos de identificar o micro-organismo nas secreções, em biópsias ou necropsias
Imunofluorescência indireta
Nessa modalidade de imunofluorescência, além do anticorpo primário é colocado um anticorpo secundário, e esse secundário anticorpo está conjugado a um fluorocromo, ou seja, o antígeno é detectado indiretamente
Pesquisar o agente etiológico nas secreções, nos tecidos (biópsias ou necrópsias) ou para se detectar anticorpos no soro do paciente
VANTAGENS
· Especificidade (85-95%)
· Sensibilidade (70-90%)
· Reprodutibilidade 
· Simples padronização
· Detecção e localização de antígenos intra e extracelulares
DESVANAGENS
· Alto custo do microscópio de fluorescência
· Técnica realizada manualmente, aumentando a chance de erro
· Subjetividade na leitura do resultado
Nefelometria e Turbidimetria
Características
São método sorológico que permitem quantificar IgM, IgA e IgG e outras proteínas séricas através da dispersão da luz pela formação de imunocomplexos.
Vantagens
· Elevada sensibilidade e precisão;
· Sensibilidade aumentada quando se aumenta a potência luminosa
· Detecta baixas concentrações de analitos.
Fundamentos
· Dispersão da luz ao passar por uma solução contendo complexos imunológicos.
Quimioluminescência
Características
· É um tipo de reação química que ao se processar libera energia luminosa. 
· Detecta Ag-Ac, utilizando uma enzima e uma molécula que atuará como substrato para a enzima e como fonte de luz.
· Um dos dois reagentes é conjugado a uma enzima que, quando ativada na presença da substância quimioluminescente, emite luz visível.
Reagentes 
· Substâncias quimioluminescentes: luminol, acridina, sistema avidina-biotina...
· Enzimas: peroxidade, fosfatase alcalina...
Fundamentos
· Durante uma reação química, os reagentes se transformam em estados intermediários eletronicamente excitados, e ao passarem para um estado de menos excitado, liberam a energia absorvida na forma de luz. 
· Elevada sensibilidade e especificidade, linearidade, rapidez, custo, simples
· Um dos métodos para substituir o radioimunoensaio
· Radioimunoensaio: um dos métodos mais sensíveis para análise quantitativa Ag-Ac
· Limitações do radioimunoensaio: sensibilidade e especificidade elevadas, custo, licença, vida média do traçador, risco operacional, dispensa de reagentes.
Aplicações Laboratoriais
· É um método muito sensível e específico 
· Quantifica antígeno ou anticorpo presente em fluidos corporais
· Muito usado para dosagens de hormônios, marcadores tumorais, micro-organismos, drogas e outras proteínas séricas
· Perícias criminais
Testes imunocromatográficos
Ao final da década de 1980, uma nova estratégia diagnóstica surgiu. Chegaram ao mercado, os testes rápidos. 
Com o avanço das tecnologias de desenvolvimento e produção, esses testes revelaram-se eficientes na investigação de doenças infectocontagiosas.
Desde 2005, a utilização dos testes rápidos permite atender à crescente demanda pelo diagnóstico de agravos relevantes à saúde publica, visto que sua utilização aumenta a agilidade da resposta aos indivíduos e permite seu rápido encaminhamento para assistência médica e início de tratamento.
Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretação dos resultados são feitas em, no máximo, 30 minutos. Além disso, são de fácil execução e não necessitam de estrutura laboratorial.
TIPOS DE TESTES RÁPIDOS
Existem vários formatos de TR. Os mais frequentemente utilizados são: imunocromatografia de fluxo lateral; imunocromatografia de dupla migração (ou de duplo percurso – DPP); dispositivos de imunoconcentração;
Os testes rápidos podem ser realizados com amostras de sangue, soro, plasma ou fluido crevicular gengival.
Testes por imunocromatografia de fluxo lateral 
Características: utilizam uma membrana de nitrocelulose subdividida em quatro áreas. 
• Área de amostra (A), onde é aplicada a amostra e a solução tampão. 
• Área intermediária (I), que contém o conjugado, geralmente composto de ouro coloidal ligado a anticorpos (imunoglobulinas).
 • Área de teste (T), que contém os antígenos fixados à membrana de nitrocelulose, onde se lê o resultado da amostra testada. 
• Área de controle (C), local de controle da reação e que permite a validação do teste. 
Testes imunocromatOgráficos
Testes por imunocromatografia de fluxo lateral 
Características: utilizam uma membrana de nitrocelulose subdividida em quatro áreas. 
• Área de amostra (A), onde é aplicada a amostra e a solução tampão. 
• Área intermediária (I), que contém o conjugado, geralmente composto de ouro coloidal ligado a anticorpos (imunoglobulinas).
 • Área de teste (T), que contém os antígenos fixados à membrana de nitrocelulose, onde se lê o resultado da amostra testada. 
• Área de controle (C), local de controle da reação e que permite a validação do teste. 
Testes por imunocromatografia de dupla migração, ou de duplo percurso – DPP (dual path plataform)
Características: utilizam uma membrana de nitrocelulose, na qual estão ligados antígenos e são subdivididos em três áreas. 
• Área 1, onde se aplicam a amostra e o diluente. 
• Área 2, onde se aplica o tampão para permitir a migração do conjugado. 
• Área 3, que contém os antígenos fixados e onde se faz a leitura do teste e do controle
Testes por imunoconcentração (flow through)
Características: utilizam um dispositivo contendo os itens a seguir: 
• Uma membrana de nitrocelulose ou de náilon, na qual estão imobilizados antígenos do agente infeccioso investigado. 
• Uma membrana absorvente, que está sob a membrana de nitrocelulose. • Conjugado composto de proteína A conjugada com ouro coloidal.
Características: utilizam um dispositivo contendo os itens a seguir: 
• Uma membrana de nitrocelulose ou de náilon, na qual estão imobilizados antígenos do agente infeccioso investigado. 
• Uma membrana absorvente, que está sob a membrana de nitrocelulose. • Conjugado composto de proteína A conjugada com ouro coloidal.