Relatório Completo FITORREMEDIAÇÃO

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Sumário 
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................1 
2. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS ...............................................................................................2 
2.1 Objetivo ..................................................................................................................................3 
2.2 Exemplos citados de culturas .............................................................................................3 
2.3 Metodologia aplicada ...........................................................................................................3 
2.3.1 Rizobactérias .................................................................................................................3 
2.3.2 Bactérias endofíticas .....................................................................................................4 
2.4 Resultados e discussão .......................................................................................................4 
3. CARACTERIZAÇÃO DOS ISOLADOS E SELEÇÃO DAS BACTÉRIAS ..........................5 
3.1 Objetivo ..................................................................................................................................5 
3.2 Exemplos citados ..................................................................................................................5 
3.3 Metodologia aplicada ...........................................................................................................5 
3.4 Resultados e discussão .......................................................................................................6 
4. FITORREMEDIAÇÃO ................................................................................................................6 
4.1 Objetivo ..................................................................................................................................7 
4.2 Exemplos citados ..................................................................................................................7 
4.3 Metodologia aplicada ...........................................................................................................8 
4.4 Resultados e discussão .......................................................................................................8 
5. RESULTADOS ESPERADOS ..................................................................................................9 
6. CONCLUSÃO ..............................................................................................................................9 
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................ 10 
 
 
 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
A fitorremediação consiste na utilização de árvores, arbustos, plantas rasteiras 
e aquáticas e de sua microbiota para remover, degradar ou isolar substâncias tóxicas 
do ambiente, como por exemplo, substâncias xenobióticas geradas pelas atividades 
humanas que incluem diversos compostos inorgânicos, resíduos orgânicos industriais, 
hidrocarbonetos derivados do petróleo como os HPAs, herbicidas, pesticidas, 
solventes clorados, entre outros (NOWACKI; RANGEL, 2014). Segundo os autores, 
após as plantas removerem os contaminantes, elas evitam que sejam dispersados 
quando transportados pelo vento ou lixiviado pela chuva. 
Experimentos em muitas áreas tem mostrado que a fitorremediação pode ser 
usada com sucesso na degradação de metais pesados, bem como derivados de 
petróleo presentes nos solos. Constituindo uma tecnologia rápida e emergente devido 
ao seu potencial a longo prazo para aplicação em áreas que necessitam de 
descontaminação. As plantas hiper acumuladoras de metais possuem habilidade de 
absorver esses contaminantes em um nível elevado (BAIRD; CANN, 2011). Evitando, 
portanto, a contaminação no meio ambiente que pode levar a prejuízos a biota 
existente devido a interferências nos processos naturais. 
O solo apresenta uma grande diversidade de microrganismos que podem 
interagir com as plantas causando efeitos benéficos ou deletérios. Algumas bactérias 
endofíticas atuam como promotoras do crescimento de plantas. Além dessas, as 
bactérias do gênero Rhizobium são conhecidas por fixarem o nitrogênio simbiótico. 
Essas bactérias vivem em nódulos, estruturas que se estendem a partir das raízes de 
determinadas plantas, habitualmente leguminosas. Nessa relação simbiótica, a planta 
beneficia-se ao receber nitrogênio em uma forma utilizável, enquanto as bactérias 
beneficiam-se dos nutrientes necessários para o seu crescimento (BLACK; BLACK, 
2021). 
Devido a essas características, apresentam um elevado potencial para 
utilização na fitorremediação, sendo empregadas como inibidores de patógenos e 
fontes de metabólitos primários e secundários, constituindo, portanto, uma técnica de 
descontaminação de metais (Pb, Ni, Hg, Zn, Cu, Se, U, Cs) em solos. Ante o exposto, 
o presente relatório abordará como é realizada a seleção e isolamento de bactérias 
endofíticas e rizobactérias para fitorremediação de metais em solos. 
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2. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS 
O solo possui grande diversidade de bactérias, que são responsáveis por 
realizar a decomposição da matéria orgânica e xenobióticos, clivagem de nutrientes, 
controle de doenças, interação entre plantas e fixação de nitrogênio. Como foi citado, 
a espécie Rhizobium são responsáveis por fixarem o nitrogênio, essa espécie é capaz 
de se acumular ao redor das raízes de leguminosas, conhecido como rizosfera. O 
mecanismo de fixação é citado por Black; Black (2021), bem como a forma em que a 
espécie é fixada na rizosfera das plantas na citação a seguir: 
A Rhizobium multiplica-se nas proximidades das raízes de leguminosas, 
provavelmente sob a influência de secreções das raízes. À medida que 
aumenta o número de rizóbios, eles liberam enzimas que digerem a celulose 
e as substâncias que mantêm unidas as fibras de celulose nas paredes das 
células das raízes. Em seguida, os rizóbios mudam suas formas de bacilos 
de vida livre e transformam-se em células esféricas e flageladas, 
denominadas células em colmeia. Em seguida, as células em colmeia 
invadem os pelos radiculares e formam redes semelhantes a hifas, matando 
algumas células das raízes e proliferando-se em outras. As células em 
colmeia transformam-se em células grandes e de formato irregular, 
denominadas bacteroides, que estão estreitamente acondicionadas no 
interior das células das raízes, provavelmente sob a influência de substâncias 
químicas nas células vegetais. O acúmulo de bacteroides nas células 
radiculares adjacentes forma nódulos nas raízes da planta. Os bacteroides 
contêm a enzima nitrogenase, que catalisa a reação de fixação de nitrogênio 
(BLACK; BLACK, 2021, p.759). 
 
O solo possui grande diversidade de bactérias, que são responsáveis por 
realizar a decomposição da matéria orgânica e xenobióticos, clivagem de nutrientes, 
controle de doenças, interação entre plantas e fixação de nitrogênio. Como foi citado, 
a espécie Rhizobium são responsáveis por fixarem o nitrogênio, essa espécie é capaz 
de se acumular ao redor das raízes de leguminosas como podemos observar na 
Figura 1 a seguir. 
Figura 1 – Nódulos de Rhizobium em raízes de leguminosas 
 
Fonte: Adaptado de TORTORA; FUNKE; CASE (2017) 
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As rizobactérias são, portanto, promotoras do crescimento de plantas 
proporcionando efeitos benéficos as mesmas. Já as bactérias endofíticas, estão 
presentes nos tecidos internos das plantas, elas entram através das sementes ou 
fissuras nas raízes, folhas ou flores. 
As bactérias endofíticas são capazes de degradar diversos compostos e por 
isso são utilizadas para processos de biorremediação e melhorias na fitorremediação 
aumentando o potencial de degradação por bactérias associadas às raízesde plantas. 
Figura 2 – Bactérias endofíticas 
 
Fonte: Adaptado de TORTORA; FUNKE; CASE (2017) 
2.1 Objetivo 
 Realizar o isolamento e caracterização de bactérias do gênero Rhizobium e 
bactérias endofíticas; 
2.2 Exemplos citados de culturas 
Ac presença de bactérias diazotróficas que são capazes de fixar nitrogênio 
promovendo o crescimento da planta foram identificadas, sendo essas presentes na 
cana-de-açúcar, milho, arroz e nódulos de leguminosa. Outras culturas foram 
mencionadas durante o mini-curso como feijão-de-porco, limão ‘cravo’, tangerina e 
café. Bem como presentes no limão ‘Cravo’ e tangerina em seus trabalhos. 
2.3 Metodologia aplicada 
 2.3.1 Rizobactérias 
Para as rizobactérias, a análise deve ser realizada no mesmo dia em que as 
amostras são coletadas, quando não possível, devem ser resfriadas a -80°C. Na qual 
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a extração deve ser realizada utilizando um pincel esterilizado retirando todo resíduo 
da raiz para coletar os bacteroides que são acumulados nas raízes. 
Em seguida, é realizada uma suspensão, utilizando solução de sulfato de 
magnésio 0.1 M seguida de diluição seriada. Após esse procedimento, 100 L são 
transferidos para uma placa de petri com meio de cultura. 
 Após o crescimento, será obtido uma grande diversidade de microrganismos e 
a partir disso, é realizada a separação das colônias. Por fim, é obtido o isolado 
bacteriano de interesse para realizar a caracterização. 
 2.3.2 Bactérias endofíticas 
As bactérias endofíticas são aquelas encontradas nos tecidos internos, ou seja, 
dentro da raiz das plantas, primeiramente é realizada a separação das raízes para 
serem previamente esterilizadas, nessa etapa são utilizadas 10g da raiz, 90 mL uma 
solução de sacarose 5%. Após isso, é realizada a diluição seriada seguida de diluição 
seriada das amostras. Em seguida, devemos cultivar os microrganismos em meio 
semi-sólido como JMV, LGI-P e JNF-b que são citados durante o mini curso proferido 
pela professora Ana Olívia Fernandes. 
O meio JMV é utilizado para isolamento e purificação de bactérias diazotróficas. 
Já o meio LGI-P consiste em um meio seletivo para efetuar o isolamento e contagem 
do número mais provável de acetobactérias em plantas. O meio JNF-b é empregado 
para isolamento de Hebaspirillumsp, as três técnicas citadas têm suas metodologias 
descritas em Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da Embrapa Agrobiologia 
(1999). Ou seja, os três meios são semi-específicos, irá depender do metabolismo dos 
microrganismos presentes. 
Em seguida, uma película será formada nesse meio, essa fase será separada 
e adicionada em uma placa de petri, realizando a separação novamente até chegar 
ao meio de cultura de interesse. 
2.4 Resultados e discussão 
Foi possível isolar trinta espécies de bactérias endofíticas, o meio JMV, que é 
citado como semi-seletivo isolou 56% dos microrganismos identificados em seu 
trabalho. 
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3. CARACTERIZAÇÃO DOS ISOLADOS E SELEÇÃO DAS BACTÉRIAS 
3.1 Objetivo 
 Caracterizar os mecanismos de atuação das bactérias isoladas a partir de 
testes em meios de cultura. 
3.2 Exemplos citados 
Após a obtenção dos isolados, a caracterização pode ser realizada a partir de 
diferentes metodologias sendo elas a coloração de Gram e endósporos, solubilização 
de fosfato in vitro, produção de fito-hormônios, produção de sideróforos, amplificação 
do gene NifH, sequenciamento do gene RNA ribossomal 16s, entre outras. 
3.3 Metodologia aplicada 
A solubilização de fosfato consiste na promoção do crescimento, onde a 
bactéria é cultivada em um meio de cultura com fosfato insolúvel, por ser um 
macronutriente, a bactéria precisa solubilizá-lo para conseguir utilizá-lo e nisso haverá 
liberação de ácidos orgânicos, a verificação será dada, portanto, pela diferença de pH, 
onde será observada redução desse parâmetro, bem como liberação do íon fosfato 
no meio. 
A amplificação do gene NifH está relacionada ao controle genético da fixação 
de nitrogênio atmosférico responsável pelo crescimento de uma enzina nitrogenase 
(enzima que é ativada quando não há fonte de nitrogênio disponível) para fixar 
nitrogênio, sendo utilizado para verificar essa atividade em microrganismos presentes. 
Os testes de sideróforos, que são compostos orgânicos de baixo peso 
molecular e alta afinidade pelo íon ferro, tem a capacidade de quelar o íon e 
transportar em formas de quelatos para o interior das células resultando em 
microrganismos mais competitivos, sendo possível verificar uma maior disponibilidade 
de ferro para plantas. 
Em seguida a seleção das bactérias será realizada na qual primeiramente será 
preparada uma solução contendo o inoculante mediante diferentes protocolos, como 
foi citado. Como por exemplo, testar isolados separados ou a preparação de um mix 
dos isolados. A inoculação pode ser efetuada diretamente nas sementes ou 
transplantar após a germinação, dependerá apenas do tipo de cultura a ser utilizada. 
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Por fim, a avaliação será efetivada a partir da análise de matérias seca: raiz e 
parte aérea, da altura, entre outros. Sendo possível verificar a influência dos 
microrganismos caracterizados no crescimento de diferentes culturas a partir da 
diferença entre os inoculados e os controles preparados (sem bactérias). 
3.4 Resultados e discussão 
Foi possível observar que, a elevação de pH em meios de cultura a partir da 
solubilização de fosfato é um mecanismo que indica a presença de algumas bactérias 
no meio devido a atividade enzimática. Além disso, o uso de microrganismos constitui 
uma forma de melhorar o crescimento de culturas reduzindo o uso de fertilizantes, 
sendo, portanto, um método mais sustentável e menos tóxico ao meio ambiente. 
4. FITORREMEDIAÇÃO 
A fitorremediação é a utilização de plantas e seus microrganismos na 
descontaminação de solos com a presença de poluentes como metais pesados como 
(Pb, Ni, Hg, Zn, Cu, Se, entre outros) e poluentes orgânicos, buscando reduzir seus 
teores a níveis aceitáveis ao meio ambiente, melhorando as características físicas, 
químicas e biológicas do mesmo. É uma técnica eficiente e possui baixo custo. Uma 
vez que o poluente entra no sistema interno das plantas, eles podem ficar 
armazenados nas raízes, folhas e caule. Os contaminantes também podem sofrer 
mudanças químicas sendo transformados em gases ou convertidos em compostos 
menos tóxicos. 
Para aplicação da fitorremediação alguns fatores devem ser avaliados, como 
por exemplo o tipo de cultura a ser empregada, os contaminantes existentes, o teor 
desses contaminantes, o tempo, entre outros. 
Também é necessário realizar o monitoramento adequado para verificar a 
descontaminação ao longo do tempo após a implementação da técnica, que consiste 
em verificar os teores dos contaminantes de interesse durante um determinado 
período. O mecanismo de fitorremediação pode ser observado na Figura 3 a seguir. 
 
 
 
 
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Figura 3 – Mecanismo de Fitorremediação pelas plantas 
 
Fonte: Adaptado de Stein (2018) 
4.1 Objetivo 
 Verificar as principais técnicas da fitorremediação; 
 Investigação de bactérias endófitas e rizobactérias associados a plantas 
hiperacumuladoras de metais pesados. 
 
4.2 Exemplos citados 
 
As plantas empregadas para fitorremediação podem ser dividas em grupos 
sendo elas: hiperacumuladoras, não hiperacumuladoras, tolerantes e sensíveis a 
metais. 
Algumas espécies são resistentes a metais que é o caso das tolerantes, elas 
são capazes de sobreviver em solos com alto nível de metais, mas não o absorvem 
em suas células. As hiperacumuladoras devido a sua capacidade de absorver metais 
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e concentrá-los durante um longo período, a medida que as plantas crescem vão 
absorvendo altas concentrações de metais pesados e outros poluentes. Além de 
acumular oferece um mecanismo de defesa contra herbivoria e patógenos por se 
acumularem nas folhas. Em plantas sensíveis, a absorçãoocorre em pequenas 
concentrações, logo a planta reduz seu crescimento devido a interferências em seu 
metabolismo e reduzindo níveis de clorofila. 
Um dos metais pesados citados foi o cádmio e o níquel na qual são absorvidos 
por alguns arbustos que são hiperacumuladores. Existe uma diversidade de 
mecanismos pela qual as culturas dispõem para utilização de Zinco e Cádmio. Alguns 
girassóis são empregados para fitorremediação de Cromo, a alfafa é utilizada para 
acumulação de chumbo e cobre, entre outros estudos que foram mencionados. 
 
4.3 Metodologia aplicada 
 
Entre as técnicas exercidas pelas plantas e seus microrganismos durante a 
fitorremediação mencionadas, temos a fitoextração que consiste na absorção dos 
contaminantes como metais pesados (Ni, Cu, Cd, Zn) pelas raízes. A fitoestimulação 
se dá através do crescimento das raízes onde ocorre um aumento na atividade de 
microrganismos de degradação que utilizam os metabólitos como fonte de energia. A 
fitodegradação ocorre a partir de algumas enzimas que degradam os contaminantes 
e mineralizam dentro das células. Já na fitoestabilização as plantas liberam alguns 
compostos que estabilizam os contaminantes em uma forma não poluente. Por fim, a 
fitovolatilização na qual o poluente é convertido em um composto volátil não tóxico 
como o mercúrio. 
No caso de plantas hiperacumuladoras, após a descontaminação é necessário 
remover a planta do local e realizar a incineração, que consiste na completa destruição 
do material. 
 
4.4 Resultados e discussão 
A fitorremediação é utilizada para descontaminação de sedimentos de metais 
pesados em solo, onde as plantas são capazes de remover esses contaminantes 
através da acumulação destes em seus tecidos, biodegradação dos mesmos por 
bactérias presentes em suas raízes, entre outros. A técnica possui vantagens, 
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entretanto é possível observar algumas desvantagens como a quantidade de plantas 
a ser utilizada e a área para descontaminação, além dos limites de acumulação nas 
plantas. 
Algumas espécies foram citadas em Ferdandes (2012) como Brassica juncea, 
Aeolanthus biformifolius, Alyssum bertoloni e Thlaspi caerulescens, plantas 
acumuladoras de Pb, Cu, Co, Ni e Zn. Outras culturas foram citadas como cenoura, 
rabanetes e beterradas empregadas na descontaminação de Fe, Mg, Cu e Zn. 
5. RESULTADOS ESPERADOS 
A aplicação da fitorremediação possui vantagens, como baixo custo, com 
possibilidades de descontaminar além do solo, águas contaminadas. A seleção de 
culturas a serem empregadas deve ser minuciosamente realizada, levando em conta 
fatores como o nível de contaminação, tipo de cultura, tempo, área a ser 
descontaminada e também a presença de microrganismos que atuam como 
facilitadores desse processo. 
6. CONCLUSÃO 
Os estudos mencionados no mini-curso proporcionaram uma compreensão 
minuciosa acerca da temática de fitorremediação, de modo que incitaram a pesquisa 
sobre outras culturas utilizadas para esta técnica. 
Foi possível observar que as bactérias endofíticas foram identificadas em 
diversas raízes de plantas, geralmente penetram através de fissuras e acabam 
proporcionando outras vantagens contra patógenos por indução de mecanismo de 
defesa nas plantas, fixação de nitrogênio e assimilação de fosfato promovendo o 
crescimento das plantas e removendo agentes tóxicos no solo. As rizobactérias 
também proporcionam essas vantagens citadas. 
Assim como as plantas, as bactérias são importantes para a fitorremediação, 
pois auxiliam diversas culturas a se adaptarem e sobreviverem em condições de 
estresse abiótico e biótico como a presença de metais como o Cádmio que foi 
mencionada. A partir da identificação e caracterização de microrganismos do gênero 
Rhizobium e bactérias endofíticas, foi possível observar que as mesmas representam 
um papel essencial na técnica de fitorremediação. 
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REFERÊNCIAS 
 
BAIRD, C; CANN, M. Química Ambiental. 4 ed. Porto Alegre: Bookman, 2011. 
 
DÖBEREINER, J; ANDRADE, V. O; BALDANI, V. L. D. Protocolos para Preparo de Meios 
de Cultura da Embrapa Agrobiologia. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, dez. 1999. 
Disponível em < 
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/624371/1/doc110.pdf> acesso em 08 
de jul de 2021. 
 
FERNANDES, A. O. Bactérias Endofíticas e fungo micorrízico arbuscular na produção 
de mudas cítricas. Dissertação (Mestrado em Agricultura Tropical e Subtropical) – Instituto 
Agrônomo, Campinas, 2012. 
 
Microrganismos benéficos e fitorremediação de solos, 2020, 1 vídeo (136min). Publicado 
pelo canal LABPED UNICAMP. Disponível em 
https://www.youtube.com/watch?v=sMqCksssIW4 acesso em 08 jul. 2021. 
 
NOWACKI, C. C. B; RANGEL, M. B. A. Química Ambiental: Conceitos, processos e 
estudo dos impactos ao Meio Ambiente. 1 ed. São Paulo: Érica, 2014. 
 
ROCHA, J. C; ROSA, J. H; CARDOSO, A. A. Introdução à Química Ambiental. 2 ed. Porto 
Alegre: Bookman, 2009. 
 
TORTORA, G. J; FUNKE, B. R; CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. Porto Alegre: Artmed, 
2017. 
 
STEIN, R. et al. Avaliação de impactos ambientais. Porto Alegre: SAGAH, 2018.