Diagnosticar vírus e riquétsias

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MOLÉSTIAS INFECCIOSAS – DIAGNOSTICAR VÍRUS E RIQUÉCTIAS
	INTERPRETAÇÃO DO ENSAIO DIAGNÓSTICO 
	Sensibilidade do teste é a probabilidade de que um animal que se sabe ter uma doença ou infecção por determinado micróbio será identificado com um resultado de teste positivo
	ALTA SENSIBILIDADE 
	Obtém testes falsos-negativos 
	LIMITES DE SENSIBILIDADE
	Podem ser estendidos para um animal com infecções subclínicas, valores variam de acordo com a doença ou infecção
	ESPECIFICIDADE 
	É a probabilidade de um animal que se considera livre de doença ou infecção ter resultado negativo ao teste. 
	ADAPTAÇÃO AO PROPÓSITO DE DIAGNÓSTICO
	Significa que os métodos do teste precisam ser apropriados a aplicações diagnósticas específicas para que os resultados tenham relevância clínica 
	VALOR PREDITIVO
	É a probabilidade de que um animal com um resultado de teste positivo realmente tenha a doença 
	VALOR PREDITIVO NEGATIVO 
	É a probabilidade de que um animal com um resultado de teste negativo também podem ser usadas para determinar a utilidade clínica de detectar latência em uma população ou portador subclínico, desde que o ensaio se adapte a tal propósito.
	ESTABELECER DIAGNÓSTICO DA DOENÇA 
	- Histopatologia
- Ag empírico á IHQ
- ELISA-Ag
- PCR
	TRIAGEM DA INFECÇÃO
	- Sorologia
-ELISA-Ag
- PCR
	ATESTAR QUE O ANIMAL ESTÁ LIVRE DA DOENÇA 
	- Sorologia
- PCR
	DIAGNÓSTICO DEFINITIVO
	Coletar amostras durante a fase aguda da doença. Quando a concentração do micróbio está no auge em áreas como líquidos corporais, excreções, secreções ou sangue.
	AMOSTRAS PARA DIAGNÓSTICO 
	Coletadas antes da morte do anima ou, se necessário, a necropsia.
Amostras obtidas antes da morte podem ser coletadas de maneira não invasiva, como swabs orofaríngeos para detectar calicivírus felino (CVF), ou de modo invasivo, como no caso de líquido cerebrospinal para encontrar o vírus da cinomose (VC).
A obtenção de amostras pode ser valiosa para o tratamento de outros animais em uma população suscetível; no entanto, o grau acurácia diagnóstica em geral é reduzido pela degradação da proteína e do ácido nucléico do micróbio.
	CUIDADOS COM AS AMOSTRAS 
	Amostras frescas devem ser refrigeradas imediatamente para envio a curto prazo de 12-48horas para um laboratório na própria clínica ou por uma noite para um serviço de entrega.
No caso de envios ao longo de 2-4 dias, amostras devem ser congeladas e enviadas em gelo úmido para laboratório.
Tecidos obtidos após biopsia ou necropsia para Histopatologia e imuno-histoquímica (IHQ) devem ser imediatamente fixados em formalina tamponada.
A sorologia pode ter valor diagnóstico se houver uma única amostra disponível para análise de IgM ou soro da fase aguda e da convalescência para análise de IgG.
Após a coleta de amostras, sua preservação e seu armazenamento para os exames de laboratório são importantes para a análise rápida e o tempo de retorno
	COLETA, PROCESSAMENTO E ENVIO DE AMOSTRAS PARA DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS VIRAIS E POR RIQUÉTSIAS. 
	Isolamento do organismo, teste baseado no ácido nucleico (PCR), ELISA, para antígeno- A coleta deve ser asséptica para evitar contaminação bacteriana e armazenada a 10ºc ou menos para evitar inativação; não congelar nem fixar – O envio, deve-se usar sangue total, biopsia tecidual, fezes, swabs, meios de transporte comerciais. 
Sorologia – amostras: soro, líquido cerebrospinal, líquido sinovial; A coleta deve ser asséptica para evitar contaminação e manusear com cuidado para evitar hemólise; retirar a agulha da seringa antes de descartar, deixar coagular á temperatura ambiente; retrar o coágulo e centrifugar a 650g por 20min; pipetar a fração sérica para um tubo limpo; embora amostras pareadas sejam preferidas (coletadas a intervalos de 10-14 dias), amostras únicas podem ser diagnósticas. Refrigerar até o envio, usar saco duplo enfrasco á prova de vazamento para enviar. 
Histologia, imuno-histoquímica – amostras: tecido; a coleta deve ser asséptica para evitar contaminação, 5mm de espessura, fixar em formalina tamponada a 10% (10x volume); usar o saco duplo e frasco á prova de vazamento para enviar, com fixador adequado. 
Teste direto para AF – amostras: tecido, impressão tecidual; fazer impressão tecidual em lâmina de microscopia seca e deixar secar ao ar, fixar em álcool para citologia ou em acetona para AF direto. Embalar em gelo úmido e enviar como para isolamento, esfregaços devem ser enviados sem refrigeração. 
Microscopia eletrônica – amostras: tecido; a coleta deve ser asséptica, com 1-2mm de espessura; fixar em glutaraldeído a 2-4% (volume 10x) por 24hrs a 20ºc; usar saco duplo e frasco á prova de vazamento para enviar, com fixador adequado. 
Fezes ou líquidos corporais – Coletar frescos; não congelar nem fixar. Refrigerar até o envio, usar saco duplo para enviar e ambalar em gelo úmido para durar 48 a 72hrs. 
	INFECÇÕES POR RIQUÉTSIAS DE IMPORTÂNCIA VETERINÁRIA 
	 
Neoricketsia helminthoeca 
Ehrlichia spp. 
Rickettsia spp 
Mycoplasma haemofelis
	
Agentes da febre pelo trematódeo Elokomin. Hospedeiro o cão, doenças = intoxicações por salmão e febre causada pelo salmão – diagnóstico = observação de ovos de trematódeo (Nanophyetus salmincola) nas fezes, demonstração do agente em aspirados de linfonodos
humanos, cães, gatos e animais domésticos – Doença Erliquiose – Diagnóstico= teste do AF indireto para anticorpo no soro, esfregaços sanguíneos ou de medula óssea corados pelo Geimsa; PCR com sangue total.
Seres humanos, cães e gatos – Doença = febre macular das montanhas rochosas; diagnósticos = teste do AF indireto para anticorpo no soro, esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa, PCR com sangue total. 
Atingem gatos – Doença = anemia infecciosa felina – Diagnóstico = Esfregaços sanguíneos ou de tecidos corados pelo Giemsa ou AF; ocorrência inconsistente do agente nas hemácias. 
	DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO E AVALIAÇÃO IMUNE 
	Seu valor, deve-se à incorporação de antígenos purificados a anticorpos específicos que os capturam e a maior sensibilidade dos ensaios, como ELISA, e Western blot. 
Diagnóstico sorológico é usado para ajudar a diagnosticar uma doença atual, como a utilização do ensaio IgM (anticorpo inicial) com anticorpos fluorescentes indireto para detectar doença aguda associada ao VC. 
Usa-se a vigilância sorológica para saber se determinado animal teve infecção prévia por certo micróbio, ou quando se analise soro de vários animais para estabelecer a prevalência de uma infecção em uma população. 
Cães com títulos de anticorpos para VC e CPV de níveis definidos em geral são considerados protegidos contra doenças induzidas por esses vírus. No entanto, fatores como a raça do cão, a localização do ambiente em que vive (desafios) e o nível de imunossupressão natural (prenhez) ou induzida pela terapia precisam ser considerados quando o veterinário usa títulos de anticorpos para determinar a necessidade de reforços da vacina. 
	DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
	Nem sempre o nível de micróbio está suficiente para ser detectado no PCR. Pode ser que haja outros fatores que possam contribuir para o processo mórbido da doença. Como idade do animal, raça, sexo e condições nutricionais. 
Vantagens do PCR = Organismos podem ser detectados em animais que sejam portadores subclínicos ou naqueles com determinada doença. Detecção de patógenos individuais e á detecção simultânea de múltiplos patógenos mediante o uso de painéis diagnósticos de PCR. 
Pode-se usar o PCR para avaliar o restado infecciosos do animal, mas não necessariamente a capacidade do animal de transmitir a infecção. A técnica detecta o ácido nucleico microbiano tanto em animas com a infecção latente quanto naqueles com infeções subclínica. 
PCR detecta o DNA e RNA via transcriptase reversa (RT) -PCR, para documentar a existência do vírus de DNA e RNA ou de riquétsias. 
A força da PCR e RT-PCR é a sua maior sensibilidade. A alta sensibilidade, inerente nesses ensaios, torna possível a detecção de algumas cópias de ácido nucléicos, a milhões de cópias detectáveis.Detecção do produto amplificado pode ser conseguida pela PCR convencional, que envolve eletroforese em gel ou pela PCR cíclica em tempo real, que envolve a detecção do produto da PCR após a emissão de sinal fluorescente. 
A emissão de fluorescência durante a PCR cíclica em tempo real é proporcional ao número de cópias de um organismo na amostra submetida, de modo que a PCR em tempo real possibilita quantificar o número aproximado de organismos em uma amostra.
O número de ciclos em que ocorre a fluorescência é relatado como valor limiar de ciclo e, quanto menor esse valor, maior o número de organismos na amostra. A produção de curvas padrões durante a avaliação do ensaio pode tornar possível a extrapolação para o número absoluto de organismos na amostra. 
A RT-PCR em que se usa RNA ribossômico (Rrna) como molde pode ser mais sensível do que a PCR para detectar riquétsias, porque elas costumam ter mais cópias de rRNA do que DNA. 
A PCR e RT-PCR proporciona, capacidade de estabelecer diagnósticos retrospectivos de infecções virais e por riquétsias porque os ensaios podem ser feitos com amostras arquivadas.
PCR pode ser usada para detectar a existência simultânea de múltiplos microrganismos patogênicos, como bactérias e fungos, em processos mórbidos mistos. Embora o controle de qualidade seja essencial em todos os procedimentos de laboratório, tem sido imprescindível nos ensaios de PCR e RT-PCR por sua sensibilidade analítica e pelo potencial de contaminação de reações com meros traços de moléculas de DNA e RNA que podem criar resultados positivos falsos. 
Pode ocorrer resultados falso-positivos se um animal tiver sido vacinado recentemente com vacinas de vírus vivos modificados contra a doença viral que está sendo avaliada. 
Em comparação com DNA e RNA é uma molécula menos estável e sujeita a degradação biológica, portanto, os resultados da RT-PCR podem ser falsamente negativos se o RNA na amostra tiver desnaturado ou degradado durante o armazenamento ou a manipulação. 
PCR – e RT-PCR são designados para detectar ácido nucleico microbiano e nem sempre podem correlacionar-se com a existência de um microrganismo viável. 
Resultados positivos da PCR não se correlacionam necessariamente com a eliminação do microrganismos do animal acometido e precisam ser avaliados á luz de outra informação disponível sobre o paciente. 
A anamnese, os sinais clínicos, o exame físico e os resultados dos exames diagnósticos também devem ligar a existência dos microrganismos em um paciente á doença clínica antes de se concluir que os resultados de uma PCR ou RT-PCR sejam diagnósticos da doença. 
	EXEMPLOS DE PAINÉIS DE DOENÇAS INFECIOSAS EM CÃES E GATOS 
	RESPIRATÓRIAS CANINAS = 
	· adenovírus canino 2 
· vírus da cinomose
· vírus parainfluzenza canino 
· vírus influenza canino
· herpes-virus canino
· coronavírus respiiratorio canino
· Bordetella bronchseptica
	
	RESPIRATÓRIAS FELINAS=
	· Herpes vírus felino 1
· Calicivírus felino
· Chamydophila felis
· Mycoplasma felis
· Bordetella bronchiseptica
	
	ENTÉRICAS CANINAS
	· Cepas do parvovírus canino 2
· Coronavírus canino
· Campylocavter spp
· Clostridium difficile
· Lawsonia intracellulars
· Salmonella spp
· Crystosporidium
· Giardia
· 
	
	ENTÉRICAS FELINAS
	· Víirus da panleucopena felina
· Toxoplasmose
· Coronavírus entérico felino
· Campylobacter
· Clorstidium spp
· Crytospodirium
· Giardia
· Salmonella spp
· Tritichomonas spp
· 
	
	CAUSADAS POR CARRAPATOS EM CÃES
	· Anaplasma platys
· Borrelia burgdorferi
· Rickettsia spp
· Ehrlichia spp
· Francisella tularensis
· 
	
	HEMATOGÊNICAS EM FELINOS
	· Vírus da leucemia felina
· Vírus da imunodeficiência felina
· Vírus da peritonite infeciosa felina
· Mycoplasma haemofelis
· Yersinia pestis
	COLETA DE AMOSTRAS PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇAS E POR RIQUÉTSIAS
	Locais ou sinais clínicos 
	Amostras antes da morte 
	Amostras após a morte 
	
	Tecidos respiratórios, bucais e oculares
	Swabs nasais, oculares, faríngeos, raspado conjuntival, soro, sangue total, lavado transtraqueal
	tecidos selecionados e linfonodos bronquiolares
	
	Trato gastrointestinal
	Fezes, võmito, soro, sangue total
	Cortes selecionados do intestino delgado, conteúdo intestinal, linfonodos mesentéricos
	
	Pele e mucosas
	Líquido de vesículas, swabs, raspados de lesões, soro, sangue total
	Tecidos selecionados e linfonodos regionais
	
	Sistema nervoso central 
	Líquido cerebrospinal, soro, sangue total, fezes
	Cortes cerebrais selecionais
	
	Trato geniturináro
	Líquido cerebrospinal, soro, sangue total, fezes
	Cortes cerebrais selecionais
	
	Trato geniturinário
	Swabs urogenitais, muco baginal, urina, soro, sangue total
	 Cortes selecionados da placenta, dos pulmões, fígado, rins, baço fetais 
	
	Imunossupressão, anormalidades hematológicas, discrasias sanguíneas
	Sangue total, soro, medula óssea
	Tecidos selecionados e linfonodos
	ANÁLISE LABORATORIAL
	Infecções virais 
Interpretação de PCR são mais sensíveis em conjunto com outros testes sorológicos. 
ELISA realizados para FLEV em gatos com infecções regressivas e progressivas de cepras CPV-2.
Cães com enterites foram fatores contribuintes para controle de parvovirus. 
O isolamento do vírus e a PCR no princípio era usadas para detectar cepas antes não identificas ou novas de vírus e riquétsiias. 
	1- Isolamento do vírus 
2- Microscopia eletrônica 
3- Detecção do antígeno viral específico por métodos imunológicos (ELISA, anticorpos fluorescente, imunoperoxidase e IHQ)
4- Detecção de ácido nucleico
5- Testes sorológicos para anticorpos virais específicos
	INFECÇÕES POR RIQUÉTSIAS
	Bactérias gram-negativas pequenas, obrigatórias e intracelulares. 
Requerem células vivas para a sua propagação e são cultivadas em ovos de galinha embrionados ou cultura de células. 
Uso de sorologias associadas com PCR.
Bactérias gram-negativas pequenas, obrigatórias e intracelulares. 
	RECONHECIMENTO DE INFECÇÕES VIRAIS E POR RIQUÉSIAS DE SURGMENTO RECENTE 
	1 ETAPA = disseminação do microrganismo infeccioso de uma espécie para outra, resultando em uma infecção.
2 ETAPA = amplificação bem-sucedida do microrganismo na espécie receptora é essencial tanto para a doença quanto para a transmissão subsequente do microorganismo na nova espécie. 
	
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