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DISCIPLINA: DIAGNÓSTICO LABORATORIAL APLICADO ANDRESSA MARQUES CUNHA LISBOA MAYRA CLERES DE SOUZA Possuem a finalidade de: Prevenir doenças Tratar Diagnosticar Acompanhar pacientes Coletar dados epidemiológicos DIVIDEM-SE EM FASE PRÉ-ANALÍTICA – vai desde a prescrição do exame até o armazenamento do material coletado. Responsável por aproximadamente 60% dos erros de análise; É o momento de instrução do paciente; Envolve o cadastro e preenchimento de dados do paciente, o tempo de jejum pré- coleta, o tempo e forma de transporte do material e o seu armazenamento. FASE ANALÍTICA – consiste na execução da análise do material. Responsável por aproximadamente 10% dos erros; Momento que compete aos técnicos e às máquinas disponíveis em cada laboratório; Fase que sofreu os maiores impactos da automação; FASE PÓS-ANALÍTICA – vai desde a liberação e validação do exame pelo laboratório, até o momento em que o médico analisa o resultado e a partir desse toma suas decisões. Responsável por aproximadamente 30% dos erros; O profissional deve explicar minuciosamente os resultados para o paciente; Podem ser: Exames não específicos - para definição da etiologia Exames específicos– busca pelo agente etiológico Testes imunológicos – resposta do agente etiológico São realizados em estabelecimentos de saúde que são cadastrados por meio do Cadastro Nacional de Estabelecimentos de Saúde (CNES) e posteriormente fiscalizados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). # é importante sempre se atentar para as questões de biossegurança, tanto para proteção dos profissionais, quanto para a proteção dos pacientes e da integridade das amostras a serem manuseadas – sempre lavar as mãos (água ou álcool), calçar luvas, vestir o jaleco, usar máscara (se necessário). SÃO ELAS: Sangue Urina Fezes Líquidos corporais (epinhal, pleural, amniótico) Tecidos (biópsias, raspagens) Secreções corporais (escarro, esperma, secreção vaginal) COLETA DE SANGUE Tem como instruções gerais: Evitar consumo de gordura e bebidas alcoólicas por, no mínimo, 2 dias antes do exame; Evitar esforço físico por uma hora antes da realização da coleta; Jejum entre 8 e 12 horas, com livre ingesta de água; O teste solicitado é que determinará a quantidade de sangue a ser coletado e o tudo a ser utilizado. O material necessário deve ser previamente organizado; Materiais e formas de coleta: Agulha e seringa estéreis e descartáveis; Lanceta estéril descartável. Coleta a vácuo; Punção arterial; Punção capilar; Tipos de tubos: Azul – anticoagulantes utilizados para obtenção de plasma para provas de coagulação. Preto – tubo para VHS, utilizado para coleta e transporte de sangue venoso para teste de sedimentação. Vermelho – tubo sem anticoagulante, utilizado para obtenção de soro para bioquímica e sorologia. Amarelo – utilizado para dosagens bioquímicas, hormonais e sorologias. Verde – utilizado para testes bioquímicos. Roxo – utilizado para hematologia, por meio dos testes de: eritrograma, leucograma e plaquetas. Cinza – utilizado para dosagem de glicose e lactato. COLETA DE URINA Tem como instruções gerais: Higiene na região genital com água e sabão; Preferência pela primeira urina da manhã (desprezar o primeiro jato); Tipos de coleta: Urina de jato médio – para cultura, citologia e rotina; Urina 24 horas – avaliação renal; Urina cateterizada – rotina, cultura e diferenciação de infecção renal e da bexiga. COLETA DE FEZES Tem a finalidade de: Pesquisa de ovos e parasitas; Pesquisa de sangue oculto; Dosagem de gordura fecal; Estudo das funções digestivas; Coprocultura. # Exames mais solicitados: hemograma; Hb/Ht; sorologia; gasometria CONTATO COM VIDRO XI I XI HEPARINA VIII X V PLAQUETAS, Ca2+ EDTA OXALATOS CITRATOS FLUORETO HEPARINA FIBRINOGÊNIO FIBRINA DIVIDE-SE EM: Eritrograma – análise da série vermelha Leucograma – análise da série leucocitária Contagem de plaquetas VALORES DE REFERÊNCIA (lembrando que alguns, com exceção da hemoglobina, podem ter leves alterações a depender de cada laboratório) HEMOGLOBINA: 12 – 17,5 g/dL HEMÁCIAS: 4,5 – 5,5 milhões/mm3 LEUCÓCITOS: 4500 – 11000 /mm3 PLAQUETAS: 140000 – 400000 /mm3 # Auxilia no diagnóstico de várias doenças, dentre elas temos as ANEMIAS – que são manifestações clínicas que afetam a composição, morfologia e função das células da série vermelha. Implicam na incapacidade do sangue de suprir os tecidos com adequado volume de oxigênio para uma adequada função metabólica. Caracterizam-se pela redução dos níveis de hemoglobina com ou sem diminuição do número de eritrócitos, de acordo com idade, sexo e altitude. AVALIA ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS São eles: VCM – análise do tamanho das hemácias; HCM – representa o peso das hemoglobinas dentro das hemácias; CHCM – representa o nível de concentração da hemoglobina dentro de uma hemácia; RDW – avalia a diferença de tamanho entre as hemácias. Classificadas em →Anemia microcítica hipocrômica – anemia por deficiência de ferro; doenças crônicas; anemia sideroblástica; talassemias. →Anemia normocítica e normocrômica – doenças crônicas; hemorragia aguda; anemias hemolíticas. →Anemia macrocítica – deficiência de vitamina B12 e de folatos; defeito na síntese de DNA; Hemólise; Hipotireoidismo e alcoolismo. AVALIA COAGULOGRAMA Contagem de plaquetas; Tempo de sangramento; Tempo de coagulação; Tempo de Protrombina (TP); Tempo de Tromboplastina Parcial ativada (TTPa). # Também auxilia no diagnóstico das LEUCEMIAS – que são doenças monoclonais derivadas de uma única célula neoplásica. AGUDA Classificadas em Mielóide – atinge: mieloblastos; promielócitos e monoblastos. Linfóide – atinge linfoblastos. CRÔNICA Mielóide – atinge todos os progenitores de glóbulos brancos. Linfóide – atinge linfócitos maduros. Contabiliza o número de leucócitos, que variam de 4.000 a 11.000 por mg/l de sangue. São eles: NEUTRÓFILOS Seu aumento indica neutrofilia- mais relacionado a infecções bacterianas. Sua diminuição indica neutropenia- relaciona-se a alterações na medula ou presença de anticorpos. EOSINÓFILOS Seu aumento indica eosinofilia- relacionado com parasitoses, doenças dermatológicas e alergias. BASÓFILOS Seu aumento indica basofilia- relaciona-se a doenças mieloproliferativas e reações alérgicas. LINFÓCITOS Seu aumento indica linfocitose- relaciona-se a viroses agudas, linfomas e hepatites. Sua diminuição indica linfopenia- relaciona-se a deficiências imunológicas. MONÓCITOS Seu aumento indica monocitose- relaciona-se a infecções (exemplos: endocardite bacteriana, brucelose, tuberculose e mononucleose). Sua diminuição indica monocitopenia- relaciona-se uso de corticoides e anemia aplástica. Pode apresentar desvio a esquerda, que significa aumento do número de segmentos jovens na corrente sanguínea. Possuem forte relação com desigualdades socioeconômicas; São doenças negligenciadas e mais prevalentes em países tropicais e subdesenvolvidos. AGENTES ETIOLÓGICOS: Protozoários; Helmintos. TEM COMO EXEMPLOS: Helmintos: encontrados na forma de ovos e larvas; Esquistossomose - Schistosoma mansoni. Fasciolíase- Taenia spp. Teníase/Cisticercose- Hymenolepis nana. Ascaridíase- Ascaris lumbricoides. Ancilostomose- Necator americanos. Tricuríase- Trichuris trichura. Enterobiose- Enterobius vermicuralis. Estrongiloidiase- Strongyloides stercoralis. É fundamental a associação de um diagnóstico clínico epidemiológico e laboratorial. EXISTEM MÉTODOS: Imunológicos; Parasitológicos; Moleculares (menos usados pelo alto custo). TEM COMO EXEMPLOS: Protozoários: encontrados na forma de cistos, oocistos e trofozoítos; Amebíase- Entamoeba hystolitica. Giardíase- Giardia duodenalis. Criptosporíase- Cryptosporidium spp. Ciclosporíase- Cyclospora spp. Isosporíase- Isospora spp. Propicia o diagnóstico parasitológico da infecção por protozoários e/ou helmintos intestinais pela demonstração de formas parasitárias (cistos, oocistos, trofozoítos, ovos, larvas, vermes adultos ou fragmentos) eliminadas nas fezes. SUA POSITIVIDADE DEPENDE DE FATORES COMO: Estágio da infecção; Eliminação intermitente de formas de resistência; Intensidade do parasitismo; Método empregado no processamento e análise; Porção da amostra fecal analisada. O ideal é a solicitação de 3 amostras em dias alternados. COLETA DO MATERIAL E CONSERVAÇÃO: É de responsabilidade do paciente, logo este deve receber orientações e instruções acerca do processo; Frasco coletor deve ser limpo, seco, com boca larga, tampa de rosca e hermeticamente fechado; Coletar as fezes em qualquer horário do dia em penico, recipiente limpo e seco ou papel higiênico e depois transferi-las para o frasco coletor; Evitar contaminação por urina, terra e água; Após a coleta, encaminhar em até duas horas ao laboratório, caso não seja possível, refrigerar (5 – 10 °C) e encaminhar ao laboratório em até 24 horas após a coleta; A utilização de conservantes preservam a integridade das estruturas parasitárias, o que permite análises por um longo período de tempo- sendo útil para coletas múltiplas e de fezes diarreicas; São exemplos de conservantes: Formol 10%; Solução de Mertiolato-Iodo-Formaldeído (MIF); A coleta para controle de cura pode ser realizada de uma a duas semanas após o tratamento. PROCESSAMENTO E ANÁLISE: Há 3 questões norteadoras- existe suspeita clínica? qual a consistência das fezes? As fezes estão conservadas?; Divide-se em análise macroscópica e microscópica. RESULTADO FINAL: Detecção microscópica de formas evolutivas; Elaboração do laudo. Possui as seguintes etapas: Deve conter: Método utilizado; Número de amostras colhidas; Aspectos macroscópicos das fezes; Achados patogênicos e não patogênicos; Formas evolutivas encontradas; Nome científico dos parasitos encontrados. Continuando... EXAME MACROSCÓPICO Utiliza fezes frescas; Análise de odor e cor; Presença de muco, sangue, vermes adultos e proglotes. Análise de consistência das fezes. EXAME MICROSCÓPICO DIRETO Baixa sensibilidade; Recomendado para pesquisa de trofozoítos. COLORAÇÃO - útil para diferenciação de cistos, trofozoítos e larvas. Pode ser: Permanente →Utiliza-se hematoxilina férrica ou tricômio. Temporária →Utiliza-se solução de iodo; solução de Quensel ou solução de azul de metileno de Nair. se negativo MÉTODOS DE CONCENTRAÇÃO Melhoram a sensibilidade pela concentração de cistos, oocistos, ovos ou larvas nas preparações. Eliminam detritos fecais afim de facilitar a identificação morfológica. dividem-se em em Métodos de Sedimentação →Utiliza-se de sedimentação por gravidade ou por centrifugação, o que favorece a deposição das formas parasitárias. →Mais indicado para pesquisa de ovos mais pesados e de maior densidade. →Exemplos: Método de Hoffman, Pons e Janer (HPJ) ou Lutz Métodos de Flutuação →Utiliza-se do emprego de reagentes de densidade mais alta que ovos, oocistos e cistos, que por sua vez flutuam na superfície das soluções. Como: Cloreto de sódio (1,13 g/mL) Sacarose (1,20 g/mL) Sulfato de zinco (1,18 g/mL) Sulfato de magnésio →Exemplos: Método de Willis e Método de Faust # Além desses métodos, temos: Métodos de Pesquisa de Larvas →Baseiam-se no tropismo e hidrotropismo positivo de larvas de nematódeos. →Exemplos: Método de Baermann-Moraes e Método de Rugai. →Obs: as fezes precisam estar frescas. Método de concentração e quantificação da carga parasitária →Exemplo: MÉTODO DE KATO-KATZ →Recomendado pela OMS para o diagnóstico de infecções por helmintos transmitidas pelo solo e esquistossomose. →Não recomendado para cistos de protozoários. →Obs: as fezes precisam estar frescas. Método Especial →Exemplo: Método de Graham ou da fita gomada. →Utilizado para diagnóstico de enterobíase. →A coleta deve ser pela manhã e antes da higiene pessoal. →É realizado com a fixação da fita gomada na região perianal para a adesão dos Enterobius vermicularis. Parasitos sanguíneos e teciduais: Plasmodium spp. Trypanosoma cruzi Leishmania spp. Wuchereria bancrofti Podem ser diagnosticados por: →Métodos diretos e Métodos indiretos. MÉTODOS DIRETOS – pesquisa de parasitos no sangue. Podem ser: Exame a fresco -Pesquisa de tripanossomos e microfilárias. -Detecta forma e movimento. Esfregaço delgado -Necessitam ser submetidos a coloração. -Estudo da morfologia do parasito. -Análise das alterações do eritrócito parasitado. Esfregaço espesso -Permite quantificação da parasitemia. -Requer processo de desemoglobinização antes de ser submetido a coloração. Métodos de concentração -Aumentam o número de organismos recuperados nas amostras sanguíneos, ampliando a sensibilidade da técnica. Exemplos: Membrana filtrante Centrifugação em Micro-hematócrito tem como exemplos # TIPOS DE COLORAÇÃO: →Giemsa →Leishman →Panótico MÉTODOS INDIRETOS Podem ser: Xenodiagnóstico direto -Triatomíneo se alimenta diretamente do sangue do paciente. -Obs: o triatomíneo nesse caso não está contaminado. Xenodiagnóstico indireto -Triatomíneo se alimenta de sangue previamente extraído do paciente. Hemocultura -Utiliza-se, geralmente, aspirado de medula por ser o líquido corporal de extração mais segura. Inoculação em animais Esfregaço Delgado X Esfregaço Espesso MALÁRIA - Plasmodium spp. →Diagnosticada por meio da demonstração do parasito no sangue do paciente. →Para descartar infecção é necessário analisar, no mínimo, 500 campos. →Padrão ouro: GOTA ESPESSA – permite a diferenciação das espécies de plasmodium. →Também podem ser utilizados: esfregaço delgado; testes rápidos (em áreas endêmicas e sem acesso a microscopia); →Espécies presentes no Brasil: Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax. Plasmodium falciparum: hemácias normais e com granulações de Maurer raras. Plasmodium vivax: hemácias aumentadas com granulações de Shuffner frequentes. →Critérios para diferenciação: Formas ameboides encontradas no interior das hemácias; Características do núcleo, do protoplasma e pigmento constituem elementos essenciais nesse processo; Tamanho e quantidade desses elementos; Alterações produzidas no glóbulo parasitado. LEISHMANIOSE VISCERAL - Leishmania spp. →Espécie presente no Brasil: Leishmania infantum →Diagnóstico: Exame parasitológico direto -Esfregaço delgado de aspirado de medula óssea corado pela técnica de Giemsa. Exame sorológico -RIFI -Teste rápido – utilizado em áreas endêmicas; casos de febre associados a hepato e/ou esplenomegalia. DOENÇA DE CHAGAS – Trypanosoma cruzi →O diagnóstico está relacionado com a fase de infecçãona qual o infectado se encontra. FASE AGUDA -Exame a fresco para ≤ 30 dias de evolução. -Métodos de concentração para > 30 dias de evolução. FASE CRÔNICA →Métodos imunológicos para pesquisa de anticorpos anti-T cruzi (IgG) – PADRÃO OURO. Hemaglutinação indireta Elisa Reação de Imunofluorescência indireta (RIFI) →Métodos indiretos (mais utilizados para pesquisas) Desvantagens: -Possui menor sensibilidade; -A distribuição de leucócitos e parasitos não se dá ao acaso. Desvantagens: -Requer maior experiência do analista; -O processamento precisa ser rápido. # o diagnóstico definitivo se dá pela confirmação de 2 testes. Permite a análise da importância biológica das bactérias, estando presentes: Na agricultura; Na produção de energia; Na indústria farmacêutica; Na indústria de alimentos; Na recuperação ambiental (biorremediação); Na biotecnologia; Como agentes causadores de doenças; Leva em consideração a morfologia bacteriana: → Tamanho: medem de 0,5 a 1,0 µm por 2 a 5 µm; → Forma: Cocos- esféricos; Bacilos- cilíndricos; Espiraladas- espirilos ou espiroquetas. → Arranjo: Cocos Diplococos; Tétrades; Sarcina; Estreptococos; Estafilococos. Bacilos Estreptobacilos; Flagelado; Endosporo. Detectados por meio de análises laboratoriais de amostras colhidas do sítio de infecção. Por meio de: Microscopia; Cultivo; Sorologia; Biologia molecular Permitem a identificação e isolamento dos agentes bacterianos. Fatores que influenciam o isolamento Coleta do material; Transporte livre de oxigênio; Técnicas cuidadosas do laboratório. Analisa as características estruturais: Fímbrias ou pili- permitem a transferência do material genético; Cápsula- permite a proteção da estrutura celular; Parede celular Auxiliada por processos de coloração Coloração de GRAM →Diferenciação bacteriana por meio de características da parede celular; Bactérias Gram positivas: possuem uma parede espessa de peptidoglicano e grandes quantidades de ácido teicoico, apresentando ao final da coloração uma cor azul/roxa. Bactérias Gram negativas: possuem uma parede celular constituída de uma camada fina de peptidoglicano, apresentando ao final do processo cor rosa/vermelha. Coloração de Ziehl-Nielsen (BAAR) → É utilizada para micobactérias, cuja parede celular é constituída por ácido micólico, por essa razão, os bacilos apresentam uma coloração vermelha ao final do procedimento. # Por que isolar? →Para conhecer os diferentes tipos microbianos; →Obter informação completa e rápida e conhecer a susceptibilidade aos antimicrobianos. Permite o diagnóstico definitivo e direciona o tratamento; Todas as informações dependem da qualidade do espécime; Diagnóstico incorreto interfere diretamente no tratamento. →Para evitar erros: Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível; Observar a antissepsia na coleta de todos os materiais clínicos; Considerar o estágio da doença na escolha do material; Coletar quantidade adequada de material para permitir uma análise completa. DIRETO →Pesquisa a presença de agentes infecciosos em espécimes clínicos; Pode ser realizado de quatro maneiras distintas: Cultivo* de microrganismos em meios de cultura específico; Visualização* direta do patógeno por técnicas de microscopia; Detecção de antígenos específicos do patógeno através do uso de técnicas imunológicas ou de biologia celular; Detecção de sequências de ácidos nucléicos do patógeno pela utilização de sondas de amplificação gênica. *São, em geral, as técnicas mais utilizadas, em função da simplicidade, requerimento de menor infraestrutura e do menor custo. Pode ser Permite a recuperação do agente etiológico e sua utilização para estudos científicos epidemiológicos e análise de susceptibilidade a drogas. MÉTODOS MOLECULARES →Utilizados quando não é possível visualizar os microorganismos ao microscópio e/ou quando eles não crescem em meios de cultivo. →Oferecem uma capacidade de discriminação maior. →Apresentam resultados mais precisos. →Requerem técnicos mais especializados para sua realização. INDIRETO →Pesquisa de anticorpos formados pela resposta imune específica. →O diagnóstico de infecções crônicas ou agudas pode ser realizado pela pesquisa de antígenos específicos. Espécies mais frequentes na rotina do laboratório clínico →Enterobactérias: Isolamento em meio seletivo (Agar McConkey); Provas bioquímicas. →Cocos Gram positivos (Staphylococcus e Streptococcus): Isolamento em Agar sangue; Provas bioquímicas - catalase e coagulase. UROCULTURA →Meio ágar CLED (deficiente em eletrólitos): impede a formação do característico véu em amostras de Proteus sp); →Semeadura quantitativa com alça calibrada; →Identidade da bactéria: indicativo de infecção X microbiota comensal; →Critério diagnóstico de Kass > 105 UFC / ml; →Critério diagnóstico de Stamm de 102 a 104 UFC/ml; Pacientes do sexo feminino, ambos os critérios →O resultado da urocultura deve ser avaliado juntamente com outros dados laboratoriais, como o sumário de urina e clínicos. LÍQUOR →Avaliação da celularidade, nível de glicose e proteínas; →Valores de proteínas acima de 100mg/dl indicam provável infecção bacteriana; →A contagem normal de leucócitos no liquor é < a 5 células/mm3, todas mononucleares; →Valores de glicose menores que 30 mg/dl ou menos que 50% dos níveis séricos, em 50% dos pacientes, sugerem meningite bacteriana, fúngica ou por micobactérias. HEMOCULTURA →Exame crítico e de grande importância; →Bacteremia: Drenagem ou entrada direta; Transiente, minutos a poucas horas; Intermitente, desaparece e volta a acorrer; Contínua. →Geralmente associada a um único microorganismo; Microorganismos mais frequentes: →Gram-positivos: Staphylococcus aureus; Staphylococcus coagulase negativos; Enterococcus spp; Streptococcus spp. →Gram-negativos: Escherichia coli; Klebsiella pneumonie; Salmonella spp; Enterobacter spp; →Fungos: Candida spp; Cryptococcus neoformans. Frascos: →respeitar o volume; →metodologias automatizadas: aditivos para neutralizar e inativar agentes antimicrobianos. Objetiva verificar a sensibilidade de determinados microrganismos a diferentes fármacos mediante comparação de um padrão preestabelecido. Permite a avaliação in vitro da interação fármaco x bactéria. Avaliação do padrão de resposta bacteriana diante de concentrações pré-estabelecidas de antimicrobianos. Resultados sem acurácia podem impactar na terapia e prognóstico do paciente. FATORES QUE INFLUENCIAM →Composição química do meio de cultura; →Temperatura; →PH; →Tempo de incubação; →Ação e estabilidade da droga. →Validade e conservação dos discos. MÉTODOS QUALITATIVOS Métodos de difusão em ágar ou técnica de Kirby-Bauer →Discos de papel de filtro são impregnados com concentrações fixas de antimicrobianos; →Bactérias sensíveis formam um halo de inibição; →Bactérias resistentes crescem próximas ao disco sem a formação de halo. Bactéria sensível – pode ser adequadamente tratada quando isolada em uma infecção. Bactéria resistente – quando há crescimento mesmo sob a dose máxima de antimicrobiano. Bactéria parcialmente resistente – tratamento apenas perante dose máxima de antimicrobiano. →Utiliza-se de métodos qualitativos e quantitativos (concentração inibitória mínima). APLICABILIDADE Nortear a escolha do agente antimicrobiano mais adequado; Predizer a chance de sucesso de um esquema terapêutico; MÉTODOS QUANTITATIVOS Macrodiluição →Utilizam-se tubos com concentrações crescentes de antimicrobianos onde são inoculadas culturasbacterianas isoladas. Microdiluição →Utilizam-se placas com concentrações crescentes de antimicrobianos onde são inoculadas culturas bacterianas isoladas. →Em uma mesma placa podem ser analisados diferentes antibióticos. Diluição em Ágar →Utiliza-se de um meio sólido onde são colocados diferentes antimicrobianos com diferentes concentrações. Posteriormente são inoculadas colônias bacterianas para análise de possível crescimento. E-Test →Utiliza-se uma placa de petri e uma fita dosimetrada, por meio da qual possibilita-se quantificar a dose mínima de antimicrobiano que impede o crescimento. Automatizado →Utiliza-se de um cartão ou painel com múltiplos poços com diferentes antibióticos. Em cada poço é adicionado uma cultura bacteriana que terá seu crescimento lido por densidade ótica, se este ocorrer. # →Para predizer, em ambos os testes, se há resistência ou não, faz-se necessário avaliar se houve crescimento e quantifica-la. →Os fungos possuem crescimento preferencial em altas concentrações de carboidratos; período de incubação mínimo de 3 dias, a 25 °C. Exemplos de infecções fúngicas: Superficial - Malassezia furfur → Ptríase versicolor. Cutânea - Trichophyton, Epidermophyton, e espécies de Microsporum → dermatofitose, candidíase na pele, candidíase oral e mucosas. Profunda - Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis → Blastomicose, Coccicioidomicose, Histoplasmose, Paracoccicioidomicose engloba o estudo de fungos causadores de doença Ágar Sabouraud → cultivo, isolamento e identificação de fungos patogênicos e leveduras. Ágar Sabouraud Glicose → meio adequado para isolamento dermatófitos. Ágar Sabouraud com cloranfenicol → utilizado para leveduras e fungos filamentos. Ágar PDA → reconhecimento de fungos filamentosos. Ágar Mycobiotic (Mycosel) → ágar seletivo para fungos patogênicos São os mais utilizados MICROSCOPIA envolve a identificação de aspectos morfológicos utiliza-se de material obtido através da biópsia do tecido lesado EXAME DIRETO DA AMOSTRA exame a fresco após clarificação com KOH (10 a 20%) requer processo de coloração – tinta nanquim Aspectos microscópicos analisados: leveduras com filamentação (hifas); leveduras sem filamentação e sem cápsula. CULTURA usada em quadros de infecções por fungos oportunistas sua utilização depende do local de infecção MICROCULTIVO permite observar estruturas intactas SOROLOGIA utiliza-se para detecção de micoses profundas Diagnóstico Laboratorial #colorações que podem ser utilizadas: Gram Gomori-Grocott Nanquim (tinta da china) MÉTODOS RÁPIDOS Microscopia eletrônica →Permite a observação da partícula viral; Imunofluorescência (IF) e Ensaio imunoenzimático (EIE) →Possibilitam a detecção do antígeno viral Reação em cadeia da polimerase (PCR) →Permite a detecção do genoma viral. MÉTODOS CLÁSSICOS Isolamento do vírus →Animais de laboratório: uso restringe-se a pesquisas atualmente; isolamento e multiplicação de vírus que não se replicam bem em culturas de células. Exemplo: vírus da febre amarela selvagem. -Ovos embrionados: embrião em desenvolvimento, ideal para multiplicação de vírus; Vantagens=sensibilidade, facilidade de realização; Desvantagens=contaminação, morte embrionária. -Cultura de células: requer meio mínimo essencial (glicose, bicarbonato, vitaminas, aminoácidos); condições ambientais adequadas (temperatura, pH, umidade); linhagem celular de diferentes origens, utilizadas para isolamento de tipos virais pré-determinados; efeito citopático. TIPOS DE DETECÇÃO VIRAL Detecção direta →Detecção de antígenos →Visualização direta Detecção indireta →Pesquisa de anticorpos MÉTODOS INDIRETOS Imunofluorescência (IF) Ensaio imunoenzimático (EIE) MÉTODOS DIRETOS #após o isolamento viral é necessário um método específico de detecção detecção de anticorpos detecção dos vírus DISTÚRBIOS GENÉTICOS →Classificados em: Distúrbios monogênicos- tem origem em um loci genético específico, atingindo pequena parcela de determinados genes; Distúrbios cromossômicos- advém de alterações cromossômicas, aumento bem como a deleção atingindo um maior número de genes; Distúrbios multifatoriais- tem origem embasada em diversos pontos, como fatores ambientais e herdáveis, possuindo parcela considerável de fatores de causalidade desconhecidos. Detectam DOGMA CENTRAL Inicialmente foi definido como a capacidade de formação proteica a partir de ácidos nucleicos, seguindo o sentido, DNA→RNA→Proteínas. Teve sua definição ampliada ao longo dos anos a partir de conhecimentos epigenéticos, transcritômicos, proteômicos e genômicos. MUTAÇÃO Corresponde a qualquer alteração na sequência de nucleotídeos ou no arranjo do DNA. →Podem ocorrer em: MUTAÇÃO SOMÁTICA, células somáticas; MUTAÇÃO HERDÁVEL, células germinativas PASSOS DO EXAME GENÉTICO Coleta da amostra do paciente; TCLE preenchido; Realização das técnicas moleculares; Análise dos dados obtidos; Classificação da variante; Laudo médico. #A variante pode ser relatada ou não relatada e ambas podem ou não ter a capacidade de causar doença. Molécula altamente estável FONTES PARA EXTRAÇÃO Sangue periférico; Sêmen; Saliva e células da mucosa; Cabelo; Ossos; Dentes; Urina; MÉTODOS DE COLETA Swab bucal; Punção venosa; Coletas de material forense. →Métodos de extração de DNA Proteinase K (10-15mL); Solventes orgânicos: fenol e clorofórmio; FTA Card com solução de lise (SDS); Sais (salting-out) →Etapas para extração Ruptura física e química dos componentes celulares (maceração do tecido, alta temperatura e SDS); Desmembramento dos cromossomos dos seus componentes básicos (DNA e proteínas); Proteinase e RNAse; Separação do DNA dos componentes celulares (fenol clorofórmio); Precipitação alcóolica para isolamento do DNA; Armazenamento do DNA: DNA precipitado (>20 anos a -20°C e tempo indeterminado a -80°C); Análise da qualidade e quantidade do DNA →Gel de agarose 1% ou poliacrilamida →Corado com brometo de etídio ou prata Molécula altamente instável FONTES DE RNA Células e tecidos frescos; Células e tecidos conservados em reagentes. Ação de RNAses: →“DEDAses”; →Tubos, ponteiras, vidrarias; →Água e tampões; →Superfícies laboratoriais; →RNAses Endógenas; →Armazenamento do RNA. ETAPAS DA EXTRAÇÃO Homogeneização de células e tecidos; Dissociação dos complexos núcleo-protéicos; →Obs: é utilizado TRIzol – isotiocianato de guanidina, fenol. Clorofórmio; Separação – Fases orgânica e aquosa; →Obs: Fase aquosa – RNA (superior) e Fase orgânica – vermelha (fenol e clorofórmio) DNA e proteína (inferior). Precipitação do RNA com álcool isopropílico; Lavagem do RNA com etanol 70%; Dissolver o RNA; →Secar o RNA →Água ultra-pura (DNAase e RNAse free) →Água DEPC (dietilpirocarbonato) →Aquecer a 55-60°C por 10 min Armazenamento do RNA; →Pode ser utilizado TRIzol- 80°C (1 mês) ou RNA precipitado/etanol 70% (1 semana a 4°C ou 1 ano a -20°C) Análise da qualidade e quantidade do RNA; →Pode ser realizado em: gel de agarose 1% ou poliacrilamida; corado com brometo de etídio ou prata; espectrofotometria (razão A260/A280). MICROARRAY (Chip de DNA ou microarranjos de DNA) →Southern blotting em lâmina; →Chips de genes; →Pode conter mais de 10000 sondas oligonucleotídicas; →Microdisposição de oligo ou sondas; →Hibridização com mRNA ou cDNA fluorescentes; →Leitura por scanners; →Pode comparar a expressão de um grande número de genes, simultaneamente. Utilização →Detecçãode mutações gênicas e polimorfismos; →Detecção gênica em diferentes tecidos sob condições normais ou anormais; →Sequenciamento do DNA e genotipagem. ELETOFORESE → Conhecida desde 1930; →Advém da movimentação de moléculas em um campo elétrico; →Separa os ácidos nucleicos por peso molecular e as proteínas por peso e carga elétrica; →Necessita de um substrato inicial, papel, agarose ou poliacrilamida; →A análise dos resultados depende: da qualidade da amostra; do padrão de peso molecular; do espectrofotômetro (automatizado). SOUTHERN BLOT →Descoberto em 1975; →Fragmentos de DNA separados em gel de agarose→ transferidos para membrana por ação capilar→ DNA é desnaturado antes ou durante a transferência→ sonda radioativa hibrida com DNA na membrana. Aplicações: →Alteração em um único nucleotídeo (mutação); →Detecções de inserções, deleções e rearranjos; →Polimorfismo no DNA; →Ordenamento de fragmentos de DNA em um mapa físico. NORTHERN BLOTTING →Trata-se de uma corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agarose; →O RNA deve estar desnaturado; →Deve haver sensibilidade a RNAses; →A transferência para a membrana ocorre por meio da ação capilar; →São necessárias condas de DNA ou RNA para hibridar WESTERN BLOT →Trata-se de uma corrida de proteínas em gel de poliacrilamida; →Objetiva uma separação e caracterização das proteínas; →Utiliza-se SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação; →A transferência para a membrana ocorre por força elétrica; →A proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou policlonal; →Informa o tamanho e a quantidade das proteínas. Detectar e mensurar uma sequência específica de DNA, RNA ou proteínas de uma paciente; Identificação da variação na expressão gênica, RNA e/ou proteína em uma amostra; Detecção e quantificação da presença de um vírus específico, bactéria ou tipo celular. objetivos →Consiste em uma fotomicrografia da organização dos cromossomos de acordo com uma classificação padrão; →Detecta alterações numéricas e estruturais (grandes); →Os cromossomos são organizados digitalmente e pareados com seu homólogo; →Cromossomos homólogos possuem o mesmo tamanho, forma e carregam os mesmos genes; →Um cariótipo normal consiste em 45 XX ou 45XY; →As amostras utilizadas devem prover de tecido viável com células que possuam a capacidade de proliferação; →A amostra deve ser fresca. PASSOS DA PREPARAÇÃO DE UM CARIÓTIPO →Usar amostra de sangue; →Lisar os leucócitos em solução hipotônica ou usar detergente saponina e liberar os leucócitos; →Centrifugar a amostra para separar os leucócitos do resto do fluido sanguíneo; →Adicionar a Colchicina para induzir as cromátides a pararem na metáfase; →Transferir os leucócitos para uma lâmina; →Utilizar a técnica de bandeamento G; →Tirar uma fotografia; →Liberar os cromossomos pelo tamanho e forma do maior para o menor. TIPOS DE CARIÓTIPO Ideograma →O bandeamento localiza lugares nos cromossomos; Fluorescente →Detecta um marcador que possa revelar um defeito. (Fluorescence in Situ Hybridization) →Permite a análise de uma região de interesse; →Detecta alterações numéricas e estruturais (pequenas, sutis); →Uma de suas vantagens com relação ao cariótipo é não obrigatoriedade de se ter um material fresco. PASSOS PARA A PREPARAÇÃO DE UM FISH →Adicionar colcemida a uma amostra previamente coletada; →Transferir as células para um meio hipotônico; →Plaquear as células/fixar em formaldeído; →Ressuspender em metanol/fixar em ácido acética glacial; →Tratamento de pepsina; →Hibridização com sondas de PDA; →Aquecimento/desnaturação do DNA cromossomal; →A sonda liga-se a sequência complementar; →Coloração com DAPI; →Imagem de captura e análise Replicação do DNA in vitro; É uma técnica qualitativa → permite identificar a presença de algum microrganismo. Etapas: →Extrai-se o DNA em fita dupla; →Aquece para separar as fitas do DNA; →O primer vai encontrar uma região e hibridizar – hibridização dos iniciadores; →DNA polimerase adicionará as bases; →Síntese de DNA a partir dos iniciadores. Permite a detecção, quantificação e amplificação do DNA em uma única etapa; Utiliza-se de sistema de detecção de sinais fluorescentes. (oligonucleotídeos marcados); Vantagens com relação a técnica convencional de PCR: →Tempo de reação reduzido; →Maior reprodutibilidade, sensibilidade e precisão; →Coleta de dados em fase exponencial. →Possui a capacidade de detectar alterações presentes nas regiões codificadoras do DNA (éxons); →Não identifica modificações estruturais e variantes nas regiões não codificadoras (íntrons), muitas vezes associadas a doenças; →Permite a detecção simultânea de desequilíbrios e anomalias cromossômicas mais frequentes; →Permite a visualização de desequilíbrios submicroscópicos, deleções, duplicações ou triplicações; →A amostra pode ser fresca ou fixada; →Etapas: 1. Marcação do DNA do paciente. 2. Marcação do DNA de referência. 3. Mistura dos dois DNA’s – MIX 4. Insere-se o MIX em uma placa com sequências genéticas pré- determinadas. 5. Observação da coloração da placa. →Permite a análise de todo o DNA estrutural, regiões de exons e íntrons; →Possui elevado custo, requer profissionais e maquinário especializado. Polimorfismos gênicos →Diz respeito às mutações que se propagaram ao longo das gerações, representando as variações fenotípicas de uma pessoa para outra →O fenótipo é a expressão do genótipo, podendo sofrer alterações a depender do ambiente e outros fatores. Baseia-se em Mutações silenciosas Refere-se as mutações em sequências que não constituem genes, logo, não vão alterar a expressão das proteínas e nem afetar a viabilidade do organismo e são transmitidas de gerações a gerações. É utilizada na criminalística, a qual é caracterizada como uma disciplina que utiliza o conhecimento científico das mais diversas áreas, sendo aplicado na análise de vestígios materiais com o objetivo de auxiliar em investigações criminais para elucidar um determinado crime e sua autoria Os criminalistas são os profissionais responsáveis por recolher, analisar e interpretar a evidência forense. →Necessitam para isso de: Câmeras; Gravadores; Cadernos de anotações; Pinças e cotonetes; Fontes de luzes alternativas; Fitas adesivas especiais. É a área científica em que, através de técnicas e de conhecimentos sobre genética e biologia molecular se auxilia a justiça e se desvendam crimes Princípios da perícia oficial criminal →Princípio da observação - considerar todos os detalhes; →Princípio da análise - faz-se uso dos Protocolos Operacionais Padrão (POPs); Requer reprodutibilidade e confiabilidade; →Princípio da individualidade - Identificação; Classificação; Individualização Utilizam-se de #Papel do laboratório - estudar, armazenar e comparar os dados genéticos. Quando é utilizada? Centra-se, principalmente, em 3 áreas: Investigação de paternidade; Criminalística; Identificação humana. Trouxe muitos benefícios, como: Velocidade maior de análises; Diminuição do tempo de término dos inquéritos policiais; Aumento da assertividade. Extração do DNA →Vai depender do tipo de amostra, da qualidade da coleta e da complexidade Como: Sêmen; Saliva/Cels da mucosa; Cabelo; Tecidos de biópsias Ossos. →A análise de DNA em ossos carbonizados é realizada geralmente em casos de acidentes aéreo, automobilístico ou homicídio, quando não há outros materiais possíveis de investigação. Baseando-se na Tendo como etapas Precauções para proteção das amostras →Isolamento e proteção da cena do crime para retirar o mais rápido possível osindícios biológicos. →Usar luvas; →Usar máscaras - evitar falar, espirrar ou tossir próximo às amostras →Utilizar jaleco, preferencialmente. →Não adicionar conservantes às amostras →Deixar as amostras secarem em temperatura ambiente e protegidas antes de colocá-las em sacolas para serem levadas ao laboratório. →Embalar cada amostra individualmente. Utilizando-se de Objetiva reunir informações genéticas e não genéticas sobre crianças, adolescentes e adultos desaparecidos que podem ainda estar vivos e de pessoas que foram mortas e não puderam ser identificadas pelos métodos tradicionais. Os dados arquivados são: →informações genéticas obtidas do DNA doado pelos familiares de pessoas desaparecidas e as informações genéticas obtidas do DNA extraído de restos mortais. Realiza-se então o cruzamento das informações genéticas armazenadas, o que vai permitir colocar em contato as duas vertentes do problema, ou seja, a pessoa ou resto mortal não identificado e a família O seu funcionamento adequado depende da participação do IML, de órgãos governamentais ligados à defesa dos direitos humanos e de organizações não governamentais (ONGs) É papel do IML coletar e enviar para o laboratório as amostras ou restos mortais não identificados E os órgãos governamentais e ONGs irão fazer o rastreamento e triagem dos parentes desaparecidos, para a posterior obtenção de amostras biológicas para o estudo do DNA →Mapas 1 Exames Laboratoriais, 2 Coleta de Amostras Biológicas e 3 Cascata da Coagulação e Ação dos Anticoagulantes: Aula ministrada pela professora Claudinéia de Araújo, com o tema, Diagnóstico Laboratorial Aplicado a Medicina, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado ofertada no semestre de 2020/3; Aula ministrada pela professora Ludiele Souza Castro, com o tema, Coleta de Amostras Biológicas, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020; →Mapas 4 e 5 Hemograma: Aula ministrada pela professora Ludiele Souza Castro, com o tema, Leitura e Interpretação do Hemograma, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020; →Mapas 6 Doenças Parasitárias 1, 7 e 8 Exame Parasitológico de Fezes: Aula ministrada pelo professor João Gabriel G. Luz, com tema, Doenças Parasitárias: Métodos para o Diagnóstico Laboratorial, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020; →Mapas 9 e 10 Doenças Parasitárias 2: Aula ministrada pelo professor João Gabriel G. Luz, com o tema, Métodos para o Diagnóstico Laboratorial: Parasitos Sanguíneos e teciduais, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020; →Mapas 11 Bacteriologia, 12 Diagnóstico Microbiológico, 13 Espécimes clínicos frequentes na rotina bacteriológica, 14 Antibiograma (TSA): Aula ministrada pela professora Juliana Helena Chaves Pavoni, com o tema, Diagnóstico em Microbiologia, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Aula ministrada pela professora Juliana Helena Chaves Pavoni, com o tema, Antibiograma (TSA), durante a disciplina Diagnóstico em Micologia e Diagnóstico em Virologia, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020; LEITE, A.A. et al. ANÁLISE DO LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO. REVISÃO DE LITERATURA. Atas de Ciências da Saúde, São Paulo, Vol.4, N°.3, pág. 1-24, JUL-SET 2016. ARAUJO, MARIA RITA ELMOR. Hemocultura: recomendações de coleta, processamento e interpretações dos resultados. J Infect Control 2012; 1 (1): 08-19. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA - Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica, Modulo V. HOLANDA, C.M.C.X.; ARIMATEIA, D.S.; NETO, R.M. Manual de Bacteriologia e de Enteroparasitos. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2017. →Mapas 15 Micologia e 16 Diagnóstico Laboratorial em Virologia: Aula ministrada pela professora Juliana Helena Chaves Pavoni, com o tema, Antibiograma (TSA), durante a disciplina Diagnóstico em Micologia e Diagnóstico em Virologia, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020; →Mapas 17 Técnicas de Biologia Celular, 18 DNA e 19 RNA: Aula ministrada pela professora Claudinéia de Araújo, com o tema Técnicas Básicas de Biologia Molecular, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020; → Mapa e 20 Técnicas/Testes Moleculares: Aula ministrada pela professora Claudinéia de Araújo, com o tema, Técnicas Básicas de Biologia Molecular, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Aula ministrada pela professora Wânia Rezende Lima, com o tema, Diagnóstico Laboratorial - Testes moleculares, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020; →Mapas 21 Cariótipo e Fish (Fluorescence in Situ Hybridization), 22 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR), 23 Hibridização Genômica Comparativa (HCG) Sequenciamento do Exoma Completo (WES) e Sequenciamento de Última Geração (NGS): Aula ministrada pela professora Wânia Rezende Lima, com o tema, Diagnóstico Laboratorial - Testes moleculares, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020/3; →Mapas 24 e 25 Genética/Biologia Forense e 26 Bancos de Dados de Perfis Genéticos: Aula ministrada pela Professora Claudinéia de Araújo, com o tema, Genética Forense - A análise do DNA na investigação criminal, durante a disciplina Diagnóstico Laboratorial Aplicado, ofertada no semestre de 2020/3; Google imagens, 2020/3;
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