Microbiologia: História, Biodiversidade e Aplicações

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Microrganismos 
História 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Momentos importantes para Microbiologia 
› Século 17 – desenvolvimento do microscópio ótico e primeira observação de microscópios 
› 1798 – 1ª vacina (contra Smallpox) 
› 1860 – Isolamento e purificação de culturas em meio sólido, esterilização com autoclave, noção de 
condições asséticas 
› 1928 – Descoberta da transformação bacteriana (DNA recombinante) 
› 1933 – desenvolvimento do microscópio eletrónico 
› Descrição da importância das bactérias fixadoras de sulfato ou nitrogénio e as relações endossimbióticas 
› 1961 – Descrição de operão - uma unidade transcricional de uma bactéria 
› Descrição de endonucleases de restrição, PCR e plataformas de sequenciação 
 Para Biotecnologia Microbiológica 
› Século 19 – Pasteur - Descrição dos processos de Fermentação 
› WWII – Desenvolvimento do processo de produção da Penicilina 
› Século 20 – Tecnologia de DNA Recombinante 
Microrganismos 
 Representam 50% do carbono e 90% do nitrogénio na Terra. 
 Maiores contribuidores para o funcionamento da biosfera; Indispensáveis à vida. 
 Diversidade metabólica 
› Fotossíntese – CO2 e libertam O2 para a atmosfera 
› Ciclo do Nitrogénio 
› Ciclo do Sulfato 
› Ciclo de metais (p.ex. ferro) 
 Microbiota – totalidade de microrganismos que habitam num organismo 
› Fundamentais na digestão e produção de vitaminas B e K e outros processos fisiológicos 
› Presentes em muitos processos de produção (p.ex. pão, queijo, cerveja, vacinas, antibióticos...) 
Biodiversidade 
 Nível Genómico – Pequenas mudanças na informação no genoma é refletida em muitos tipos de diversidade: 
metabólica, fenotípica, morfológica, etc. e são suficientes para considerar espécies diferentes. 
 Nível Taxonómico – A variedade varia com o reino (p.ex. existe mais variedade no Animal que no Planta) 
 Nível Ecológico – Existem em todo o lado, possuem maior diversidade ecológica que qualquer organismo 
 
Formação da Terra 
4500Ma 
Primeiros microrganismos fotossintéticos 
- Não produziam oxigénio (purple photosynthetic bacteria) 
Aparecimento de cianobactérias 
- Formação de camada de atmosfera oxigenada 
Aparecimento dos primeiros microrganismos 
- Anaeróbicos 
- Semelhantes a “green” e “purple bactéria” 
3800Ma 3500Ma 2600Ma 
Aparecimento de eucariotas e depois multicelulares 
2000Ma 
Microbiologia Aplicada 
 Estudo de microrganismos e as suas relações com outros ambientes, incluindo o nosso, assim como os podemos 
utilizar para as nossas necessidades e benefícios 
› Médica; Veterinária – conhecer a relação organismo-hospedeiro; raízes da transmissão entre animais e 
humanos 
› Da Água/Ar – ramo sanitário com aplicações para saúde pública 
› Energética – uso de processos microbianos para desenvolvimento de energias mais limpas 
› Ambiental – estudo de microrganismos no seu ambiente e papel no ecossistema 
› Da Agricultura – estudo da interação microrganismos-plantas; proteção contra pragas ou doenças 
› Industrial – estudo de microrganismos em processos industriais quase impossíveis de ocorrer sem estes 
› Alimentar – estudo de microrganismos que contaminam alimentos (causa desperdício de comida); na 
produção de certos alimentos 
› *Biotecnológica – Spin-off de microbiologia aplicada 
Microbiologia Biotecnológica 
 Manipulação de microrganismos a nível molecular e genético, para produzir produtos com diferentes objetivos. 
 Ramo multidisciplinar 
› Microbiologia – escolha e isolamento de uma strain, e a sua manutenção em condições adaptadas ao 
microrganismo para não haver perda das caraterísticas 
› Biologia Molecular – melhoramento genético da strain; caraterização a nível genómico (sequenciação), 
transcriptoma (genes ativos e inativos em determinadas condições) e proteoma (proteínas que são produzidas 
em certas condições) 
› Bioquímica – Estudo dos pathways metabólicos (fontes de Energia e Carbono, nutrientes fundamentais) 
› Bioinformática – identificação dos pathways metabólicos 
› Engenharia de Bioprocessos – seleção dos parâmetros e condições de fermentação 
 Aplicações 
› Red Biotecnology 
• Biotecnologia Médica 
Vacinas; Antibióticos; Terapia Médica; Desenvolvimento de drogas e métodos de diagnóstico 
É o ramo que apresenta maior impacto económico relativo (em segundo é a industria alimentar) 
› Green Biotecnology 
• Biotecnologia da Agricultura 
Novas variantes de plantas; Biofertilizantes; Biopesticidas; Enriquecimento Nutricional 
› Grey Biotecnology 
• Biotecnologia Ambiental 
Manutenção da Biodiversidade; Remoção de Agentes Poluidores 
› Blue Biotecnology 
• Biotecnologia Marinha 
Uso de bioprodutos marinhos para aplicações médicas e materiais e para melhorar a vida marinha 
› White Biotecnology 
• Biotecnologia Industrial 
Produção de enzimas, aminoácidos e biomateriais (plásticos, tecidos, etc.) 
 Vantagens do uso de Microrganismos 
› Diversidade Genética e Ecológica 
 
› Diversidade Metabólica e Fisiológica 
› Unicelulares ou com baixo nível de diferenciação 
› Dimensões pequenas 
› Vantagens Económicas e Ecológicas em comparação com os processos químicos (não há risco para a saúde 
nem para o ambiente) 
Utilização de uma maior diversidade de substratos 
Produção de moléculas orgânicas que podem ser difíceis de 
sintetizar (antibióticos, enantiómeros) 
Relação área/volume alta aumenta o uptake e transferência de nutrientes 
Rendimento metabólico alto 
Velocidade de divisão alta 
Fácil de manipular geneticamente 
Cultura de grandes volumes (fermentos) 
 Produção da Molécula Alvo pelo Microrganismo 
› Definição de Fermentação 
1. Microbiologia/Bioquímica 
 
2. Microbiologia Aplicada/Biotecnologia 
 
 
 
 
 
 
 
Passos de um Processo de Biotecnologia Microbiana 
 Processo Upstream 
1. Strain selection / Microbial Screening 
A partir de coleções de culturas, fontes naturais 
- Condições seletivas (pH, Tº, substratos, inibidores...) 
- Pré-tratamentos (Tº, humidade...) 
2. Caraterização da Strain 
Identificação taxonómica, caraterização fisiológica, caraterização bioquímica 
3. Screening da Atividade Metabólica 
- Screening Primário – deteção, direta ou indireta, do metabolito de interesse 
- Screening Secundário – avaliação, quantitativa e qualitativa, da atividade específica do metabolito 
4. Melhoramento genético da strain – raramente se usa o wild-type 
- A strain deve se propagar facilmente, produzir o metabolito alvo em grande escala, ser fácil de 
manipular, mas geneticamente estável 
Mutagénese e screening natural – alteração para uma maior produção da molécula alvo 
Engenharia genética; Mutagénese direta; Engenharia metabólica 
5. Design do Meio Nutritivo e do Processo de Cultura Celular 
› Composição do Meio Nutritivo 
• Composição Básica – Complexo, Barato, Disponível H2O 
Fonte de Carbono 
Fonte de Energia 
Fonte de N, P, S, etc. 
Oligoelementos e vitaminas 
 Processo Downstream 
1. Ajustamento do Processo Industrial – otimização dos parâmetros (pH, Tº, oxigenação) 
2. Adaptação às condições de fermentação – fornecimento de nutrientes, remoção de inibidores e 
calor/gás, necessidade de agentes antiespumantes, etc. 
› Sistema descontínuo – BATCH – sistema fechado com apenas troca de gás 
› Sistema contínuo 
3. Extração e Purificação do produto (normalmente em vários passos) – pode libertar o produto para o 
meio ou produzi-lo no interior da célula 
4. Monitorização do Processo 
› Caraterização da pureza e composição do produto 
› Produção do produto final 
 Scale Up 
› Caraterização e Validação do Processo 
Árvore da Vida 
Processo metabólico 
anaeróbico que gera energia 
ao quebrar um composto 
Produto final: ácido lático, 
etanol, butanol, acetona, etc. 
Definição – Processo de 
produção, aeróbico ou 
anaeróbico, que resulta 
em: 
Biomassa – produção de 
bactéria ou fungos como 
fim do processo 
Bioconversão – células 
microbiais agem como 
biocatalizadores 
Bioprodução – Usode 
produtos do próprio 
metabolismo microbiano 
(Aminoácidos, Antibióticos, 
Enzimas, Álcoois, 
vitaminas) 
Glucose; Celulose; Amido de cereais; Óleos Vegetais; Sérum do leite; etc. 
Sais de Amónio; Celulose; Caseína hidrolisada; Farinha de Soja; etc. 
 1866, Heackel – Estudo da filogenia para descrever as relações evolucionárias das espécies ao longo do 
tempo. Baseado em Darwin 
› Baseada nas Caraterísticas Físicas e Metabólicas 
• Morfologia; Composição da membrana; Presença de parede celular; Necessidades Metabólicas; 
Motilidade; Caraterísticas ultraestruturais 
 O conceito foi alterado nos anos 70, quando se desenvolveram técnicas moleculares de sequenciação de 
proteínas e DNA 
› Objetivo: agrupar os microrganismos por caraterísticas homólogas 
 Momentos Importantes 
› 1888 – Desenvolvimento de métodos de isolamento de culturas puras, 
por Koch 
› 1973 – Sequenciação de moléculas de RNA, por Woese [1] 
› 1977 – Descrição da Árvore da Vida com 3 ramos, por Woese 
› 1983 – Desenvolvimento do PCR, por Mullis 
[1] Molecular clock – Um gene que sofre mutação a uma taxa conhecida, pode ser usado para determinar a 
relação filogenética entre dois seres evolutivos do mesmo ancestral 
› Requisitos para o gene: 
• Passado de geração em geração 
• Baixa tendência a mutações 
• Participa num processo universal (tradução de proteínas) 
• Não há transferência horizontal 
• Comprimento conveniente (1500pb) 
• Função conservada – elemento homólogo 
› Woese escolheu uma molécula de RNA ribossomal (eucariontes: 18S; procariontes: 16S) da subunidade 
pequena do ribossoma 
- Sequenciação pelo método de Singer (manual). - Eram inseridos fosfatos radioativos no meio, que 
seriam integrados no DNA e RNA. Depois, seriam adicionadas RNAses, primeiro as que iriam 
produzir grandes fragmentos, e depois outros tipos do RNAse. As quantidades de degradações eram 
de acordo com as necessárias para poder comparar as moléculas entre organismos. O meio seria 
depois submetido a radiação. 
- Devido à limitação das técnicas de sequenciação, as sequências do gene 16S eram apenas parciais 
• Contêm regiões altamente conservadas e regiões específicas da espécie 
› 1975 – Uso do gene 16S rRNA pela primeira vez para análise filogenética 
- Regiões altamente conservadas – permitem desenhar primers para amplificação por PCR, vão 
reconhecer a sequência de Shine-Dalgarno, e também onde se ligam os aminoácidos. 
- Regiões Hipervariáveis – Região a ser amplificada e sequenciada para avaliação da homologia 
 Outros métodos de Avaliar a Diversidade Filogenética 
› DGGE – Denaturing Gradient Gel Electrophoresis 
1. Uma amostra de DNA (ou RNA) é aplicada num gel de eletroforese que contem um agente 
desnaturante (pH ou TºC) 
2. Pequenos fragmentos passam a cadeia simples, mesmo em baixas condições de desnaturação 
3. Diferenças na sequência dos fragmentos causa melting em posições diferentes e assim, origina 
fragmentos de tamanhos diferentes que vão parando em diferentes posições no gel 
4. Ao comparar o comportamento de melting dos fragmentos polimórficos de DNA em gel de gradiente 
de desnaturação, é possível detetar genes que apresentam mutação 
› T-RFLP – Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism 
1. Amplificação por PCR do 16S rRNA com primers fluorescentes 
2. Digestão do produto de PCR com enzimas de restrição 
3. Deteção e medição dos fragmentos terminais por cromatografia capilar 
 
 Momentos Importantes 
› 1985 – Hipótese de Pace “Diversidade microbiana pode ser explorada sem cultivo, por Biologia 
Molecular” 
› 1987 – Primeira plataforma de sequenciação automática 
› 1990 – Primeiro estudo de comunidades microbianas pelas bibliotecas de 16SrRNA 
› 1998 – “Metagenômica”, por Handelsman – estudo de material genético recuperado diretamente de 
amostras ambientais 
• 12 filos originais descritos por Woese; 14 filos com pelo menos 1 representante isolado; 26 possíveis 
filos ainda não isolados 
 Filos com Interesse Biotecnológico 
› Firmicutes; Cianobactérias; Actinobactéria; Bacteroidetes; Proteobactérias 
› Representam 90% das espécies cultivadas 
Metagenômica – 1998, Handelsman 
 Estudo de todos os genomas – metagenoma - recuperados diretamente de amostras ambientais; 
 Em análise: Mistura de microrganismos cultiváveis e não-cultiváveis 
 Ecologia Molecular – Independente de Culturas 
› Houve um aumento de publicações de sequências do gene 16S rRNA no GenBank desde 1993, sendo 
que por volta de 1997 a maioria das publicações de sequências eram sequenciações de genes 
ambientais (independentes de cultura), principalmente do solo e água do mar. 
› Cerca de 0.001 e 1% das espécies de Bacteria e Archaea numa amostra são possíveis de cultivar 
 Número de Espécies Descritas vs. Número Estimado de Espécies 
› Essa estimativa é baseada em várias informações: 
• Sequenciação de DNA ambiental 
• Identificação dos metabolitos não associados a nenhum organismo conhecido 
› Poucas microrganismos conseguem ser facilmente cultivados 
• Espécies conhecidas: 6% Nematodes; 26% Crustáceos; 12% Insetos; 90% Vertebrados 
 Output da Sequenciação Genómica vs. Custos 
› 2004-2005 – revolução nos métodos de sequenciação e aparecimento dos de nova geração, resultando 
num decréscimo dos custos por genoma 
› 2007/08 - com plataformas de nova geração aumentaram os uploads de sequências nas bases de dados 
 Passos: 
1. Extração do DNA de todas as espécies presentes na amostra 
2. Estratégias para cloning dependem do que se quer saber sobre a amostra 
2.1 Random cloning – Método funcional da Metagenômica 
i. Todo o DNA na amostra será fragmentado (100-200pb) e clonado, por shotgun, num vetor, 
resultando numa grande biblioteca de pequenas sequências de inserção 
ii. Sequenciação da grande biblioteca de pequenos fragmentos – obtemos muitas leituras curtas 
iii. Alinhamento das sequências para integração e montagem de um fragmento único – contigs 
iv. Comparação com genomas conhecidas (NCBI, IMG) na base de dados 
v. Comparação com proteínas conhecidas (SIMAP, MG-RAST) na base de dados 
- Fornece informação sobre o perfil funcional do ambiente (que compostos produzem 
2.2 Targeted cloning – Método Filogenético da Metagenômica 
i. Clonagem de fragmentos maiores em vetores com capacidade de acomodá-los. O objetivo é 
clonar uma sequência específica que inclui o gene que permite identificar a espécie (16S rRNA) 
ii. A biblioteca é utilizada para amplificação do gene para identificação da espécie, por PCR. 
iii. Sequenciação do gene – a plataforma de sequenciação não é tão importante 
iv. As sequências sãos agrupadas em Unidades Taxonómicas Operacionais (OTU) 
v. Comparação com base de dados de 16S (Silva, GreenGenes, KEGG 1) 
- Quais organismos estão na amostra e a sua abundância relativa 
Uma Nova Visão Sobre A Árvore Da Vida (2016) 
 O domínio Bacteria é o que apresenta mais ramos - a maioria da vida microbial está por descobrir 
 Eukaryotes e Archaea estão mais proximamente relacionados (do que Archaea e Bacteria) 
 
Antibióticos 
 Principal produto do metabolismo secundário, com interesse industrial e comercial (Red Biotecnology) 
 Exemplos: 
› Penicilina (1928) – Produzida pelos fungos Penicillium sp. 
 – Família dos β-lactâmicos 
– Liga-se às PBPs na estrutura dos peptidoglicanos, através do seu anel β-lactâmico, 
e impedir a via biosintética do peptidoglicano 
› Estreptomicina (1943) – Produzida por actinobactérias Streptomyces griseus, gram-positivos do solo 
 – Da classe dos aminoglicosídeos; 
 – Primeiro antibiótico ativo contra a tuberculose 
 – Liga-se à sequência do 16S rRNA, interferindo com o processo de tradução 
 – É o que apresenta maior toxicidade pois inativa um processo universal 
› Vancomicina (1953) – Isolada de uma amostra natural do interior da selva do Bornéu 
– Produzida por actinobactérias Amycolatopsis orientalis 
– Da classe dos glicopeptídeos; molécula mais complexa 
– Liga-seaos terminais expostos dos peptidoglicanos e previne que estes 
expandam para divisão celular 
 Desde os anos 80 a descoberta de novos antibióticos diminuiu 
 A taxa de redescoberta é de 99% – novos screenings não revelam novos compostos 
 As bactérias não cultiváveis não se multiplicam em condições de laboratório, mas compõe cerca de 99% 
de todas as espécies no ambiente e, por isso, são uma fonte inexplorada de antibióticos 
 Cultura Convencional - Normalmente seleciona microrganismos que se multiplicam rapidamente em altas 
concentrações de nutrientes 
Screening de Alto Rendimento 
 Tenta cultivar bactérias difíceis de multiplicar em laboratório 
 Processo: 
1. Extração de amostras do ambiente natural 
2. Preparação das amostras 
2.1 Extração e separação dos nutrientes – obtém os vários compostos a ser produzidos 
2.2 Purificação no caso de populações mistas 
i. Encapsular as células isoladas em microcápsulas com gel 
ii. Empilhar e transferir as microplacas para uma coluna 
3. Os nutrientes são bombeados, isoladamente, para a coluna 
3.1 Em cada microplaca, os microrganismos que se conseguem desenvolver em condições específicas 
de nutrientes, podem formar agregados com 100-200 células 
4. As microplacas são extraídas para avaliação do crescimento dos agregados, por citometria de fluxo 
5. Nas microplacas onde houve crescimento são depois analisadas para definir as condições de 
crescimento, baseado na composição do extrato que permitiu a multiplicação. 
 Nova Estratégia (2015) – Overlapping Plates 
1. Extração de amostras do ambiente natural 
2. Suspensão em água desidrogenada (10’) e posterior “descanso” das partículas (10’) 
3. Diluição do sobrenadante em meio SMS – pobre em nutrientes, com caseína e aminoácidos; ~1cél/20µl 
4. Alíquotas de 20 µl são colocadas nos poços de um iChip 
5. Após adição das alíquotas nos poços, a placa intermédia é coberta (de ambos os lados) por uma membrana 
semipermeável. A membrana permite a difusão de água e nutrientes, mas não de células 
6. O iChip é colocado de volta no terreno de onde as amostras forem colhidas, durante 1 mês 
7. As colónias são depois colocadas em meio SMS para testar a sua capacidade de se propagar fora o iChip 
 
- Aparelho multicanal, composto por 3 microplacas com perfurações idênticas que se 
sobrepões e vão de uma placa a outra. Permite cultivar ~50% das células no solo 
(comparativamente ao 1% em meios de cultura clássicos) 
 
► Testaram 10000 placas sobrepostas para a produção de compostos antibacterianos contra S. aureus 
• Alguns isolados apresentaram atividade, incluído um extrato com uma nova espécie Eleftheria terrae. 
Ao avaliar o gene 16S conseguiram relacioná-la com aquabactérias (gram-) 
• Para descobrir o composto a ser produzido, fracionaram a colónia para obter apenas a fração ativa. 
O composto foi analisado por espectrometria de massa (nº pb) e NMR (resultado estereoquímico), 
sendo que se tratava de um novo composto: 
Teixobactina – depsipeptídeo que contém enduracididina, metil-fenilalanina e 4 D-aminoácidos. 
– O seu mecanismo ainda é caso de estudo, mas sabe-se que interage com a fração lipídica, 
e o mais importante é que não leva ao desenvolvimento de resistência (ao contrário dos 
antibióticos falados antes) 
Diversidade Microbiana 
Metabolismo 
 Varia com a fonte de Energia e a fonte de Carbono 
 Normalmente, a fonte de carbono e o átomo dador são a mesma molécula - um açúcar que é clivado 
- Usam compostos químicos como fonte de energia, normalmente por fermentação 
 - tiram energia de compostos orgânicos 
- Requerem uma ou várias compostos orgânicos para fixar carbono, possível 
através de: Respiração; Fermentação alcoólica, homolática, heterolática e ácida, que 
resultam em diferentes produtos. 
p.ex. S. cereviseae e Zymomonas fazem fermentação alcoólica que produz etanol e CO2. 
Streptococcus fazem fermentação homolática, o produto é lactato. A heterolática produz 
lactato e etanol 
 - tiram energia de compostos inorgânicos 
- Vão fermentar usando enxofre ou nitrato 
- Vão fixar o carbono do CO2 presente na atmosfera, através da via da AcetilCoA 
(comum nas eubactérias) 
- Usam o sol como fonte de energia 
 - fixam CO2 da atmosfera, através do ciclo de Calvin 
- fixam CO2 de moléculas orgânicas de outros seres vivos 
 
Quimiotróficos 
Fototróficos 
Organo-
- 
Lito-- 
-Hetero 
-Hetero 
-Auto 
Auto-- 
Hetero- 
Reino Bacteria 
Filo: Deinococcus-Thermus 
Deinococcus – resistentes a radiação ionizante (UV, raios-X e ϒ) 
 Gram+, quimioheterotróficos; 
 Possuem uma membrana externa (não existente em outras gram+) 
• Deinococcus radiodurans são usadas no tratamento de resíduos radioativos que contêm mercúrio iónico – 
o gene de resistência a mercúrio foi clonado a partir de E. coli. 
Thermus – único género da família 
 Gram-, com filamentos ou bastonetes retos 
 Aeróbicos; quimioheterotróficos; Termofílicos 
• Thermus aquaticus – produtores da DNA polimerase termoestável (Taq polimerase), utilizada no PCR 
Filo: Proteobactéria (α, β, , ϒ) 
 Maior filo de bactérias Gram- 
 Inclui vários patogénios: Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Yersinia, etc. 
 Inclui bactérias fixadoras de nitrogénio 
 Grande diversidade morfológica 
 Escherichia coli, espécies de Pseudomonas e família Acidirihiobacillaceae 
► Escherichia coli 
› Utilizada para produção de proteínas heterólogas através de tecnologia de DNA recombinante, como 
insulina e hormonas de crescimento humanas 
- Foram criadas várias estirpes geneticamente modificadas com utilidade em diversos tipos de situações 
› Família relacionada com organismos entéricos 
› Flagelos peritricosos (distribuídos uniformemente na superfície celular) 
› Genética compreendida e fácil manipulação 
› Anaeróbio facultativo – gera ATP por oxidação aeróbia 
de compostos orgânicos ou fermentação mista 
 Simples de fazer “scale-up” - passar para 
níveis de produção industrial 
› Metabolizam um conjunto simples de compostos 
› O metabolismo é muito bem regulado, pois vivem em 
constante competição 
 Rastreio regulatório bem estabelecido que 
permite aplicar protocolos de expressões 
controladas 
› Multiplica-se rapidamente ~20-30min 
► Genus Pseudomonas 
› Pseudomonas aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, P. syringae 
• Pseudomonas fluorescentes 
- Gram-, Aeróbios obrigatórios, com os flagelos nos polos 
- Excretam pseudobactina – sideróforos fluorescentes verde-amarelado 
- Algumas degradam compostos tóxicos (tolueno, octano, cânfora e compostos aromáticos 
halogenados) – a maioria dos genes necessários estão no plasmídeo 
- Deteção de contaminação por compostos orgânicos tóxicos; fixam o ferro do solo e produzem 
bacteriocinas (antibióticos) que impedem crescimento de patogénios 
- Ocorrem naturalmente, mas também há strains fluorescentes recombinadas 
• Pseudomona syringae 
- Contêm um complexo proteico na membrana externa que forma um núcleo de cristais de gelo 
- Leva ao congelamento das folhas a temperaturas mais altas (<-3ºC), danificando o tecido para invasão 
- Usadas em resorts de ski para produção de neve, reduzindo os custos de arrefecimento 
- Mutantes conseguem produzir cristais de gelo a temperaturas >-3ºC 
• Strain “ice minus” P. syringae – o gene necessário para nucleação do gelo é inativado. Nas plantas, 
competem contra o wild-type para diminuir as chances de formação de gelo 
 
ϒ-proteobactéria 
 
► Género Xanthomonas 
- Produz pigmentos amarelos caraterísticos- Relacionadas com as pseudomonas fluorescentes 
- Excreta polissacáridos 
• Xanthomonas campestris produz xantana composto por unidades de glucose, manose e ácido 
glucorónico, utilizado na indústria alimentar e na recuperação avançada de óleo 
- Propriedades reológicas (viscosidade) - comportamento de pseudoplasticidade (shear-thinning), ou 
seja, a viscosidade diminui com o aumento da tensão de corte 
► Género Acidithiobacillus- Autotróficos, acidófilos 
- Produzem energia ao oxidar compostos de enxofre reduzidos ou Fe2+ 
• Acidithiobacillus thiooxidans utilizam compostos de enxofre reduzidos 
• Acidithiobacillus ferrooxidans 
- Na presença de ferro, utiliza apenas Fe2+ - Mecanismo Direto 
- Adere aos minérios de pirita através dos lipopolissacáridos e utiliza água e oxigénio para degradar a 
pirita em iões de ferro e ácido sulfúrico 
- Na ausência de oxigénio, oxida enxofre reduzido usando água e Fe3+ – Mecanismo Indireto 
- Usados em lixiviação biológica de minérios metais para recuperar metais como fero, cobre, lítio, etc. 
- Se não for controlado, pode levar à acidificação do solo. 
 Este grupo possui propriedades incomuns 
- Um dos subgrupos possui 3 membros: Agrobacterium, Rhizobium, Rickettsia que interagem com 
hospedeiros eucariotas (2 primeiros com plantas e último com células animais) 
 O ancestral da mitocôndria animal era um organismo pertencente à divisão α do ramo das purple bacteria 
► Género Rhizobium 
- Quimioheterotróficos aeróbicos 
- Invadem os pelos das raízes de leguminosas onde formam nódulos que fixam nitrogénio 
- A relação entre uma planta e a espécie de rizóbio que a invade é muito específica 
- Existem fertilizantes de nitrogénio. Os microrganismos fixadores de nitrogénio convertem esse nitrogénio 
em amónia, sendo que a maioria da conversão é feita por fixadores simbióticos, como as Rhizobium 
- Mutantes foram desenvolvidos para resistir a condições extremas 
► Género Agrobacterium 
- Hastes flageladas 
- Quimioheterotróficos aeróbicos 
- Plasmídeo grande – Ti 
- Transfere uma porção do plasmídeo de DNA, denominada T-DNA, para as células das plantas 
- Quando as células das raízes das plantas estão danificadas, libertam compostos fenólicos que são 
sentidos pelas Agrobactérias que ativam proteínas Vir. Estas proteínas mediam o transporte da região 
T-DNA do plasmídeo Ti para a célula da planta, integrando-o no cromossoma do hospedeiro. O T-DNA 
irá estimular a síntese de hormonas de crescimento da planta, podendo levar a crescimento de tumores 
- Engenharia Genética - Na região do gene Ti inserem informação para: produção de proteínas enriquecidas 
em certos aminoácidos essenciais; fixação de nitrogénio; resistência a certos herbicidas/doenças 
► Género Zymomonas 
- Hastes com flagelos nos polos 
- Crescimento por fermentação ou respiração 
- Os açúcares são fermentados pela pathway Entner-Doudoroff cujo produto final é etanol 
• Zymomonas mobilis produz etanol em grande escala (oferece vantagem sobre as leveduras ~2.5x), mas 
podem provocar mau sabor 
► Género Gluconobacter 
- Forma elipsoidal ou em haste. Algumas strains são móveis; Quimioheterotróficos aeróbicos 
- Obtêm energia ao oxidar etanol em ácido lático – ao contrário da maioria das outras vias de oxidação, o 
substrato não é oxidado completamente em CO2 
- Consegue oxidar glucose em ácido glucónico, de importância industrial usado como regulador de acidez 
α - proteobactéria 
 
Filo: Firmicutes 
 Gram+, pouco conteúdo %GC no DNA 
 Vários produzem endósporos - esporos com parede grossa formados no interior da parede celular – 
Produzi-los é um processo complexo que só existe no ramo Gram+ 
 Anaeróbios classificados no género Clostridium 
 Existem 3 classes: Clostridia, Mollicutes, Bacilli 
- O género Clostridium é extremamente heterógeno 
- A distância evolucionária entre 2 espécies Clostridium pode ser tão grande como entre animais e plantas 
► Género Clostridium 
- Hastes, normalmente flageladas 
- Anaeróbios - preservaram as vias de fermentação predominantes quando não havia oxigénio na atmosfera 
terrestre e que desapareceram nos outros ramos de vida 
- Formam endósporos em condições desfavoráveis 
- Úteis em biotecnologia porque libertam produtos úteis como etanol, acetilmetilcarbinol, butanol e acetona 
- Butanol usado para a produção de borracha 
- Fermentação ABE (Acetona-Butanol-Etanol) foi desenvolvida como um processo que utiliza a fermentação 
bacteriana para produzir acetona (3partes), n-butano (6partes) e etanol (1parte) a partir de carboidratos 
(p.ex. amido e glucose) 
• Clostridium acetobutylicum produz 12 toneladas de acetona a partir de 100 toneladas de melaço. Em 
1916 tornou-se a maior fonte de acetona 
► Cluster Lactobacillus-Staphylococcus-Bacillus 
- Inclui os géneros Bacillus, Staphylococcus e Streptococcus? 
- Anaeróbios facultativos (crescem na presença e na ausência de oxigénio) 
- A relação com oxigénio varia: 
- Bactérias Ácido Láticas – Mantém sempre o metabolismo de açúcar por fermentação, com ou sem O2 
- Bacillus e Staphylococcus – Alternam entre fermentação e respiração seguindo os níveis de oxigénio 
- Apenas os Bacillus mantêm a capacidade ancestral de produzir endósporos 
• Bactérias Ácido Láticas 
- Homofermentação – produto final é ácido lático. Caraterístico de alguns Lactobacillus, Streptococcus 
e Pedicoccus, associados a produção de iogurtes e alguns queijos 
- Heterofermentação – produtos finais são: ácido lático, etanol e dióxido de carbono. Em Leuconostoc 
e algumas espécies de Lactobacillus, usados na fermentação de carne e salchichas 
• Lactobacillus: forma de haste; Leuconostoc e Pedicoccus são redondas 
- Crescem em baixas tensões de O2, com açucares solúveis, peptídeos, purinas, pirimidinas e vitaminas 
- Toleram condições ácidas - queda do pH pela conversão glucose→ácido lático – evita competição 
► Género: Staphylococcus 
- Esféricos, sem movimento, crescem em clusters irregulares 
- Não formam endósporos 
- O metabolismo varia entre fermentação e respiração 
- Comensais – vivem na pele humana e animal, com grande resistência a concentrações altas de sal e seca 
• Staphylococcus aureus – patogénio oportunista para humano. 
- Um dos fatores de virulência é proteína A, uma proteína de superfície. Estas proteínas ligam-se à região 
constante do anticorpo, impedindo-o de sofrer alterações na conformação e ativar a resposta imunitária 
- Proteína A é utilizada para purificação de proteínas – numa matriz (p.ex. sepharose) adiciona-se 
proteína A, ficando esta em coluna. Adiciona-se o anticorpo criado especificamente para a proteína 
alvo e este irá se ligar à proteína A. Depois, o extrato celular é colocado a percorrer a coluna, ficando 
a proteína alvo associada ao anticorpo 
- Usada em procedimentos analíticos 
 
► Género: Bacillus 
- Em forma de haste, Quimioheterotróficos, conseguem crescer na presença de ar 
- Algumas strains são termofílicas 
- Produzem endósporos quando as condições não são favoráveis 
- A maioria são saprófitos inofensivos; 
- Têm requisitos metabólicos simples e crescem rapidamente em meio sintético 
- Produzem antibióticos: Bacitracin (Bacillus subtilis) e Polymyxin (Bacillus polymyxa) 
• Bacillus anthracis - causa anthrax em ovelhas e gado bovino. Resistente à seca e longas estadias no solo 
- Alguns produzem enzimas extracelulares hidrolíticas que quebram proteínas, ácidos nucleicos, 
polissacáridos e lípidos 
• Bacillus licheniformis - Enzimas proteolíticas são usadas em detergentes da roupa 
• B. licheniformis/subtilis - Enzimas para hidrólise de polissacarídeos usadas na degradação de amido 
• Bacillus thuringiensis é um patogénio de insetos, usada em inseticidas. Produz β-endotoxina que é 
ingerida pelos insetos que se alimentam da planta, assim que chega ao trato intestinal (pH alto), a β-
endotoxina passa a uma conformação ativa, solúvel, integrando-se na membrana das células do trato, 
impedido a digestão do inseto 
Filo: Actinobacteria 
 Gram+, com alto conteúdo %GC 
 Maioria é aeróbico 
 Não têm flagelos; Produzem filamentos ramificados 
 1. Cluster inclui: géneros Arthrobacter e Cellulomonas forma de haste, e o género Micrococcus esféricas 
 2. Cluster inclui: Corynebacterium-Mycoacterium-Nocardia com parede celular caraterística: os 
polissacáridos são substituídos por ácidos gordos de cadeias longas (Ácidosmicólico) 
 Importantes na degradação de compostos orgânicos incomuns no solo 
 3. Cluster inclui Streptomyces que cresce num cluster com filamentos muito ramificados 
► Género Cellulomonas 
- Hastes irregulares, fazem respiração 
- Capacidade de degradar celulose – enzimas para degradação de celulose permitem usar plantas como 
fonte de alimento para a produção de álcool e proteínas 
► Género Corynebacterium 
• Corynebacterium glutamicum converte grande parte do alimento em ácido glutâmico e excreta-o. O 
processo envolve caraterísticas especiais na regulação da biossíntese de aminoácidos e pouco 
fornecimento de biotina (vitamina) e oxigénio 
► Género Streptococcus 
- Formam hifas que desenvolvem em micélios 
- Produzem esporos aéreos (conídia): externos e menos resistentes que os endósporos dos clostridia: 
- Têm requisitos de crescimento simples 
- O ciclo esporo-micélio-esporo permite sobreviver mudanças na temperatura, arejamento e humidade 
• Streptomyces griseus liberta estreptomicina no meio, um antibiótico. Foi o segundo antibiótico descrito. 
 
Reino Fungi 
 Eucariotas; Quimioheterotróficos 
 Produzem esporos por reprodução sexuada ou assexuada 
 Crescem com hifas ou leveduras 
 Saprófitos, simbiontes, alguns parasitas, predadores (de animais, plantas e humanos) 
 Absorvem nutrientes através da membrana celular. Para utilizarem substratos de elevado MM, secretam 
enzimas extracelulares degradativas – Fagotrofia é muito raro nos fungos 
 Parede celular rígida, rica em polissacáridos 
 Alguns termófilos, outros psicrófilos, mas geralmente 10-40ºC 
 Análises filogenéticas indicam maior relação evolutiva com animais do que com plantas ou algas 
 6 divisões com base em análise molecular 
Miccrosporidia (parasita) Zygomycota 
Chytridiomycota Ascomycota 
Glomeromycota Basidiomycota 
► Divisão Chytridiomycota 
- Predominantemente em ambientes aquáticos (água fresca e marinha) 
- A parede celular contém quitina 
- As células reprodutoras (gâmetas) possuem flagelo (único fungo com flagelos) 
- Muitos são saprófitos e biodegradadores de materiais refratários (mantêm resistência a alta temperatura) 
como a quitina, queratina e celulose; e usados para reciclagem de nutrientes 
- Parasitas de organismos aquáticos (plantas, insetos e alguns anfíbios) 
• Batrachochytrium dendrobatidis – parasita de >90 espécies de anfíbios, responsável pela extinção de 
várias espécies 
► Divisão Glomeromycota 
- Simbiontes obrigatórios com raízes das plantas, formam Micorriza arbuscular – Esta associação física 
fungo-planta é importante para adaptação das plantas em sóis inférteis, pois a micorriza absorve nutrientes 
inorgânicos (p.ex. fosfato) e entrega-o à planta. A planta devolve carboidratos ao fungo. 
- Assexuais 
- Importantes para a biodiversidade de plantas e controlar pestes (nemátodos e patogénios fúngicos) 
► Divisão Zygomycota 
- Maioria vive no solo ou em plantas ou animais em degradação (saprófitos) 
- Alguns são parasitas de plantas, insetos e pequenos animais, e outros são simbiontes de plantas 
- Produzem esporos assexuais, formados num esporocarpo no fim das hifas 
- Os talos são normalmente micelares e septados 
- A parede celular é composta por quitosana (polímero pouco ou nada acetilado da glucosamina) 
• Mucor – anaeróbio e saprófito, muito invasivos 
• Rhizopus – encontrado em alimentos em decomposição ou lugares com muita humidade. Usados na 
produção de ácido fumárico (regulador de acidez) 
► Divisão Ascomycota 
- A estrutura vegetativa consiste em célula única ou filamentos septados (a maioria com vários núcleos) 
- A parede celular é composta por quitina e glucano (e manoproteínas em leveduras) 
- Reprodução sexual leva à formação de esporos em ascos 
- Habitats terrestres, marinhos, plantas e animais 
- Saprófitos, parasitas (plantas, insetos e peixes) e simbiontes (líquen) 
 
► Divisão Ascomycota - Leveduras 
- O termo leveduras não é específico a um termo taxonómico – engloba organismos com uma forma de 
crescimento realizada por vários fungos não relacionados 
- Unicelulares; assexuais – fissão ou gemulação; formação de esporos assexuais 
- Classificadas por base em: 
• Sequência do seu 18S rRNA e os seus marcadores moleculares 
• Aparência microscópica da célula 
• Modo de reprodução sexuada 
• Certas caraterísticas fisiológicas (capacidades metabólicas e requisitos nutritivos) 
• Caraterísticas bioquímicas (química da parede celular, tipo de ubiquitina presente na cadeia de 
transporte de eletrões da respiração mitocondrial) 
➢ Levedura Saccaromyces cereviseae 
- Crescem na superfície de uvas e outras plantas ricas em açúcares 
- Metaboliza glucose em etanol e CO2 por fermentação 
- Aplicações: Fermentação de cerveja e vinho, fermento de padeiro e outras aplicações biotecnológicas 
- A sua superfície hidrofóbica faz com que os flocos adiram ao CO2 e subam para o topo do tanque de 
fermentação. Fermentado a altas temperaturas. 
- Alguns pacientes com doença de Crohn ou com colite ulcerativa possuem anticorpos 
• Saccaromyces pastorianus - usado industrialmente para produção de cerveja preta. Fermenta a uma 
temperatura de ~5°C, onde S. cereviseae torna-se dormente. 
- Aplicações 
Cozedura – o CO2 gerado por fermentação é usado como agente de fermentação para pão e outros 
Aquática – os aquaculturistas usam leveduras para fornecer CO2 a plantas aquáticas submersas 
Leveduras recuperadas como subprodutos da fermentação do álcool são vendidas para ração animal 
➢ Vantagem das Leveduras 
- Características fisiológicas que distinguem as diferentes leveduras para aplicações industriais: 
Variedade de carboidratos (mono-, di-, -tri, e poli) que podem usar como fonte de carbono e energia. 
Capacidade relativa de crescer na presença de D-glicose ou cloreto de sódio – mede osmotolerância. 
Capacidade relativa de hidrolisar e utilizar lipídios. 
- Estudos taxonómicos de leveduras e outros fungos são importantes. 
- As leveduras crescem bem em valores de pH mais baixos do que as bactérias. 
- Insensível a antibióticos – fácil de manter culturas de leveduras livres de contaminação por bactérias. 
- Pelo seu tamanho superior ao das bactérias, as leveduras são colhidas de maneira mais fácil e barata. 
- As leveduras industriais de uso corrente não apresentam problemas de saúde pública. 
 
► Divisão Ascomycota – Deutomycetes 
- Grupo artificial, engloba fungos com a fase assexual conhecida (a sexual é desconhecida ou foi perdida) 
- Parede celular constituída por glucanos e quitina 
- Importantes na economia: Aspergillus e Penicillium 
- A estrutura vegetativa é unicelular ou micélio septado (Basidiomycota) 
• Aspergillus niger 
- Usado para produção de cítrico e ácidos glucónicos 
- Várias strains foram aceites para consumo diário pela WHO 
- Enzimas 
- Glucoamylase – produção de xarope de milho com altos níveis de frutose 
- Pectinases – clarificação de sidra e vinho 
- Lipases – indústria de laticínios e detergentes 
- α-galactosidase – quebra alguns açúcares complexos (melibiose, raffinose); 
- RNAse(actibind) – propriedades anti-angeogénicas e anticancerígenas 
- Prolyl endoprotease – cliva o glúten; grande impacto no tratamento da doença celíaca 
- Usado na fermentação de chás e algumas bebidas alcoólicas, na Ásia 
• Aspergillus oryzae 
- Usado na fermentação de arroz e produtos de soja e na produção de enzimas proteolíticas e amilolíticas 
- Enzimas: 
- α-amilase – conversão de amido 
- Pectinases – clarificação de sidra e vinho 
- Proteases – cozedura e produção de cerveja 
- Lipases – indústria de laticínios e detergentes 
- Usado na fermentação de feijões de soja, molho de soja, sacarificação do arroz para bebidas alcoólicas 
e na produção de vinagre de arroz, na Ásia 
• Penicillium 
- Saprófitos 
- Produzem esporos que se libertam no ar 
- Produz antibióticos (p.ex. contra staphilococci) 
- Penicillium notatum – primeira strain usada paraprodução de penicilina 
- Penicillium griseofulvum – fonte de griseofluvina para tratamento de infeções virais em pele ou unhas 
- Penicillium camemberti e P. roqueforti na manufatura de queijos que receberam o seu nome 
- Penicillium italicum e digitatum provocam apodrecimento de frutas cítricas; P. expansum causa o 
castanho nas maçãs podres 
► Divisão Basidiomycota 
- Formam esporos sexuais numa célula denominada basídio 
- A estrutura vegetativa é unicelular ou micélio septado (Ascomycota) 
- Parede celular composta por glucanos e quitina 
• Serpula lacrymans – causa decaimento da madeira 
• Puccinia graminis – ferrugem e carvão em cereais 
• Ustilago maydis – afeta o milho 
• Espécies de Agaricus são cultivadas para consumo 
 
Reino Archaea 
 Unicelulares – podem formar filamentos ou agregados 
 Partilham caraterísticas com os eucariontes e procariontes. Distinguido por: Estrutura e química da parede 
celular; Estruturas lipídicas da membrana; Biologia Molecular 
 Diversidade morfológica e fisiológica 
› Divisão: fissão, budding, fragmentação, etc. 
› Aeróbios, anaeróbios facultativos, anaeróbicos 
 2 filos: Crenarchaeota e Euryarchaeota 
 Aplicações: 
› Produção de enzimas ativas em condições extremas - amilases, celulases, proteases, DNA polimerases... 
› Biorremediação em temperaturas altas 
› Produção de pigmentos 
› Bacteriorrodopsina (bomba de protões) 
› Solutos compatíveis 
• Pyrococcus furiosus 
- As enzimas são termoestáveis – produção da Pfu polimerase – DNA polimerase usada em PCR 
- Produzem uma aldeído oxirredutase que contem tungsténio (muito raro em seres vivos) 
- Método único de desintoxicação do superóxido em peróxido de hidrogênio e água. 
- Normalmente, a superóxido dismutase é usada para desintoxicar o superóxido, produzindo O2 como 
intermediário. Sendo anaeróbico, o O2 intermediário seria fatal, por isso o P. furiosus usa uma superóxido 
redutase específica e toma emprestado um elétron de outro composto, para reduzir o superóxido a 
peróxido de hidrogênio e água sem o O2 prejudicial. Isso pode ter usos industriais potenciais 
- O gene para a destoxificação do superóxido poderia ser usado pelas plantas para sobreviver em 
condições extremas (temperatura alta ou pouca água) 
• Haloacterium salinarium 
- Usadas no desenvolvimento de métodos em Engenharia Genética 
- Habitam em locais salinos onde há pouca competição 
- Em concentrações altas de sal, as proteínas tendem a precipitar. Para evitar esse salting-out proteico, 
produzem proteínas ácidas de carga negativa que se mantêm em solução 
- Produzem pigmentos fotossintéticos: Bacteriorrodopsina [2]; halorrodopsina; rodopsina I e II 
- Respondem à luz (fototaxia); detetam aminoácidos essenciais (quimiotaxia) e são compostos 
osmoticamente ativos (osmotaxia) 
[2] Bacteriorrodopsina 
- Proteína membranar para colheita de luz 
- Atua como uma bomba de protões acionada 
- Consiste na proteína 7-transmembranar, Bacteriorrodopsina e o cofator sensível à luz (retinal) 
- Após a absorção de um fotão, a retina muda de conformação, causando uma mudança conformacional na 
bacteriorrodopsina que impulsiona 
- Aplicações: 
- Retinas artificiais 
- Processadores óticos associativos 
• Haloquadratum walsbyi 
- Halófilos; Em condições saturantes alcançam grande densidade populacional 
- Possuem vesículas intercelulares de gás 
• Haloferax volcanii 
- Halófilos (sal), Mesófilo (~temperatura), um pouco acidófilo (pH) 
- Extremófilo, fácil de cultivar 
- Organismo modelo para estudo da genética doas Archaea 
- Mantem a pressão osmótica da célula através de salt in, ao manter altas concentrações de iões de potássio 
- Sobrevive em condições semelhantes às encontradas em Marte – é usado como modelo para testar a 
sobrevivência de organismos nativos da Terra em Marte 
 
Processo Fermentativo 
 Normalmente inclui ambas as fases: Upstream Processing (USP) e Downstream Processing (DSP) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Upstream Process 
1. Seleção da strain 
› Amostras Naturais 
› Coleção de Culturas 
2. Screening da Atividade desejada para o produto 
3. Caraterização da strain* 
4. Melhoramento da strain 
5. Preparação do meio 
6. Preparação de um inóculo viável 
1. Seleção da strain 
 Isolamento a partir de Amostras Naturais 
› Estratégias para isolamento de amostras naturais: 
- Random Isolation (“shotgun”) – obtemos muita diversidade, a qual é reduzida por screening 
- Selective Isolation – recolha num meio específico onde é provável se encontrar o organismo 
› Fatores de seleção – aumenta o crescimento do microrganismo alvo 
- Enriquecimento da cultura – beneficia o organismo alvo (não elimina os outros) 
- Manipulação do meio de cultura 
- Alteração dos parâmetros fisiológicos (inibidores, temperatura, pH...) 
› A atividade desejada pode não ser possível numa cultura pura, podendo depender de consórcios de 
vários organismos – não queremos isolar apenas 1 
 Isolamento a partir de Coleções de Culturas 
› Repositórios de microrganismos, servem para: 
- Manter coleções existentes 
- Colecionar novas strains 
- Fornecer amostras de culturas puras e autenticadas 
 Como manter uma amostra viável? 
› Short-term (fungo) 
- Preservar por séries de transferências – requer muita mão-de-obra, tempo e espaço; suscetível a 
contaminação; pode ocorrer isolamento de uma colónia que possui mutação 
› Long-term 
- Preservar em óleo 
- Preservar em água destilada (fungos filamentosos e actinomicetas) 
- Preservar por congelamento* –arcas frigoríficas ou nitrogénio líquido – elevado custo; crio-protetor 
- Preservar por drying* – cria vácuo nas ampolas que contem o organismo 
*Todos os métodos têm de ser otimizados, mas estes requerem atenção especial pois é preciso saber se o 
organismo se mantém estável após os tratamentos de congelamento ou secagem 
 
Associada com os fatores e processos que levam 
à fermentação, e incluem o processo: 
- O microrganismo produtor 
- O meio para fermentação (Raw materials) 
- Fermentação 
 
USP 
 
Inclui 
- Colheita do produto (centrifugação e purificação) 
- Tratamento do produto 
- Tratamento dos resíduos (waste) produzidos 
 
DSP 
 
*Coleções de culturas fornecem logo uma 
amostra purificada e parcialmente caraterizada 
 Patentear a aplicação 
› Numa patente o processo tem de estar completamente descrito para recriação por parte de quem 
compra a patente. O microrganismo deve ser depositado em Coleções de Culturas 
› Tratado de Budapeste – 1981 – Os microrganismos são guardados e as informações mantidas em 
segredo, e são entregues apenas a quem tem a patente paga 
› Protocolo de Nagoya – 2010 – fornece regras para o acesso a fontes genéticas de um país, ou seja, um 
país não pode utilizar informação energética encontrada noutro país que assinou o protocolo 
 Caraterísticas desejadas numa strain 
› Strain de alto rendimento - produção eficiente do produto alvo 
› Facilmente cultivado em grande escala (scale-up) – Fácil e rápido de propagar 
› Uso de substratos industriais baratos (em muitos casos, resíduos) 
› Pouca ou nenhuma necessidade de vitaminas e fatores de crescimento adicionais 
› Estabilidade genética 
› Características bioquímicas e fisiológicas estáveis e já descritas 
› Capacidade de sofrer manipulação genética (melhoramento) 
› Segurança biológica (GRAS) - não patogénios, não produzem substâncias tóxicas 
› Não produz substâncias indesejáveis (p.ex. se for par alimentação, não produzir compostos de sabor) 
› Fácil de coletar as células isoladas do produto de fermentação 
› Fácil de recuperar o produto final (excretam o produto) 
› Simples de lisar (se o produto for intracelular) 
2. Screening da Atividade 
 Estratégias 
› Screening Primário – Análise qualitativa - são necessários testes para detetar novas espécies de 
microrganismos que exibam a propriedade desejada 
- Direto (método específico para identificar/detetar o produto que quer produzir)- Indireto (identificação do produto através de uma atividade relacionada com o mesmo) 
› Screening Secundário – Análise qualitativa e quantitativa – avalia atividades específicas do 
microrganismo 
- Usando zimogramas, é possível conhecer a relação entre um microrganismo e o composto 
adicionado à matriz 
3. Caraterização da strain 
 Fonte de Carbono 
 Tolerância ao sal (NaCl) 
 Tolerância de pH 
 Uso de substratos – Metabolic fingerprint 
4. Melhoramento da strain 
 Estratégias: 
› Mutagénise 
- Mutação espontânea 
- Agentes Mutagénicos físicos (Radiação UV, X e gama) 
- Agentes Mutagénicos químicos (etano, metano, etc.) 
- Inserção de transposão 
› Recombinação Genética 
- Os plasmídeos contem informação genética suplementar, e existem várias cópias por célula 
- Transformação – inserção de material genético na célula. Os microrganismos podem transmitir 
material genético por conjugação, transdução 
› Engenharia Genética 
- Eliminação de gene 
- Expressão Heteróloga de gene (introdução de um gene) 
- Sobre-expressão do gene 
- Sub-expressão do gene 
 Após cada passo de melhoramento, é necessário fazer screening para verificar que há produção (ou 
melhor produção) do composto 
5. Preparação do meio 
 Para produção de metabolitos primários – O meio de cultura otimiza o crescimento durante o qual os 
compostos são produzidos 
- p.ex. etanol, ácido lático, nucleótidos e vitaminas 
 Para produção de metabolitos secundários – o meio fornece condições para uma fase de crescimento 
inicial, e depois as condições são otimizadas para produção dos metabolitos secundários – nesta fase 
(estacionária) há limitações no fornecimento de nutrientes (fonte de carbono, fosforo e nitrogénio) e o 
crescimento baixa 
- p.ex. pigmentos, antibióticos e algumas drogas 
 Meio líquido (normalmente) ou Meio sólido 
- Fornecer todos os nutrientes necessários 
- Promove a síntese do produto alvo (biomassa ou metabolitos) 
- Possível de ser submetido a todos os passos processo 
- Os requisitos de Carbono são calculados através do Biomass Yield Coeficient – índice da eficiência da 
conversão de um substrato em material celular 
- O Yield Coeficient para outros nutrientes é determinado por várias culturas BATCH onde o substrato 
em estudo é o único nutriente limitante 
› Componentes do Meio Líquido: 
- Em maior quantidade tem água – é necessário saber o melhor método para posteriormente isolar o 
produto (filtração, destilação, esterilização) 
- Fonte de Carbono – normalmente é fonte de carbono e energia 
- Fonte de Nitrogénio, Fósforo, Enxofre, Magnésio, Cálcio, Potássio, etc. 
- Trace elements (Zn, Mn, Cu, Co, etc.) necessários para o metabolismo, metaloenzimas 
- Alguns organismos requerem vitaminas adicionais (biotina, riboflavina) 
- Input contínuo de O2 (principalmente na fermentação aeróbica) 
- Agentes de permeabilização – facilita a excreção dos metabolitos 
- Adição de tampão ou controlo com adição controlada de ácido e base 
- Agentes anti-espumantes* – óleos naturais ou sintéticos (girassol, azeite, silicone) 
- Adição de Indutores, Inibidores ou Precursores em alguma etapa 
*A espuma pode interferir na relação do microrganismo com os gases (p.ex. O2) e também cria condições que 
facilitam a instalação de contaminações 
› Para escolha dos materiais a usar, devemos considerar: 
- Custo e disponibilidade 
- Transporte e Armazenamento 
- Requisitos de esterilização e possíveis problemas de desnaturação 
- Caraterísticas na formulação, mistura, viscosidade – influencia a agitação, oxigenação e espuma 
- Níveis de impurezas 
- Implicações para a saúde e segurança 
› Substratos rapidamente metabolizados podem reprimir a formação do produto - Adição intermitente ou 
contínua de meio fresco pode ser realizada para manter uma concentração não repressiva. 
› Certos nutrientes do meio, condições ambientais podem afetar a fisiologia, a bioquímica, e a morfologia 
do microrganismo, influenciando o rendimento do produto e outras propriedades de fermentação. 
 Fontes de Carbono: Melaços; Amido; Extrato de malte, Celulose, Soro do leite; Alcanos e Álcoois 
(Metanol e Etanol); Óleos (de plantas); 
 Fontes de Nitrogénio: Licor de maceração de milho; Extratos de leveduras; Peptonas; Farinha de soja 
 
Processo de Fermentação 
 Crescimento de grandes quantidades de células, em condições aeróbicas ou anaeróbicas, dentro de um 
frasco denominado fermenter ou Bioreator 
 Num Bioreator 
- Cultivação de células 
- Biotransformação de Célula/Esporo vegetativo 
- Transformação enzimática 
 Fermentação Convencional (Submergida) 
- Meio líquido, em condições aeróbicas ou anaeróbicas 
- A maioria é mexida (stirred), oxigenadas e assépticas 
- Crescimento suspendido – células livres no meio interagem como unidades simples ou agregadas 
- Podem aparecer gradientes de oxigénio e nutrientes 
 Fermentação em Meio Sólido (Emergida) 
- Desenvolvimento de células como biofilme, formam uma comunidade complexa interativa 
- Pode haver sistemas líquidos onde se encontram partículas de apoio ao crescimento 
 Bioreator inconvencionais 
- Processos mais específos e de maior valor 
- Produção de anticorpos monoclonais extraídos do fluido ascítico de roedores 
- Vacinas produzidas no leite de ovelha 
- Produtos recombinantes produzidos em plantas 
 Design de Bioreatores 
› De acordo com o processo de fermentação que vai ocorrer 
› Desenhado para suportar grandes quantidades de biomassa que varia com cada tipo de fermentação 
› Aplicação de sensores para controlo para controlar os parâmetros da fermentação, de acordo com as 
necessidades do processo e do microrganismo como: 
- Taxa de agitação (se estiver muito viscoso, aumentar) 
- Níveis de oxigénio 
- pH 
- Temperatura 
- Produção de espuma 
› Material do fermentador 
- Não tóxico e resistente à corrosão 
- Simples de esterilizar e limpar 
- Fermenters comuns - Aço inoxidável ou vidro 
- Fermentadores de maior tamanho – Aço normal forrado com vidro ou plástico 
› Esterilização 
- Canais de transporte de ar esterilizados com vapor 
- Evitar ângulos para não serem usadas junções ou tubos horizontais 
- Para limpeza são usados jatos de spray localizados no interior dos recipientes 
- Obrigatório ter válvulas de pressão de segurança 
- Evitar bombas para fornecer compostos 
› Um processo controlado mantém um balanço de massa e energia do início ao fim: 
› Propriedades Intensivas – Independentes do tamanho do sistema, não incluídas no balanço 
– Temperatura, concentração, pressão e calor específico 
› Propriedades Extrínsecas – Parâmetros termodinâmicos 
– Massa, volume, entropia e energia 
 
› Agitação – Mistura das 3 fases deve originar condições homogéneas 
- líquida (meio – nutrientes e metabolitos); 
- gasosa (O2 e CO2 e outros se necessário); 
- sólida (biomassa e substratos) 
- Diminui a grossura do film formado na interface líquido-gás 
- Mantém as forças de cisalhamento normais 
- Evita agregação ou crescimento nas paredes do tanque 
- Stirred tank reactor - as placas giratórias num eixo central, estão organizadas de forma a não criar 
vórtex (cria espaços mortos, sem aproveitamento do meio). Podem criar forças de cisalhamento que 
danificam as células 
- Airlift fermenters – Sistemas Pneumáticos - utiliza a expansão do gás para agitação. O gás é 
adicionado no fundo do tanque, fazendo com que as bolhas subam e criem um fluxo ascendente 
- Deep-jet fermenters – Sistema Hidrodinâmico - utiliza uma bomba que externa que faz bombear o 
líquido do tanque para um tubo que o redireciona de novo para o tanque 
 
Modos de Operação 
 BATCH 
- Sistema fechado – não há adição de nutrientes após inoculação, podendo ser adicionados agentes para 
controlo de pH e input de ar para fermentações aeróbicas 
- Down-time – período após colheita do produto no qual o tanque é limpo antes de recomeçar o ciclo 
- Produção de metabolitos secundários 
- DesvantagensNão é possível prolongar a fase exponencial por isso não produz muita biomassa ou metabolitos 
primários 
Durante a fase lag, o sistema não é produtivo 
Grande frequência na limpeza e esterilização têm grande custos e degradam o material 
 Fed-BATCH 
- Sistema aberto – há adição de nutrientes extras, aumentado o volume da fermentação. Pode ser um 
adição contínua, descontínua ou de uma só vez, normalmente quando acaba a fase de crescimento 
rápido 
Sempre que há adição de nutrientes, há risco de contaminação 
- Vantagens 
Pouca quantidade de meio inicial 
Podemos prolongar a fase de crescimento 
Ultrapassar problemas associados a nutrientes rapidamente metabolizados 
 Continuous 
- Sistema aberto – há adição contínua de novo meio à mesma taxa em que há remoção do meio antigo, 
sendo possível prolongar o crescimento por longos períodos 
- Fase Estacionária – é necessário atingir esta fase onde a quantidade de nutrientes e o número de 
células não varia 
- Bons para produção de biomassa e metabolitos primários 
- Desvantagens 
Mais difícil de aplicar pois requer estudos para alcançar a fase estacionária 
A operação impõe pressões seletivas que pode levar ao aparecimento de mutações menos produtivas 
 
Downstream Process 
 Colheita 
› O produto é libertado do meio - necessário separar das células 
› O produto é intercelular – necessário lisar as células e remover o produto 
- As células são recolhidas para lise. Depois é necessário isolar o produto, por centrifugação ou 
filtração e posterior purificação 
 
› Remoção das células 
- Células de grandes dimensões: Sedimentação, Centrifugação ou Filtração (p.ex. leveduras) 
- Células de pequenas dimensões: Filtros com poros menores; Maior força de centrifugação ou Adição 
de sal (alteração do meio para formação de agregados de células) 
› Remoção do produto 
- Proteínas ou compostos orgânicos - Precipitação, Cromatografia, Diálise 
Cristalização ou Liofilização para maior grau de pureza 
Aminoácidos 
► L-Ácido Glutâmico 
 Não essencial; metabolito primário 
 Aplicações 
- Alimentação - intensificador de sabor e suplemento nutricional 
- Cosmética – restaurador de cabelo e antirrugas 
- Agricultura / Ração animal – aditivo alimentar 
- Intermediário para produção de outros produtos químicos orgânicos 
 Produção 
- Antes de 1960 era colhido de plantas 
- 1957 – isolado a partir de Corynebacterium glutamicum 
- Produzido através da glucose, é um intermediário do ciclo de ácido tricarboxílico (Ciclo de Krebs). – 
Formado por transformação de 2oxoglutarato pela desidrogenase de glutamato 
- Biotina – substrato do ciclo de Krebs (na conversão de oxaloacetato e Acetil-CoA em Citrato e na 
produção de ácidos gordos a partir de Acetil-CoA) 
 Sobre-expressão 
- Limitação de biotina leva a acumulação de sucinil-CoA. Essa acumulação bloqueia o complexo de 
oxoglutarato desidrogenase (ODHC), forçando o fluxo no sentido da formação de glutamato 
- 1ª fase 
Seleção de strain de sobre-expressão através de mutagénese. Obtiveram mutantes auxotróficos 
e regulatórios; resistentes a fagos 
- 2ª fase 
Recombinação de DNA para aumento da atividade de enzimas biosintéticas específicas 
- Envolveu: 
Remoção dos mecanismos de feedback 
Bloqueio das vias que levam a produtos indesejados e das vias que degradam o produto 
Criação de mutantes que não produzem ODHC 
Criação de mutantes com maior permeabilidade para libertar o ácido glutâmico no meio 
Limitação de biotina; Restrição na biossíntese de fosfolípidos; Inclusão de surfactantes e 
penicilina 
 Processo de Fermentação: 
Produção em BATCH; em tanque de aço inoxidável 
Fonte de Carbono: carboidratos (glucose ou sacarose) Fonte de Nitrogénio: sais de amónio ou ureia 
Fonte de Magnésio, Manganês, Fosfato e Potássio – Sais inorgânicos 
pH 7-8 com adição de base – pH diminui com a produção do ácido glutâmico 
Recuperado por cristalização ao diminuir o pH, e depois filtrado 
► L-Lisina 
 Aminoácido essencial; metabolito primário 
 Inicialmente era obtida por fermentação em duas fases 
1ª – E. coli era usada para produção de ácido diaminopimélico (DAP) 
2ª – Enterobacter aerogenes produz lisina a partir de descarboxilação do DAP 
 Síntese Química 
Mistura de lisina D- e L- (o organismo produz apenas o L-) 
É necessária resolução ótica 
 Fermentação microbiana 
Produz apenas L-lisina 
 Fermentação de 1 fase envolve mutantes de Corynebacterium, Brevibacterium 
 Produção 
- Produção por Corynebacterium glutamicum 
- O primeiro passo da via metabólica é a conversão de ácido aspártico em aspartato semialdeído, 
catalisada pela aspartocinase, é regulado por feedback de inibição, pelos produtos finais: lisina e 
treonina. 
- A atividade da homoserina desidrogenase também é alvo de feedback de inibição pela treonina e 
repressão da metionina. 
- Feedback é uma inibição rápida de uma enzima associada a um produto final 
- Repressão é uma inibição mais lenta causada por inibição da tradução ou transcrição da enzima 
 Sobre-expressão 
- Os mutantes de C. glutamicum têm defeitos no mecanismo de feedback – Não produzem 
homoserina desidrogenase (auxotróficos de homoserina) 
- Convertem todo o aspartato em aspartato semialdeído 
- Adição de pequenas quantidades de treonina, metionina e isoleucina para haver crescimento 
 Processo de Fermentação 
- Cultura em BATCH ou Fed-BATCH, em tanques de aço inoxidável 
- Fonte de Carbono: carboidratos (melaço de cana) Fonte de Nitrogénio: Sais de amónia ou ureia 
- Fonte de Magnésio, Manganês, Fosfato e Potássio – Sais inorgânicos 
- Pequenas quantidades de homoserina ou metionina 
- Recuperada numa coluna de troca catiónica, após acidificação do meio. Solução de amónia diluída 
usada para eluição da L-lisina e reacidificação para cristalização da L-lisina