Nutricao e crescimento microbiano

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Nutrição e Crescimento Microbiano
Nutrição microbiana
Componentes necessários às células
Meios de cultura
Condições ambientais
Crescimento populacional
Velocidade de crescimento
Tempo de geração
Medidas do crescimento
Pelczar – Pg. 145 a 187
Brock – 108 a 114; 141 a 174
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Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados
Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas
Outros são tão exigentes quanto o homem
Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório:
	 - Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais
	 - Cultivo in vivo: quando não se conhece as exigências nutricionais
		
Exemplo de microrganismos que precisam de hospedeiro para ser cultivado: 
Mycobacterium leprae (causador da hanseníase)
- Glomus clarum (fungo simbionte)
Introdução
Nutrição de microrganismos
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Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais.
Os elementos químicos principais para o crescimento das células são denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P).
O carbono é um dos elementos mais importante para o crescimento microbiano.
	
Necessidade de meios de cultura adequados
Com exceção para CO2, os compostos orgânicos são os que contém carbono
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	Macronutrientes: 	- Necessários em grande quantidade. 
		- Tem papel importante na estrutura e metabolismo.
	Micronutrientes: 	- Necessários em quantidades mínimas.
		- Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas
 célula
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Componentes necessários às células
Macronutrientes
Fonte de carbono:
	- Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):
	 carboidratos
 	 lipídeos 
 	 proteínas
	- Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos): 
		É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou de outros 	compostos inorgânicos.
Fonte de Nitrogênio:
	- É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.
 	 (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)
	moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos)
	moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2)
A capacidade de algumas bactérias em utilizar o nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental importância para a vida de todos os seres.
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Hidrogênio:
Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases) 
Função:
Manutenção do pH
Formação de ligações de H entre moléculas 
Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração
Componentes necessários às células
Oxigênio:
 - Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos)
 - É obtido a partir das proteínas e gorduras.
	Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.
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P 	– Síntese de ácidos nucléicos, ATP
S 	– Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas
K 	– Estabilidade dos ácidos nucléicos, bomba de Na/K
Mg	– Estabilidade dos ribossomos
Ca 	– Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos
Na 	– Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. 		 Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15 % de sal.
Fe 	– Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das 	 	 	 proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
Componentes necessários às células 
Outros macronutrientes:
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Metais em quantidades muito pequenas (traços) na composição de um meio de cultura:
	Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)
	- Nem sempre sua adição é necessária
	- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra
 pura podem apresentar deficiências desses elementos.
Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte
 	 o N2 para NH3 durante a FBN.
Componentes necessários às células
Micronutrientes
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Água:
Componente absolutamente indispensável 
	(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)
	No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.
Outros aditivos:
 	Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH: 
Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos
	EDTA, ácido cítrico, polifosfatos.
Inibidores
	Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger
	Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico
Água e outros aditivos
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Tampões	
	- Carbonato de cálcio
	- Fosfatos					
	- Proteínas (peptona)
Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.
	
	Ex: celulose induz a celulase
	 pectina induz a pectinase
	 amido induz a amilase 
Antiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma
Remoção de células, perda do produto, contaminação
Redução do volume do meio
	álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas
	
	Outros aditivos
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Meios de cultura
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Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as necessidades nutricionais
Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais.
 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.
Meio de cultura solidificado com 1,5 % de ágar.
Até 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos.
Robert Koch introduziu os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras).
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Meios de cultura
Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades.
	Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies
	Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex.
Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey
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	Meios especiais
Meios para anaeróbios: adição de agentes redutores (tioglicolato de sódio)
Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros.
	Ex. meio ágar verde brilhante.
Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista.
	Ex. meio com sangue para distinguir as hemolíticas.
Meios seletivos/diferenciais:
 	Ex. Meio McConkey que contém sais de bile e cristal violeta.
Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espécie sem inibir as demais. 
	Ex. isolar bactérias que oxidam fenol, fornecendo fenol como única fonte de carbono.
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Microplacas com diferentes meios de cultura para identificação de enterobactérias.
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Meios de cultura para bactérias
Normalmente imitam o habitat normal
	Ex.
	Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado no meio de cultura.
	
Meio definido para quimioautotróficas
Meio definido para heterotróficas
Meio complexo para heterotróficas
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Meios de cultura para fungos
Todos os fungos são heterotróficos
	Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja.
	Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactérias. 
	Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.
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Meios de cultura para algas
As algas utilizam luz como energia, dióxido de carbono, água e íons inorgânicos solúveis. São fotoautotróficos.
	Ao contrário dos meios para bactérias e fungos, existem poucos meios prontos para algas.
	
	Preparar um meio definido para algas marinhas pode ser muito trabalhoso, pois muitos sais contidos na água do mar poderão ser necessários.
Maré vermelha.
Algas que produzem toxinas. 
Algas unicelulares 
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Crescimento Microbiano
Aumento em tamanho da população
Aumento no número de células
Aumento da massa celular
Duplicação
Fissão binária
Tempo de geração
Curva do crescimento microbiano
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19
Crescimento microbiano
Varia de organismo para organismo
Ocorre via diferentes gerações: tempo de geração (cada duplicação-fissão de uma célula)
ProteínasFts: filamentous termperature sensitive. Relação com a tubulina de eucariotos
Proteínas Min (para a formação do divisomo)
Proteínas Mre definem a morfologia da célula
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20
Crescimento microbiano
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21
Crescimento microbiano
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22
Peptideoglicano
Molécula lipídica
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Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células 
Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão
	
Varia de minutos até dias
Depende muito das condições ambientais
CRESCIMENTO MICROBIANO
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O padrão de crescimento é o exponencial
- sendo a população inicial = N0
1ạ geração N = N0 x 21
2ạ geração N = N0 x 22
3ạ geração N = N0 x 23
nạ geração N = N0 x 2n
população final (N) = N0 x 2n 
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Crescimento microbiano
 Número de gerações (n) = 3,3 (logN - LogNo)
Tempo de geração: tempo necessário para a divisão das células
depende da espécie e das condições de crescimento
g = t/n, onde:
g = tempo de geração
t = tempo de crescimento
n = número de gerações dentro de um tempo t de crescimento
E. coli: 20 min
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Curva de crescimento Microbiano
A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana
O crescimento de microrganismos apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento [lag, exponencial (log), estacionária, declínio ou morte)
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27
Fase Lag
		Período de adaptação da cultura
Mudança de meio, preparação do complexo enzimático
Reparação das células com danos.
2) Fase exponencial
 		Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo.
A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as velocidades de crescimento são bastante variáveis:
	 - Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos
	- Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores
Curva de crescimento Microbiano em Sistema Fechado (Batelada)
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3) Fase estacionária: 
		Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial não pode ocorrer indefinidamente.
Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos.
		Divisão = morte → crescimento líquido nulo
		Ainda pode ocorrer catabolismo e produção de metabólitos secundários
4) Fase de morte (declínio):
A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as células ao processo de morte.
		A morte celular é acompanhada da lise celular
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Quimiostato
Controla a velocidade
de crescimento
Densidade controlada
pela concentração
dos nutrientes
Crescimento Microbiano em Sistema Aberto (Quimiostato)
30
30
MEDIDAS DO CRESCIMENTO
Podem ser realizadas pelos seguintes métodos:
	1) Peso seco total das próprias células
		filtração, secagem e pesagem
	2) Peso de algum componente celular
		 extração, secagem e pesagem
	3) Variação no número de células
	 a) contagem de células totais (direta)
	 b) contagem de células viáveis (indireta)
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	Contagem microscópica direta
Vantagens: método rápido e fácil
Desvantagens:
	Não distingue as células vivas das mortas
	Pode-se omitir células pequenas
	Células móveis precisam ser imobilizadas
Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada)
Ex.: Câmara de Neubauer
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Contagem de células viáveis (indireta)
Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.
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São empregadas várias diluições decimais porque é difícil prever o número de viáveis.
É contada a placa com 30 a 300 colônias
Diluição das suspensões celulares
	Amostras concentradas precisam ser diluídas
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MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO - Outros métodos
	- Turbidimetria
	As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio
	Pode ser medida com um espectrofotômetro
 O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão
 Turbidez X quantidade de células
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- Contagem eletrônica
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Fatores que afetam o crescimento
Fatores químicos: 
pH:
neutrófilos – pH ≈ 7.0
acidófilos – pH < 7.0
alcalófilos – pH > 7.0
Importância:
Atividade enzimática
Conformação protéica
Disponibilidade de metais e elementos orgânicos
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Fatores que afetam o crescimento
Fatores químicos: 
O2:
Aeróbicos obrigatórios
Anaeróbicos obrigatórios
Anaeróbicos facultativos
Microaerófilos
Aerotolerantes
Importância:
Respiração
Reações de óxido-redução
Atividade enzimática
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39
 Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio 				 aerotolerante
Efeito do oxigênio no crescimento microbiano
Meio gelatinoso com indicador redox:
Rosa quando oxidado
Incolor quando reduzido
Durante as reações de redução do O2 são formados vários intermediários tóxicos.
Ex: H2O2, OH°, O2-
Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase e peroxidase para destruir as formas tóxicas
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Sistema para cultivo de anaeróbios
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Quinto nível
Sistema para cultivo de aeróbios
Equipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura
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Fatores que afetam o crescimento
Fatores físicos: 
Temperatura:
Psicrófilos: - 5 C a 20 C
Mesófilos: 20 C a 50 C
Termófilos: 50 C a 80 C
Termófilos extremos: acima de 80 C
Importância:
Respostas enzimáticas
Respostas a choques térmicos
Razão de crescimento
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43
44
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Chlamydomonas nivalis
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Estratégias de adaptação às altas temperaturas
membranas
ácidos graxos: Archaea não tem ácidos graxos nas membranas (têm hidrocarbonetos C40 com unidades de isopropeno
monocamada lipídica
proteínas
tipo de aminoácido: conferem conformação distinta
velocidade de renovação das células
Taq polimerase (Thermus aquaticus)
ácidos nucléicos
maior concentração de C≡G
solutos: 
di-inositol fosfato
diglicerol fosfato
manosilglicerato
Fatores que afetam o crescimento
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46
Fatores que afetam o crescimento
Fatores físicos: 
Pressão osmótica (NaCl):
Halotolerantes
Halófilos
Halófilos extremos
Pressão hidrostática
Barotolerantes
Barófilos
Não devem existir grandes diferenças na concentração de solutos dentro e fora da célula, pois podem desidratar-se ou romper-se.
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47
Habitat de Archaea:
Great Salt Lake (2460 km2, 
Utah, EUA
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Fatores que afetam o crescimento
Fatores físicos: 
Textura do substrato
Estrutura do substrato
Porosidade do substrato
Agregação do substrato
Água do substrato
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Fatores que afetam o crescimento
Fatores biológicos:
Fauna e o substrato
Ingestão
Ciclagem de nutrientes
Composição da comunidade
Interações microbianas
Neutralismo
Comensalismo
Protocoperação
Mutualismo
 Competição
 Amensalismo/Antagonismo
 Parasitismo
 Predação
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50
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Interações entre Organismos que Afetam o Crescimento Microbiano
Moreira & Siqueira, 2006
A depende de B em termos de:
Síntese de substratos
Destoxificação do ambiente
Associação de benefícios mútuos para A e B, porém sem dependência obrigatória ou especificidade
Interação obrigatória e específica entre A e B que traz benefício para ambos parceiros e cuja ausência os prejudica
Inibição mútua quando A e B interagem em função da utilização de recursos necessários à sobrevivência (nutrientes, O2, etc.)
Microrganismo B prejudica o microrganismo A sem obter benefício direto desta ação
(Ex. produção de antibióticos)
Interação específica entre o microrganismo B (parasita) que obtém benefício em detrimento do hospedeiro A (habitat)
Associação entre A (presa) e B (predador)
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Matéria seca
Água
C
N
H
P, S, K, Na ...
Gráf6
	Matéria seca
	Água
30
70
Plan1
	
			Matéria seca	30
			Água	70
			C	51
			N	12
			H	7
			P, S, K, Na ...	30
				100
Plan1
	
Plan2
	
Plan3
	
	
Gráf7
	C
	N
	H
	P, S, K, Na ...
51
12
7
30
Plan1Matéria seca	30
			Água	70
			C	51
			N	12
			H	7
			P, S, K, Na ...	30
				100
Plan1
	
Plan2
	
Plan3