Aulas_19_e_20_Contagem_de_células_viáveis_em_placas

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Aulas 18 e 19 – Quantificação do crescimento microbiano 
1 EMBASAMENTO TEÓRICO 
 
1.1 Introdução 
Mensurar a presença de bactérias em dada amostra por vezes é um procedimento 
interessante, como nas indústrias alimentícias quando há a necessidade de averiguar o 
quão contaminado está um alimento e decidir se ele pode ser consumido levando em 
consideração a legislação vigente, ou ainda para os ecólogos quando desejam determinar 
e identificar as parcelas de microrganismos que habitam dado ambiente. 
A amostra a ser contabilizada pode ser líquida, como suco ou água de um poço, 
ou sólida, como massas e amostras de solo. Como é de se imaginar, amostras como essas 
apresentam uma quantidade enorme de células, onde resultaria em contagens 
praticamente impossíveis de realizar pelos métodos a seguir. Portanto há a necessidade 
de sempre diluir a amostra a ser contabilizada, empregando a metodologia das diluições 
seriadas. 
A diluição seriada consiste em, a partir de uma dada amostra devidamente 
homogeneizada que representa o material coletado, uma pequena parte deva ser misturada 
à água destilada ou qualquer outra substância que venha a servir como diluente, 
resultando em uma outra solução cuja quantidade de células seja bem menor que a 
primeira. Isso é importante para gerar uma amostra passível de ser contada com precisão 
e confiabilidade estatística, representando a partir de uma solução extremamente diluída 
a concentração presente na amostra inicial. 
Existem vários protocolos e metodologias que podem ser utilizados para realizar 
procedimentos de contagem, os mais simples e úteis serão comentados aqui, mas saiba 
que não existem apenas esses, sendo importante sempre procurar aquele que mais se 
adeque a amostra de interesse. De forma geral, são classificados em dois tipos: a 
contagem direta e indireta. Como os próprios nomes sugerem, na contagem direta o 
manipulador conta célula a célula, sendo a forma mais simples utilizando lâminas 
especiais para microscópio que custam no mínimo R$: 150,00, ou até mesmo 
equipamentos caríssimos, como os de citometria de fluxo. Já os métodos indiretos não 
visualizam as células em si, mas sim o resultado de sua multiplicação, como as colônias 
em placa ou o turvamento de culturas em caldo. 
 
1.2 Contagem direta de microrganismos 
 
1.2.1 Microscopia 
 A contagem direta por microscopia é interessante nos casos onde o tempo é um 
fator limitante para a amostra, já que não é necessário realizar um novo cultivo dos 
microrganismos, e também quando se deseja obter informações taxonômicas a respeito 
de uma diversidade de células presentes na amostra, já que é possível empregar 
colorações específicas para células que apresentem características específicas de dado 
grupo, gênero, ou ainda espécie, sendo geralmente relacionado com marcação de 
florescência de algum componente proteico expresso por aquelas células. 
 Diferente como você verá adiante com os métodos que envolvem o plaqueamento 
de amostras, na microscopia é imprescindível amostras concentradas em 
microrganismos, algo em torno de um milhão de células por mL para que bons resultados 
sejam alcançados. Isso é requerido para viabilizar o emprego da câmara de Petroff-
Hausser, uma espécie de lâmina especial onde há um poço cujo volume é conhecido, nele 
há quadrantes de área conhecida, onde o manipulador deve contabilizar o número de 
células nos quadrantes e multiplicar pelo fator multiplicativo referente, resultando no 
número de bactérias por mililitro. 
 Outro dispositivo similar é a Câmara de Neubauer, utilizado não para contagem 
de bactérias, mas sim de células eucarióticas, como as leveduras. Também possui poços 
padronizados e marcados, porém com algumas diferenças para comportar células 
maiores. São amplamente utilizadas em outras áreas das ciências biológicas, como na 
hematologia, onde auxiliam os profissionais a realizar a contagem dos tipos celulares que 
compõe o sangue, fornecendo dados para o exame sanguíneo mais básico de todos, porém 
indispensável para os diagnósticos, o hemograma. 
Figura 8.1 – Câmara de Neubauer utilizada para contagem de 
células diretamente sob o microscópio. 
Fonte: o autor 
O emprego dessas técnicas para contabilizar bactérias no dia a dia enfrenta 
algumas complicações sérias. Mesmo aplicando as devidas colorações para diferenciar 
células vivas das mortas é bem possível que o manipulador contabilize células inviáveis, 
o que acumula erros estatísticos ao número final, podendo gerar resultados altamente 
imprecisos. Em adição, alguns microrganismos possuem células extremamente 
diminutas, sendo bem difíceis de visualizar mesmo com lente de imersão, dessa forma 
células podem facilmente passar despercebidas aos olhos do manipulador. 
 
1.3 Contagem indireta de microrganismos em placa - Pour Plate e Spread Plate 
 A contagem indireta que emprega placas parte do pressuposto de que as colônias 
visualizadas após o tempo de incubação foram originadas a partir de replicações 
sucessivas de uma única célula primordial que se depositou naquele ponto do meio. Dessa 
forma, as replicações sucessivas foram capazes de gerar um número de células clonais 
tão grande ao ponto de que juntas pudessem ser visualizadas macroscopicamente, 
fundamentando assim o conceito de colônia. 
 Porém, é sabido que o desenvolvimento bacteriano na prática não necessariamente 
condiz com essa teoria, já que há espécies de bactérias que geram colônias a partir de 
pequenos aglomerados de células, outras a partir de pequenas cadeias, sendo o resultado 
final idêntico. Essa importante observação levou a um novo parâmetro que pudesse 
englobar essa realidade para o objetivo das técnicas de contagem. 
 Para contagem em placas é adotado que cada colônia é formada a partir de uma 
unidade formadora de colônia (UFC), abrangendo assim tanto espécies que formam 
agregados de células ou não. 
 De forma contrária ao que já foi citado no tocante da contagem direta, para realizar 
contagens em placa é estritamente necessário realizar uma diluição seriada da amostra 
original. Fatores como espaço físico disponível, bem como nutrientes e excesso de 
metabólitos secundários resultantes do desenvolvimento dos microrganismos podem 
afetar o desenvolvimento de UFCs em placas contendo uma amostra demasiadamente 
concentrada, bem como a elevada carga microbiana se desenvolve em colônias 
impossíveis de serem contabilizadas devido ao seu tamanho bastante reduzido, 
impossibilitando a identificação dos limites das colônias. (Fig. 8.2) 
Figura 8.2 – Spread plate de diluições seriadas 
Da esquerda superior até a direita inferior as placas receberam inóculo de 10⁻¹ até 10⁻⁷. Note que a diferença 
de UFCs contáveis é clara entre as concentrações. É estatisticamente confiável para contagem uma placa 
que contenha entre 30 e 300 UFC. 
Fonte: o autor. 
Tão grave quanto ocorre se a amostra a ser contada estiver diluída em excesso. O 
manipulador irá contabilizar um número baixo de células que não condiz com um 
intervalo estatisticamente confiável para representar com confiança a real quantidade de 
células da amostra original a partir daquela diluição. Como padronização do método é 
utilizado um intervalo de 30 a 300 UFC como confiável estatisticamente. 
 É importante salientar que é recomendado um inóculo purificado para realizar a 
contagem, visto que bactérias diferentes possuem necessidades fisiológicas diferentes, 
podendo resultar em leituras errôneas devido a subdesenvolvimento de UFCs devido à 
carência nutricional ou tempo insuficiente para o desenvolvimento. Para isolados 
contendo bactérias não fastidiosas pode ser empregado o meio Plate Count Agar (PCA), 
quando houver alguma necessidade nutricional o mesmo deverá ser devidamente 
suplementado. Contudo, também é usual o emprego de meios seletivos e/ou diferenciais 
para contar um determinado tipo de microrganismo a partir de uma amostramista. 
 O Spread Plate utiliza uma Alça de Drigalski para espalhar o inóculo sobre a 
superfície do meio, já o Pour Plate utiliza o inóculo aplicado diretamente no meio de 
cultura ainda líquido, onde movimentos suaves são responsáveis por homogeneizar a 
mistura de ambos. O resultado de ambas as técnicas é visualmente característico, a 
primeira resulta em um crescimento superficial e bem espalhado, já a segunda gera um 
crescimento difuso com colônias reduzidas crescendo não somente na superfície, mas 
também na porção interna do meio. 
 
2 PRÁTICA N° 8 - CONTAGEM DE VIÁVEIS EM PLACA 
2.1 Materiais 
-Cultura bacteriana em caldo; 
-Tubos falcon com salina estéril; 
-Pipeta automática com ponteiras estéreis; 
-Agitador; 
-Placa de Petri estéril; 
-Meio PCA em placa; 
-Meio PCA fundido; 
-Alça de Drigalski. 
2.2 Metodologia 
2.2.1 Pour Plate 
-Assepticamente, transportar uma alíquota de 1 mL da cultura em caldo para um tubo 
contendo salina; 
-Homogeneizar no agitador (agora sua amostra este diluída à 10⁻¹); 
-Continue diluindo até a concentração de 10⁻⁷; 
-Assepticamente, despeje 1 mL da suspensão bacteriana diluída em uma placa de Petri; 
-Despeje o meio PCA líquido sobre o inóculo (certifique-se que a termperatura esteja 
adequada para não ocorrer a morte do inóculo); 
-Realize movimentos circulares para homogeneizar e espere solidificar; 
-Incubar em condições ótimas por 24 Hrs; 
-Realizar a contagem de colônias; 
-N° colônias contabilizadas (entre 30 e 300) x diluição da amostra = UFC/mL 
2.2.2 Spread Plate 
-Assepticamente, transportar uma alíquota de 1 mL da cultura em caldo para um tubo 
contendo salina; 
-Homogeneizar no agitador (agora sua amostra está diluída à 10⁻¹); 
-Continue diluindo até a concentração de 10⁻⁷; 
-Pipetar 0,1 mL da suspensão bacteriana em placa contendo meio PCA sólido; 
-Espalhar o líquido utilizando a Alça de Drigalski; 
-Incubar em condições ótimas por 24 Hrs; 
-Realizar a contagem de colônias; 
-N° colônias contabilizadas (entre 30 e 300) x diluição da amostra = UFC/mL 
 
3 EXERCÍCIOS 
- Quais as diferenças entre o Spread Plate e o Pour Plate quanto à metodologia? 
-O resultado deles é o mesmo? 
-O que é uma unidade formadora de colônia? 
-Por que devemos realizar a diluição seriada das amostras antes de realizar a contagem? 
Como seria esse processo? 
 
 
REFERÊNCIAS 
LEBOFFE, M. J.; PIERCE, B. E. Section 18: Quantitative Microbiology. In: 
LEBOFFE, M. J. (Ed.). A Photographic Atlas for the Microbiology Laboratory. 4. 
ed. La Mesa: Morton, 2011. p. 217–222. 
MADIGAN, MICHAEL T. et al. Cap. 5: Crescimento e controle microbiano. In: 
MADIGAN, M. T. (Org.) Microbiologia de Brock. 14. ed. Porto Alegre: Artmed, 
2016. p. 143–182. 
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L Cap. 6: Crescimento Microbiano. In: 
TORTORA, G. J. (Org.) Microbiologia. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. p. 156 - 
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