CADERNO DE AULAS PRATICAS-MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS _)

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· 14/08/2020 - Aula Prática 1: Análise microbiológica de Bactérias Mesófilas 
· Mesófilas: bactérias que crescem em temperatura ambiente (t ótima = t ambiente). 
· A maioria dos microrganismos, inclusive os patógenos (causadores de doenças) são mesófilos.
· Objetivo: realizar a contagem de bactérias mesófilas. 
· A legislação não possui um parâmetro específico para elas, portanto este tipo de análise acaba sendo meramente qualitativa, como uma forma rápida e barata de avaliar a qualidade e os riscos que meu produto pode apresentar, sem a necessidade de um laudo completo. 
· Exemplo: avaliar o efeito do ar condicionado no desenvolvimento dos microrganismos em minha matéria prima.
· Meio de cultura: seletivo– todas as bactérias crescem com a mesma coloração.
PCA→ Plate Count Ágar: padrão de contagem em placa→ Crescimento de bactérias. 
TSA→ Proteína à Base de Soja. 
· Temperatura de incubação: 
-Bactérias mesófilas: temperatura ambiente (32°C/24-48h) → Suporta altas temperaturas!
-Bactérias psicrófilas: 10°C/ 5 dias → Crescimento em temperaturas menores.
-Bactérias termófilas: crescem em altas temperaturas, são extremamente raras em alimentos, portanto não existe legislação específica para este tipo de análise. Além disso, as altas temperaturas podem desnaturar o ágar, inutilizando o meio de cultura.
· Tipo de Análise: Análise em profundidade → Primeiro a amostra e depois o meio de cultura (o meio de cultura deve estar morno para não ocasionar a morte do microorganismo).
· Controle de qualidade: parâmetro.
Procedimento para análise de bactérias mesófilas em leite industrializado (UFC/mL):
· Realizar a preparação do meio de cultura;
· A análise deverá ser feita ao lado do bico de bunsen ou em uma câmara de fluxo laminar para garantir a esterilidade;
· Limpar a embalagem do produto com algodão embebido em álcool 70%, passando na embalagem inteira para manter apenas a contaminação do leite. 
· Verificar as instruções de preparo do meio de cultura: dissolver em água fervente, transferir para um erlenmeyer, fechar com o algodão hidrofóbico, selar com papel craft e autoclavar;
· O leite deverá ser homogeneizado (25 agitações de acordo com a legislação);
· Utilizamos solução salina (0,85%: 0,85 g de sal para cada 100 ml de água) por motivos financeiros ou água peptonada (necessária preparação ou compra);
· Serão feitas 5 diluições, pois o alimento foi processado (passou por tratamento térmico, logo possui uma menor quantidade de microrganismos, sendo necessárias menos diluições para análise de UFC (unidades formadoras de colônia));
· Transferir 9 ml de solução salina para 5 tubos de ensaio designados e esterilizados com a solução salina;
· NUNCA ESTERILIZAR A AMOSTRA NO BICO DE BUNSEN!
· A partir da caixa de leite (diluição 100), retiro com o auxílio de uma pipeta esterilizada 1 ml de amostra para um tubo de ensaio (previamente esterilizado) com 9 ml de solução salina 0,85% (diluição 10-1). Fecha-se o tubo com algodão hidrofóbico e agitamos a solução com o auxílio do Vortex;
· Em seguida retiramos o algodão momentaneamente, flambamos a boca do tubo de ensaio com o auxílio do bico de bunsen, e com uma nova pipeta tomamos uma alíquota de 1 ml transferindo-a para um novo tubo de solução salina e selamos com algodão hidrofóbico (diluição 10-2);
· Repete-se esse procedimento até a diluição 10-5;
· Transfere-se uma alíquota de 1 ml de cada diluição com auxílio de pipetas esterilizadas para as respectivas placas de petri, submergindo-as com meio de cultura morno previamente preparado (análise de profundidade), realizando movimentos em formato de 8 para homogeneização;
· As placas devem ir para a estufa a 32°C de 24-48h para que haja o crescimento dos microrganismos.
Contagem das colônias:
· Escolha da placa: Seleciona-se a placa com maior quantidade de microrganismos que esteja entre 25-250 colônias→ Só realiza-se contagem de uma placa, naquela que tiver o valor mais próximo de 250 colônias, 
· Existe um app que realiza essa contagem de maneira superficial.
· Quantidade total: número de colônias contadas X a diluição escolhida.
· Exemplo: 100*1000 (10-3) = 100.000 UFC/mL.
· Legislação do leite (MAPA): INSTRUÇÃO NORMATIVA N° 62, DE 29 DE DEZEMBRO DE 2011→ A contagem deve ser da ordem de 5*102 UFC/mL.
· 17/08/2020 - Exercícios:
1. 
a) Quais as informações que um laudo pode trazer mesmo quando as bactérias analisadas se encontram PERTO do padrão microbiológico de contagem estipulado pela legislação? 
Nossa power-mega-ultra resposta:
Conclusões dos laudos dependendo dos critérios:
Plano de duas classes: utilizado para MO patogênicos e possui 2 conclusões: Aceita ou Rejeita (Pois c=0);
· Caso não haja presença do MO patogênico: "PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES".
· Caso haja presença do MO patogênico: "PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA O CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR (microrganismo patogênico ou toxina que representa perigo severo a saúde do consumidor). 
Plano de Três Classes: possuo três possibilidades de conclusão para o laudo microbiológico (utilizado para MO ligados a higiene):
· Se todas as minhas amostras estiverem abaixo do critério “m” estabelecido pela legislação:
"PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES" 
· Se alguma de minhas amostras estiver acima do critério “M” estabelecido pela legislação:
"PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA O CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR ..." 
· Se alguma de minhas amostras apresentarem carga microbiana dentro do intervalo estabelecido pelos critérios “m” e “M” (m < UFC < M), devemos analisar:
· Se o número de amostras nessa situação encontra-se abaixo do critério “n” estabelecido pela legislação: "PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES"
· Se o número de amostras nessa situação encontra-se acima do critério “n” estabelecido pela legislação: "PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA O CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR ..." 
Resumindo a resposta ideal: temos que analisar as conclusões do laudo e a contagem (pois qualquer aumento pode ultrapassar o estipulado pela legislação caso o número esteja muito perto do limite). A contagem é um detalhe muito importante, principalmente nos casos onde a amostra está beirando os limites, pois indica onde está o problema: se na higiene, se durante o processo, pelo detalhamento específico de cada microrganismo. Sabendo disso, posso achar a raiz do meu problema, mas tudo isso levando em conta o todo, o critério resultante de todos os lados das minhas amostras. A contagem é uma dica para melhoria do processo.
Análise microbiológica ≠ Critério microbiológico
· Análise microbiológica é individual de cada amostra (laudo), cada amostra gera um laudo;
· Critério microbiológico é um olhar para todas as amostras, quando analiso todas as minhas amostras (análises: um laudo para cada) pra tirar a conclusão sobre a qualidade da minha amostra.
b) Qual a legislação utilizada para identificar padrões microbiológicos em alimentos? Quando devo utilizar a Instrução Normativa? 
A legislação atual utilizada para identificação de padrões e critérios microbiológicos em alimentos é a RDC n° 12 01/2001. Tal resolução já foi revogada pela RDC n° 331 12/2019 para estabelecimento dos padrões de análises, juntamente com a Instrução Normativa N° 60 12/2019 que estabelece os critérios microbiológicos para análises indicativas e representativas, nos planos de duas ou 3 classes. Ambas entrarão em vigor a partir de 23/12/2020.
c) Como você explicaria o conteúdo da legislação para um leigo no assunto? (Lembre-se: este leigo precisa, para entender, de muitos detalhes). 
Tópicos necessários na resposta:
· Legislação voltada a alimentos (padrões microbiológicos para alimentos de consumo);
· Diferenças entre as amostras (indicativa, representativa e diferença nas análises- laudos separados);
· Dividida em grupos de alimentos e seus subgrupos, não podemos esquecer de frisar, que possuímos grupos de alimentos específico;
· Dentro deles iremos verificar os padrões microbiológicos: “m”, “M”, “c” e “n”.
Nossa resposta: Para evitar DoençasTransmitidas por Alimentos (DTAs) e garantir a segurança dos alimentos para o consumidor, as empresas devem seguir a diversas normas (dependendo de cada produção). Por exemplo: para produção de leite, utiliza-se o MAPA-Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento). Todos os segmentos da cadeia produtiva de alimentos devem fornecer as condições necessárias para proteger os alimentos enquanto estiverem sob seu controle, e se não estiverem seguros, podem causar consequências muito graves para a saúde pública.
Para as legislações utilizadas na microbiologia dos alimentos (estudo dos microrganismos que habitam, crescem e contaminam os alimentos) temos alguns critérios microbiológicos para avaliar se o alimento está apto para o consumidor, dividindo os grupos de alimentos (pois cada alimento tem características diferentes, podendo ter MO diferentes).
Utiliza-se algumas letras para estes critérios, que dizem respeito a contagem de microrganismos presentes nos alimentos.
· ”n”: número de amostras que foram analisadas;
· ”m”: é o limite aceitável de contagem microbiológica no alimento;
· ”M”: é o limite de contagem microbiológica no alimento (se forem valores acima do “M”, a amostra será rejeitada;
· ”C”: número máximo aceitável de amostras com contagem microbiológica entre “m” e “M”;
· Plano de duas classes: Utilizado para microrganismos patogênicos (são agentes patogénicos que podem provocar doenças e se manifestam através de vírus, bactérias, fungos e protozoários);
Possui 2 conclusões: Aceita ou Rejeita (Pois c=0);
· Plano de Três Classes: possuo três possibilidades de conclusão para o laudo microbiológico (para microrganismos ligados a higiene):
· Se todas as minhas amostras estiverem abaixo do critério “m” estabelecido pela legislação;
· Se alguma de minhas amostras estiver acima do critério “M” estabelecido pela legislação;
· Se alguma de minhas amostras apresentarem carga microbiana dentro do intervalo estabelecido pelos critérios “m” e “M” (m < UFC < M), devemos analisar:
· Se o número de amostras nessa situação encontra-se abaixo do critério “n” estabelecido pela legislação;
· Se o número de amostras nessa situação encontra-se acima do critério “n” estabelecido pela legislação;
*Lembrando que não existe zero de microrganismos dos alimentos! Para não ter problemas, os níveis de “contaminação” devem estar conforme a legislação.
Exemplo:
n1: 199 c = 02
n2: 500 m = 103
n3: 600 M = 104 
n4: 700 103<UFC<104 
n5: 950
Conclusão: Aceita, pois nenhuma das amostras passou da contagem de mil!
 
2. A partir dos planos de amostragem seguintes responda: 
plano 1: n=10 c=1; 1/10 = 0,1000 (10,00%)
Plano 2: n=25 c=4; 4/25 = 0,1600 (16,00%)
Plano 3: n=45 c=3; 3/45 = 0,0667 (06,67%)
Plano 4: n=90 c=1, 1/90 = 0,0111 (01,11%)
a) Qual o plano mais rígido? E o menos rígido? 
O plano 4 de amostragem é o mais rígido pois tolera uma menor porcentagem de amostras com qualidade intermediária aceitável (01,11%), enquanto o plano 2 é o de menor rigidez por apresentar maior porcentagem de tolerância para amostras de qualidade intermediária (16%).
Observação: Neste caso poderíamos analisar pelo “c”, no plano 4 n=90 e c=1, então é mais rígido (menos flexível), já no plano 2 n=25 e c=4, então é menos rígido (mais flexível).
b) Quais os motivos que levam o produtor a escolher um plano de amostragem mais rígido ou menos rígido? 
 A escolha do plano de amostragem é determinado em acordo com a legislação vigente que estabelece padrões para os critérios microbiológicos “c”=x para “n” amostras de acordo com o microrganismo, metabólito ou toxina analisados, cabendo ao produtor realizar as devidas proporções de acordo com o “n”retirado. O que impera é o padrão estabelecido pela legislação, o produtor pode escolher algo mais rígido ou não, nunca menos rígido.
3. A análise microbiológica de bolachas recheadas deve ser realizada a partir das seguintes análises: coliformes, Staphylococcus e Salmonella. As análises realizadas para um determinado lote têm seus resultados demonstrados a seguir: 
Defina se o lote deve ser rejeitado ou aceito e explique os motivos que o levou a chegar na sua 
conclusão. 
Na análise de coliformes, 2 das 5 amostras excederam o limite do critério "m", porém não ultrapassaram o valor máximo permitido ("M"), então as amostras estão com qualidade intermediária aceitável. Entretanto, o número de amostras intermediárias não passou das condições estabelecidas pelo critério "c".
Para a análise de staphylococcus 3 das 5 análises encontram-se abaixo dos limites estabelecidos na legislação configurando-se de acordo com os padrões legais vigentes, enquanto duas apresentam qualidade intermediária aceitável, não ultrapassando o número máximo tolerado para esta situação. 
Conclusão: LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES.
Observação: Em critério microbiológico não tratamos dos microrganismos isoladamente, mas sim do lote como um todo: ou aceito tudo, ou rejeito tudo. Se algum dos microrganismos estivesse fora dos padrões, rejeitaria o lote todo, independentemente de as outras análises estarem de acordo com a legislação.
· 21/08/2020 - Aula prática 2: Análise microbiológica de Bolores e Leveduras
Retomando a prática anterior:
→ A análise de bactérias mesófilas é importante para verificação da qualidade de um alimento, consigo verificar as concentrações de microrganismos. Apesar de não diferenciá-los, consigo verificar se o produto foi fabricado de forma correta.
→ Bactérias mesófilas não estão contempladas na legislação. Na RDC 331 temos alguns casos específicos, porém na RDC 12 já não.
→ Análise feita em profundidade: possibilita o desenvolvimento de microrganismos anaeróbios, aeróbios e facultativos, os quais se alocam na placa de acordo com suas necessidades.
→ Em contrapartida, na prática de hoje verificaremos uma análise em superfície e as diferenças proporcionadas entre ambas as análises.
Iniciando a prática de hoje:
· Microrganismos indicadores: uma grande quantidade de microrganismos que vão me demonstrar as condições de higiene do alimento analisado (se estamos utilizando as práticas de higiene corretamente);
Existem três grupos de microrganismos indicadores:
· Bactérias mesófilas: indicam a qualidade do meu produto;
· Bolores e leveduras: indicam a higiene do meu produto. Muito presentes no solo, frutas e vegetais, com o processo de higienização correto (temperaturas acima de 45°C) elimina-se esses microrganismos;
· Coliformes: veremos a frente.
· Motivo da presença de contaminação de bolores e leveduras: higiene (solução clorada 200 ppm: o fato de não ter deixado todos os produtos submersos na solução, ou não ter submergido nenhum), provavelmente o produto não sofreu as práticas de higiene de forma correta, excluindo a questão do colaborador.
· Exemplo do pão: não sofre problema de higienização, mas sim de processos. Um produto que provavelmente foi colocado na embalagem ainda quente. Como a farinha não sofre tratamento, o vapor da água encosta na embalagem fria e aumenta a umidade do produto.
· Pode ocorrer erro no tratamento térmico que permita a presença de bolores e leveduras. 
· Por exemplo: Iogurte não chega a temperatura de 45° C, então esses microrganismos podem crescer.
· Objetivos: enumeração de bolores e leveduras (contagem), identificação das características do grupo. A contagem é feita junta, pois ambos possuem o mesmo tipo de nutrição, não consigo separá-los. A legislação já traz o padrão para os dois juntos (exemplo: bolores e leveduras xx UFC/g);
· Análise em superfície:
Bolores: MO aeróbios (precisam de oxigênio para crescer); Morrem em temperaturas acima de 45°C, por isso a análise ocorre em superfície;
· Meio de cultura
· PDA- Batata Dextrose Ágar (Potato Dextrose Agar): acidificado (com ácido tartárico até atingir pH=3,5, pois só bactérias acéticas crescem nesse pH, diminuindo a probabilidadede contaminação drasticamente. Utilizamos esse ácido pois não muda o Ph drasticamente, diminuindo o risco de acidificar demais) ou com antibiótico (crescem muito bem com Cloranfenicol. Se as bactérias não crescem, não contaminam a amostra, assim tenho certeza de que a análise vai dar certo). 
· NÃO PODEMOS UTILIZAR OS DOIS, POIS UM PODE INIBIR O CRESCIMENTO DO OUTRO! (A acidez do meio inibe o antibiótico).
Observações:
· 3,5 é perto do ponto de hidrólise do ágar, tem que ser um valor muito exato (se o ágar hidrolisar fica líquido na placa);
· Mede-se o pH antes (quando for para a autoclave) e para confirmar depois de autoclavar, quando estiver morno. O correto para validação é medir antes e depois, podemos ter diferença de pH depois da autoclavação (medimos antes pois é mais fácil acidificar com o meio ainda líquido);
· Como as quantidades são muito pequenas, não preciso descontar da quantidade de água a quantidade de ácido/antibiótico adicionado;
· Antibiótico sempre em geladeira, para não perder a função (1 ou 2 gotas dependendo da concentração);
· Misturar sem formar bolhas (para facilitar);
· Geralmente solução de 10% de ácido tartárico, como é um ácido fraco, é mais fácil de trabalhar (não muda o pH bruscamente). Também já é inerente do meio, então não muda o ambiente da cultura;
· Se não acidificarmos, o meio pode ser contaminado por bactérias acéticas ou lácticas.
· Identificação:
· Se desejo identificar o tipo de bolor/levedura: preciso fazer uma análise de microcultivo, consegue me identificar qual é o tipo de bolor presente no meio, fazer a análise, contagem e depois o microcultivo.
· A placa só servirá para contar a colônia e achar o bolor que cresce pelo microcultivo;
· Procedimento de análise (amostra sólida em superfície)
· Esterilizar todo o ambiente de trabalho e equipamentos a serem utilizados;
· Análise feita ao lado do bico de bunsen ou em uma câmara de fluxo laminar;
· Realizar a preparação do meio de cultura. Verificar as instruções de preparação do meio de cultura: dissolver em água fervente, transferir para um erlenmeyer, selar com papel craft e autoclavar;
· Utilizamos solução salina (0,85%: 0,85 g de sal para cada 100 ml de água) por motivos financeiros ou água peptonada (necessária preparação ou compra);
· Liquidificador: Realizar a esterilização- limpeza com álcool 70% (coloca-se a pisseta inteira de álcool para bater umas 2 vezes, não pode colocar na autoclave pois tem partes de borracha);
· Bater 225 mL de solução salina esterilizada (preparada no erlenmeyer, não esquecer de fazer a flambagem ao abrir e fechar o erlenmeyer da solução, a menos que for descartar após o processo) + 25g de amostra 1:10 (tem todo um processo para o corte da amostra, porém depende do alimento); 
· Liquefazer a amostra (no laboratório, geralmente temos um stomacher, que já tem um saquinho previamente esterilizado próprio para o equipamento, dependendo da força com que se batem as pás, não pode ser nem um saquinho muito forte,nem muito fraco) a batida da amostra geralmente dura 2 minutos de acordo da legislação. Não colocar a mão dentro do saquinho para não contaminar. O stomacher é melhor! pois consigo trabalhar com amostras maiores e menores, com o liquidificador é mais complicado pois preciso manter contato da hélice com toda minha amostra. Stomacher é bem mais caro.
· Quando bate-se a amostra, o microrganismo sai do alimento e vai pro diluente, por isso não tem problema o chocolate não se ligar com a água (o exemplo que foi utilizado era um bombom de morango com chocolate);
· São feitas 5 diluições (a 10-1 é a que sai do liquidificador/stomacher) para o alimento processado (passou por tratamento térmico, logo possui uma menor quantidade de microrganismos, sendo necessárias menos diluições para análise de UFC-unidades formadoras de colônia).Tubos de ensaio designados e esterilizados com a solução salina;
· NUNCA ESTERILIZAR A AMOSTRA NO BICO DE BUNSEN!
· A partir da amostra homogeneizada do liquidificador (diluição 10-1), retiro com o auxílio de uma pipeta esterilizada 1 ml de amostra para um tubo de ensaio (previamente esterilizado) com 9 ml de solução salina 0,85% (diluição 10-2). Fecha-se o tubo com algodão hidrofóbico e agitamos a solução com o auxílio do Vortex;
· TOMAR A AMOSTRA COM A PIPETA NA VERTICAL E A PONTEIRA NA SUPERFÍCIE PARA REDUZIR A ENTRADA DE AR E O RISCO DE CONTAMINAÇÃO;
· NÃO ESQUECER DE PASSAR NO VORTEX A CADA DILUIÇÃO. Passo no vortex para garantir que em qualquer ponto da amostra tenha a mesma quantidade de microrganismos.
· Em seguida retiramos o algodão momentaneamente, flambamos a boca do tubo de ensaio com o auxílio do bico de bunsen, e com uma nova pipeta tomamos uma alíquota de 1 ml transferindo-a para um novo tubo de solução salina e selamos com algodão (10-3);
· repetimos esse procedimento até a diluição 10-5;
· Flamba-se a boca do tubo e transferimos uma alíquota de 0,1ml (análise em superfície) de cada diluição com auxílio de pipetas esterilizadas para as respectivas placas de petri (as placas de petri já devem estar com o meio solidificado) e espalhamos com a alça de drigalski esterilizada (com álcool 96°), parando de espalhar quando perceber que o meio está incorporando a amostra (fica bem mais difícil de espalhar, um pouco áspero). 
Alça de drigalski
· Observações
· Quanto mais meio eu tiver, melhor vai ser para a incorporação da amostra, pois há mais espaço para o microrganismo.
· Espalhar bem, pois quanto mais seco o meio ficar, menor a chance de contaminação por crescimento de bolor externo (pois os bolores gostam de meios úmidos). 
· Tomar cuidado para a alça não estar muito quente, pois pode matar os microrganismos (colocar a alça no meio primeiro para ver se está quente, se o meio derreter, esperar mais um tempo para usar);
· Esterilizar a alça antes e depois do uso, para não prejudicar o próximo a usar, nem ser prejudicado correndo o risco de usar uma alça contaminada.
· Plaqueia-se a partir da 2° diluição (10-2), pois a primeira teria muitos microrganismos e dificultaria a contagem;
· Estufar a 28°C por 5 dias (temperatura ambiente). Para bolor, não inverter a placa e tomar cuidado para não ter gotículas de água na tampa da placa.
· Contagem: Cada circunferência cotonosa (bolor) ou gelatinosa (levedura) visível é tida como uma unidade formadora de colônia(UFC);
· Nesta placa acima, de um museu de microbiologia em amsterdã existem 41 Unidades Formadoras de Colônia;
· Contagem total: placa 10-2 = 41*100*10 = 41000 UFC/g = 4,1x104 UFC/g;
· Unidades: Amostra sólida em UFC/g e amostra líquida UFC/ml;
· Em análises em superfície sempre multiplicar o UFC vezes a diluição (x10), pois 1 ml da amostra = 1:10 e para a placa pega-se 0,1 mL de um tubo já diluído, por isso multiplica-se por 10!
· Usa-se 0,1 ml em superfície porque 1 ml é muito líquido para incorporar ao meio de cultura. No caso da análise em profundidade dá certo, pois consigo misturar a amostra com o meio ainda líquido;
· Microcultivo (Identificação dos Bolores): Permite identificar a espécie de microrganismo. Existem dois meios de se fazer o microcultivo: um deles é com durex, não é a melhor forma de realizar a análise de um microcultivo: posso gerar bolhas grandes na lâmina, além de romper o corpo de frutificação na hora da extração ficando só com as hifas. Apesar de rápida, não é eficaz! A outra maneira será explicada abaixo.
· Objetivos: Identificar a forma do corpo de frutificação (será analisado em microscópio). O corpo de frutificação do bolor é como se fosse um saquinho, nesse saquinho tenho bolinhas que são os esporos que geram novas hifas, que após se desenvolverem gera novos corpos, repetindo o ciclo. Esse saquinho pode ficar de várias formas, quando o corpo de frutificação abre, libera os esporos que jogam novas hifas.
· Melhor utilizar culturas novas (jovens): Recém colocadas na placa (pois ainda estão crescendo, ficando mais fácil a visualização,mais cheios estão os saquinhos, terei uma lâmina com bastante corpos de frutificação).
· O microcultivo não é uma análiseobrigatória, só realizo quando quero identificar o tipo de microrganismo presente em meu meio de cultura.
 Corpos de frutificação: As bolinhas são os esporos (alguns estão soltos).
· Procedimentos: 
· Primeiramente preciso ter certeza que só há 1 colônia em minha placa (não contaminada visualmente), para isso basta lembrar que uma colônia é formada somente por um tipo de microrganismo;
· Flambar o suporte com álcool 96% (suporte não deixa ficar em contato com a água);
· Colocar o suporte dentro da placa de petri vazia e estéril e flambar a lâmina;
· Colocar um cubo de um centímetro quadrado de PDA (cortado com a alça de inoculação estéril sobre a lâmina), pois este meio intensifica muito a esporulação;
· Inocular uma pequena amostra de colônia retirada da placa com uma alça de inoculação em um dos lados do cubo de ágar (a altura do ágar) e repetir esse procedimento para cada um dos lados;
· Colocar uma lamínula flambada sobre o cubo inoculado de ágar; 
· Colocar algumas gotas de água no fundo da placa debaixo do suporte (para aumentar a umidade);
· Seria melhor usar papel filtro. No caso da placa de vidro, antes de esterilizá-la, coloca-se o pedaço de papel filtro, embrulho a placa em papel craft e esteriliza-se, para que papel seja esterilizado também. Durante a montagem, umedeço o papel filtro para que a água (umidade) fique retida ali e não contamine a análise (é mais seguro).;
· Como a placa de plástico não pode ser esterilizada, pingo a água e uso o suporte. Nesse caso: Monto todo o microcultivo, depois pingo a água na placa embaixo do suporte para não encostar na amostra;
· Em nosso caso, não utilizou-se o papel filtro úmido por baixo por não ser uma placa de vidro, justificando o uso do suporte para não haver contato direto com a água. Se fosse uma placa de vidro, já colocaria a lâmina em cima do papel filtro diretamente, gotejando um pouco de água no mesmo;
Ilustração do procedimento
· Incubar sem inverter a placa por 3 a 5 dias a 28°C, se em 3 dias já houver crescimento, realizar a análise, caso contrários esperar mais um pouco;
· Análise: Não irei analisar o ágar direto no microscópio, pois para visualizar a luz precisa passar através do objeto, como o ágar é muito compacto a luz não passa, pega-se uma lâmina vazia, retirar a lamínula e coloco na lâmina estéril, aí analisa-se no microscópio.
· Como fez-se o microcultivo nas bordas do ágar e minha lamínula é bem maior que o ágar, as hifas que tendem a crescer para cima, porém não tem força de levantar a lamínula, então vão crescer nos arredores (vão penetrar em cima do ágar e embaixo da lamínula). 
· Quando retira-se a lamínula, as hifas grudam nela (ficam retidas) e com a transparência da lamínula pode ser vista no microscópio. É melhor ainda, pois queremos ver o corpo de frutificação isolado (quanto mais isolado, melhor para análise de características). O pedaço de ágar já está abarrotado de bolores, dificultando a visualização, enquanto na lamínula tenho poucas hifas, como está estéril só visualiza-se o que estiver nela;
· Para visualizar no microscópio: retirar a lamínula. Utiliza-se corante azul, só pra facilitar a visualização, e faz-se uso da lente de imersão (1000x de aumento);
· Para saber qual microrganismo, pesquisar em um atlas de micologia (voltado para bolores) e analisar com a placa inicial. Através dela identifica-se o corpo de frutificação, consegue mostrar a espécie que estamos trabalhando pelo corpo de frutificação: Junto a cor (que cresce na placa, pois todos ficam azulados devido ao corante usado), o modo de crescimento que tenho na minha colônia e o corpo de frutificação. Ás vezes as colônias parecem iguais , porém mudam conforme o estágio de crescimento, por isso preciso da placa e do corpo de frutificação.
· 28/08/2020 - Atividade N1:
· Parâmetros da RDC 12/2001:
· Descreva: 
1. Como deve ser coletada a amostra do alimento. 
A amostra deve ser coletada em sua embalagem original, no caso do suco pasteurizado na caixinha ou garrafa fechada.
De acordo com a RESOLUÇÃO-RDC Nº 12, DE 02 DE JANEIRO DE 2001, devem ser coletadas 5 amostras do lote e enviadas para análise em laboratório. Porém, dependendo do tamanho do lote a ser analisado a Norma ABNT NBR 5426/1985 especifica o número de amostras que devem ser coletada para serem analisadas, bastando ajustá-las a proporção estabelecida pelos critérios microbiológicos.
2. Como deve chegar esta amostra no laboratório, para que o mesmo seja analisado. 
Considerando que o suco é pasteurizado, deve chegar em sua embalagem original, este deve ser mantido em refrigeração após a chegada no laboratório, e após a saída da refrigeração este deve seguir imediatamente para análise após a higienização da embalagem com álcool 70%.
Deve ser enviada ao laboratório devidamente identificada e em condições para análise, especificando as seguintes informações: a data, hora da colheita, a temperatura quando pertinente, o motivo, além de outros dados que forem necessários para auxiliar o processo.
3. Como devo proceder a análise (escrever todos os detalhes) Notas: Não é permitido desenho, porém a análise pode ser descrita em tópicos. Partir do princípio que você realizará TUDO da análise, desde o preparo do meio. Não esquecer de escrever o nome dos reagentes utilizados. 
Procedimentos para análise de bactérias mesófilas em sucos de caju pasteurizado (UFC/mL):
· Realizar a preparação do meio de cultura PCA – Padrão de contagem em placa conforme o fabricante, transferir para um erlenmeyer, fechar com o algodão hidrofóbico, selar com papel craft e autoclavar em autoclave a 121 °C por 15 minutos. 
· A análise deve ser feita em fluxo laminar ou próxima do bico de bunsen.
· Limpar a embalagem com algodão embebido em álcool 70%; Passar na embalagem inteira para manter apenas a contaminação do suco. 
· O suco deverá ser homogeneizado (25 agitações);
· Utilizar solução salina (0,85%: 0,85 g de sal para cada 100 ml de água) por motivos financeiros ou água peptonada (necessária preparação ou compra);
· Serão feitas 5 diluições, pois o alimento foi processado (passou por tratamento térmico, logo possui uma menor quantidade de microrganismos, sendo necessárias menos diluições para análise de UFC (unidade formadora de colônia);
· Para a preparação dos tubos de ensaio, colocar a solução salina, tapar com um algodão hidrofóbico (bloqueia completamente a entrada de água) e em seguida com a respectiva tampa e será esterilizada na autoclave junto com o meio de cultura; 
· Deve-se limpar com álcool 70° todo o ambiente onde será realizada a análise;
· A partir do suco pasteurizado (diluição 100), retirar com o auxílio de uma pipeta esterilizada 1 ml de amostra da parte superior da embalagem, para um tubo de ensaio (previamente esterilizado) com 9 ml de solução salina 0,85% (diluição 10-1). Fecha-se o tubo com algodão hidrofóbico e agita-se a solução com o auxílio do Vortex;
· Em seguida retira-se o algodão momentaneamente, flamba-se a boca do tubo de ensaio com o auxílio do bico de bunsen, e com uma nova pipeta toma-se uma alíquota de 1 ml transferindo-a para um novo tubo de solução salina selando-a com algodão (10-2);
· repete-se esse procedimento até a diluição 10-5;
· transfere-se uma alíquota de 1 ml de cada diluição com auxílio de pipetas esterilizadas (se for de vidro, devem ser esterilizadas, se for de plástico, podem ser utilizadas diretamente) para as respectivas placas de petri, submergindo-as com meio de cultura morno previamente preparado (análise de profundidade), realizando movimentos em formato de 8 para homogeneização;
· Incubar em estufa a 32°C de 24-48h.
4. Como fará a contagem das placas. Dê um exemplo.
Contagem das colônias: A contagem de placas é feita para saber quantas colônias existem em cada placa, considera-se como colônia cada pontinho, desde os grandes aos pequenos. A contagem deve ser feita nas placas que apresentam 25 a 250 colônias de bactérias. Considerando que foram feitas 5 diluições, deve-se fazer a contagem da placa que apresentar contagem próxima a 250colônias. Para que o resultado seja colocado no laudo deve-se multiplicar o número de colônias pelo inverso da diluição, exemplo, foram contadas 52 colônias na diluição 10-2 (considerando que o método de emplacamento utilizado foi profundidade), multiplicar 52x10²; resultando em 5,2x103 ufc/ml.
5. Utilize os valores abaixo, da contagem das placas e escreva qual seria a conclusão do seu laudo. Nota: Não esqueça de fornecer informações importantes, discutidas em aula, sobre o laudo microbiológico, para que quem esteja lendo saiba interpretar o resultado. 
Tratando-se de bactérias mesófilas, a legislação brasileira (neste caso, nos baseamos na BRASIL, RDC nº 12, de 02/01/2001. não possui parâmetros para contagem desse tipo de bactérias para suco de frutas. Porém, como esses microrganismos são, em sua maioria, patogênicos e sua presença indica baixos padrões de higiene, uma alta contagem dos mesmos em alimentos representa um perigo a saúde do consumidor. Portanto, o lote deverá ser rejeitado. Os resultados podem ser provenientes de falta de boas práticas de fabricação durante o processamento do suco de caju, (como por exemplo um funcionário que foi para a linha de produção sem lavar as mãos após utilizar o banheiro) estes resultados podem ter sido agravados devido ao mau armazenamento do produto no laboratório, ou seja fora da geladeira enquanto este esperava para ser analisado.
Resultados do laudo: Não há conclusão.
6. Indique de onde estaria vindo a contaminação das bactérias mesófilas no produto. 
Considerando que a maioria das bactérias mesófilas são provenientes de condições precárias de higiene, a contaminação pode estar vindo em detrimento de problemas relacionados a higiene durante os processos e dos colaboradores, falhas na limpeza e desinfecção, e sua proliferação é advinda de problemas com o controle de temperatura durante os processos de tratamento, transporte e armazenamento realizados de forma inadequada e principalmente falta de controle na temperatura de refrigeração do produto.
7. Indique uma forma de controlar esta contaminação, caso queira vender o produto em um mercado local.
Uma forma de controlar essa contaminação é tomando medidas que evitam a multiplicação desse tipo de microrganismo. É necessário monitorar e corrigir falhas nos processos de produção para evitar a contaminação do produto antes que chegue às gôndolas do mercado. É possível instruir os colaboradores sobre a maneira correta de armazenamento, transporte do produto e temperatura correta de refrigeração, além de práticas de higiene necessárias na área de alimentos. 
· 02/09/2020 - Aula Prática 3: Análise de bactérias láticas
Traz a análise de bactérias mesófilas para a análise de bactérias láticas. Bactérias mesófilas são um grupo de microrganismos, enquanto que as bactérias láticas são um subgrupo de bactérias mesófilas. Logo, tenho três subdivisões.
Esta análise leva muito em conta a disponibilidade de oxigênio no meio para seleção do crescimento de microrganismos. Como trata-se de um grupo muito grande de microrganismos, mesmo selecionando pelo oxigênio, é necessário realizar outra seleção no meio de cultura por meio de sais biliares de acordo com o gênero e espécie que desejo.
· Incubação: 37°c por 72h.
· Meios de Cultura: Para esta análise utilizam-se 3 meios de cultura genéricos, onde há crescimento de mais de um gênero de microrganismos;
· Ágar Soro de Laranja (ASL) = microrganismos ácido tolerantes em sucos de frutas e frutas cítricas. Obs: Soro de laranja = suco de laranja concentrado.
· É um meio muito rico, pois essas bactérias são muito exigentes nutricionalmente. propiciando o crescimento de outros microrganismos como: fungos filamentosos e leveduras que estragariam minha análise, B. Cereus, Lactobacillus e leuconostoc;
· Serve para controle de qualidade de sucos de frutas e refrigerantes (em análise de refrigerantes, deve-se mexer o refri para retirar o gás carbônico);
· Foi o primeiro meio voltado para a análise de bolor e levedura, era voltado para a análise de suco de laranja, pois é propício a crescimento desses MO. 
· Não podemos congelar suco de laranja para análise microbiológica, pois tem temperatura de crescimento de 5-50°C , acaba saindo muito dessa zona, causando a morte dela.
PARA ANÁLISE DE BACTÉRIAS LÁTICAS NÃO SE PODE CONGELAR OS ALIMENTOS.
· Composição:
Composição do meio Ágar soro de laranja. ILANA 2020.
· CISTEÍNA: PROTEÍNA
· HIDROGENOFOSFATO: SAIS - não víamos isso em meios de cultura, ressaltando o fato de serem exigentes nutricionalmente.
· Ágar para Lactobacillus (MAN ROGOSA E SHAPE- MRS): Serve para contagem de lactobacillus em todos os alimentos.
· É um meio muito genérico, preciso de alguns agregados nele para o crescimento das bactérias láticas;
· Não é muito seletivo, por isso pode ocorrer o crescimento de Pediococcus e Leuconostoc (ter crescimento de outras bactérias);
· A seletividade acontece na presença no meio, de polisorbato, acetato e magnésio- fatores estimulantes para crescimento de Lactobacillus;
· a 45°C tem o crescimento de BB12 - bifidum bacterium animales (Microrganismos probióticos).
· Composição:
Composição do meio MRS. (ILANA, 2020)
· Tween 80= emulsificante (liga todo o meio, a parte polar e apolar conseguindo manter tudo na solução, para que não precipite o meio).
· Agregamos Bastante sais e aminoácidos. 
· Ágar APT: utilizado para cultivo e enumeração de Pediococcus e bactérias láticas heterofermentativas associadas à deterioração de produtos curados (Leuconostoc);
· APT próprio para produtos curados;
· Leuconostoc = microrganismo que cresce em sal com menor disponibilidade de água.
· Período de incubação: Análise em 37°C por 72h.
· Linguiça curada: produto cozido com aroma e sabor maior, menor atividade de água para desenvolvimento dos m.o. menor deterioração em relação a linguiça fresca;
· Composição:
· Reação de escurecimento (reação de maillard): preciso de açúcar redutor para a ocorrência dessa reação.
· Preciso de: aminoácidos, açúcar redutor e aquecimento (AAA).
· Microrganismo não enxerga o açúcar caramelizado como nutriente, mas como algo que inibe seu crescimento. Logo preciso fazer com que esse açúcar não caramelize para que possa utilizar ele em meu meio ,adicione o açúcar depois da esterilização (esterilização separado) para que não caramelize, um erlenmeyer com açúcar e outro com pó de meio sem açúcar, junta-se eles para ter o meio pronto.
· EXPLICAÇÃO DE AÇÚCAR REDUTOR:
· 04/09/2020 - Aula Prática 3: Análise de Bactérias Láticas
· Meio de cultura MRS: Aminoácido (aa) + açúcar (carboidrato, neste caso a maltose- dissacarídeo) e esterilização (calor) chama para caramelização -----> microrganismos não utilizam o carboidrato caramelizado como nutriente;
· Análise de probióticos em MRS- acrescenta-se 3% de maltose (do total de meio), pois as bactérias crescem bem em meio a maltose, serve para selecionar um microrganismo em específico.
· Por exemplo - Probióticos em MRS:
40g de meio para 1000ml -------> 40------1000
Quero Xg para 300 ml ------------> X--------300	X= 12g
Observação: Solução stock (estoque) é a solução disponível no meu laboratório (de maltose em %), a partir dela realizar as conta para a diluição para adaptar a concentração de 3% em 300 ml. stock---------> 10% de maltose (por ex) 
C1.V1 = C2.V2--------> Diluição
0,1.V = 0,03X0,3-----> V = 0,09L→90mL
VAMOS DISSOLVER OS 12G DE PÓ EM 300-90 = 210ML DE ÁGUA
TEMOS 100 ML MALTOSE 3%,ADICIONA-SE 90 mL NO MEIO (é bom ter uma sobra).
· Modo de preparo:
· ESTERILIZAR 2 ERLENMEYERS SEPARADOS, POIS SE ESTERILIZAR OS DOIS JUNTOS, O MEIO VAI CARAMELIZAR.
UM COM 12G + 210 ML. DE MEIO 	 OUTRO COM 100mL DE MALTOSE 3%
SEM AMINOÁCIDO A MALTOSE NÃO CARAMELIZA 
· Microrganismos Probióticos
· 4 formas de mexer com o MRS-meio base, adaptado de acordo com minhas necessidades:
-Maltose (lactobacillus);
-A.B e C (Bifidum bacterium);
-Incubar a 45° C a 3 dias (bactérias láticas e bifidum);
-Sais biliares (lactobacillus);
· Lactobacillus acidophilus
·Meio- MRS-IM agar com maltose;
· Técnica- Pour plate 37° C\3 dias;
· Bifidobacterium= não cresce;
· Streptococcus thermophilus= não cresce;
· Lactobacillus acidophilus= cresce no meio por conta da maltose.
· Bifidobactéria com bactérias ácido láticas termófilas
· Meio: MRS-IM - Ágar com glicose e solução A, B e C (as 3 estão juntas);
· Técnica: Pour plate incubada a 37° C por 3 dias;
· As soluções A, B e C inibem o crescimento dos outros microrganismos;
· Adiciona-se sais para ajudar a selecionar o MRS para Bifidobacterium.
· Incubar sem adicionar nada para crescer Bifidobacteria a 45°C, 3 dias
Lactobacillus acidophilus & Casei shirota
· 09/09/2020 - Aula Prática 3: Análise de Bactérias Lácticas
· Microaerofilia: Consiste em fornecer menos oxigênio ao microrganismo do que o presente em uma estufa, por exemplo. Bactérias láticas obrigatoriamente crescem nessa condição, que é conseguida através da Jarra de anaerobiose: um gerador de atmosfera com teor reduzido de oxigênio e elevado de gás carbônico, para jarras de 2,5 litros. Esta atmosfera, obtida através de reação óxido-redução, permite o crescimento de microrganismos anaeróbios. Serve para fornecer aos microrganismos microaerófilos condições ótimas de crescimento. É uma forma de seleção para bactérias láticas.
Neste caso, não conseguimos retirar totalmente o O2
Observação: Esta é uma análise de profundidade → O método de preparação da amostra e do meio de cultura estão descritos na Aula Prática 2, a diferença está no procedimento depois do plaqueamento.
Observação 2: Esterilizando o Liquidificador → limpeza com álcool 70% (coloca-se a pisseta inteira de álcool para bater umas 2 vezes, não pode colocar na autoclave pois tem partes de borracha). Para liquefazer a amostra no laboratório, geralmente temos um stomacher, que já tem um saquinho previamente esterilizado, próprio para o equipamento (pois depende da força com que se batem as pás, não pode ser nem um saquinho muito forte,nem muito fraco) a batida da amostra geralmente dura 2 minutos de acordo da legislação. Não colocar a mão dentro do saquinho para não contaminar. O stomacher é melhor! pois consigo trabalhar com amostras maiores e menores, com o liquidificador é mais complicado pois preciso manter contato da hélice com toda minha amostra. porém stomacher é bem mais caro.
Ex: Queijo minas qualquer = Análise (25g para a diluição 1:10 → realizar a diluição em 4 ou 5 tubos de solução salina 9 ml + 1ml para a placa). Movimento em formato de 8 para homogeneizar o meio com a solução.
→ no caso de queijo, fazer no máximo 6 diluições.
· Para alimento probiótico: Sabe-se a concentração inicial (Exemplo: 108-109 de MO) pelo menos 6 diluições para conseguir chegar em uma placa com contagem de 25-250.
· Depois da solidificação das placas: Antes de incubar, coloca-se nas jarras de anaerobiose e fechar (deixar fechado por 72h sem abrir, desta forma disponibiliza-se menos O2 para o MO) assim ela pode crescer; 
· Incubação: 37°C (uma média, a maioria das bactérias lácticas crescem. Apesar de existirem bactérias com temperatura ótima de 43° C, todas conseguem crescer na temperatura de 37°C. Em contrapartida, caso deixe a 43°C estará em uma temperatura próxima das bactérias termófilas, coisa que nem todas as bactérias láticas são) por 72h.
· não deixar a 43°C, pois é a temperatura ótima das bactérias termófilas.
· Não se pode abrir a jarra antes do tempo, caso contrário perde-se a análise que estava estudando (deixar fechado durante todo o tempo da análise).
· Meios de cultura utilizados para esta análise: MRS, MRS com maltose, MRS com solução ABC. Independente do meio, a análise será feita da mesma maneira. 
· MRS à temperatura de 45°C → Para crescimento de BB12 (Bifidobacterium → Activia): Não precisa do uso da jarra de anaerobiose (alguns optam por essa análise devido à jarra ser um pouco cara). 
· É uma análise mais perigosa, pelo fato da temperatura muito alta e próxima de termófilos, as bactérias láticas não crescem muito bem. Além disso a estufa nunca estará exatamente a 45°C sempre apresentando desvios.
· Passar silicone na jarra antes da inserção das placas para que haja uma boa vedação. Algumas Jarras possuem medidor de pressão interna, mas se o sistema funciona, não é necessário realizar tal medição. 
· Na jarra, as placas ficam ao contrário (As placas são colocadas invertidas na jarra, para que as gotículas não caiam e aumentem a umidade do meio, dando chance para bolor e levedura crescer), ficam encostadas na parede para dar espaço para colocar um sistema indicador (tem uma cor inicial e quando o sistema entra em anaerobiose ele muda de cor) o sistema coleta o O2 e transforma em um óxido. Após isso, a jarra vai para a estufa. Não chega até uma anaerobiose total.
· Precisa ter prática para identificar o MO direto na placa. Podemos confundir as colônias de Bifidum com S. thermophilus.
· Para identificar o MO, basta ver o formato no microscópio, não necessitando de provas bioquímicas.
· 11/09/2020 - Aula Prática 4: Análise de Salmonella
1. Nesta análise ocorre um pré- enriquecimento;
2. Enriquecimento;
3. Plaqueamento (Vai falar depois);
4. Provas Bioquímicas de Identificação.
Em nenhuma prática anterior houve necessidade dessas quatro fases, porém no caso da salmonella vão ajudar a identificar MO.
1. Pré-enriquecimento: Serve para desestressar o microrganismo, dando tudo aquilo que precisa para crescer. Ajuda a diminuir o estresse e aumentar o número de salmonelas.
Como: Colocando a amostra em um caldo lactosado (meio de enriquecimento) → Problema: Não fermenta lactose, porém cresce na presença de lactose! Meu objetivo não é que o MO fermente, mas sim que consuma os nutrientes e se desenvolva (cresça), que são duas coisas completamente diferentes.
Exemplo para análise: Coxa de frango
→Esterilizar o caldo lactosado dentro do erlenmeyer selado com algodão hidrofóbico em papel craft, na autoclave → aguardar o resfriamento para utilização.
→25g da carne (RDC 12, 331/2019 = ausência em 25g). Se for ovo: 12,5 g clara e 12,5g gema.
→Colocar em um erlenmeyer 225g de caldo lactosado e acrescentar 25 g de amostra. 
Nota: É preferível trabalhar-se com amostras maiores e múltiplas de 25 g para aumentar as chances de detecção.
Diferença: Não necessita bater no liquidificador, pois o MO está estressado; Incubar a 37 °C por 18h (o meio com o caldo fica esse tempo, pois o MO vai procurar um ambiente diferente e migrar espontaneamente para o caldo); 
Observação: Ao colocar a amostra no caldo não estou diluindo nada, apenas desestressando o microrganismo, que não significa que terei sucesso nesse caminho de análise.
2. Enriquecimento-Acontece em dois caldos:
a. Tetrationato de sódio → 10 mL coloca uma alçada do mo com o caldo.
b. Selenito cistina → 10 ml coloca uma alçada do mo com o caldo.
ATENÇÃO: utilizamos os dois caldos para adaptar-se aos vários tipos de salmonella, cada espécie possui uma preferência.
· incubação após a alçada à 37° C por 18h. 
· Os tubos de ensaio são colocados na estufa dentro de um béquer com água a fim de simular um banho maria. Caso tenha o equipamento de banho maria, posso utilizá-lo sem problemas (assumindo as consequências de deixá-lo ligado por 18 horas seguidas).
Motivo: Apesar de haver desestressando a salmonella, também houve um desestresse de todas as bactérias presentes no trato intestinal, teve uma multiplicação muito grande de salmonella caso estiver presente. Neste momento, o enriquecimento teria um papel de meio seletivo, matando os demais microrganismos e propiciando apenas o crescimento de salmonella.
Observação: Não importa a quantidade de amostra de caldo lactosado que pegue, como a salmonella se multiplicou bastante no pré enriquecimento, se ela estiver presente, uma alçada basta para que cresça, e, de acordo com a legislação deve-se ter ausência, então não necessito realizar a contagem real de colônias, se tiver apenas uma mínima colônia, já condeno todo meu lote.
→Quanto mais heterogêneo for meu produto maior deve ser o controle;
Complemento-CritérioMicrobiológico e Legislação: Nem sempre o produto vai usar a amostra representativa. Precisamos nos atentar também a amostra indicativa. Pois, se tenho um controle do meu produto, não necessita de sempre realizar o critério microbiológico, pois sai mais caro.
→Quase tudo utiliza a amostra indicativa, sendo a amostra representativa para critérios especiais, porque existem parcerias de empresas com laboratórios para análises periódicas de amostras indicativas, sendo necessário pagar pela análise de critério microbiológico.
→A amostra indicativa é apenas um controle, depende de empresa para empresa, o tipo de produto, o contexto inserido de comercialização, entre outros fatores. 
→Como a empresa trabalha com produto padronizado, ou seja, todas as amostras apresentarão mesmo resultado pois são iguais, indifere a amostra representativa. A contraprova também será única.
→Tudo isso está ligado ao conceito de alimento seguro e segurança alimentar. Se a empresa se dedica a manutenção de um alimento seguro, consequentemente a padronização da produção se dá um produto de qualidade, a empresa terá a certeza de que tem o total controle e ciência de sua produção, e que a análise de apenas uma amostra representativa não colocará em risco o fornecimento de um produto seguro ao consumidor. Ao descartar esses principio e perder o controle da padronização, a empresa necessita recorrer do uso constante de amostras representativas que geram custos excedentes a minha indústria. Resumindo: O barato sai caro.
Observação: Produtos padronizados são aqueles que recebem um controle de qualidade em todo o processo (ISO 9001), sem essa padronização ocorrem erros posteriores e caros.
3. Plaqueamento: Deve-se fazer isolamento na placa.
· Tipo de Análise: ESGOTAMENTO (Não é em superfície nem profundidade): quando trato de esgotamento a contagem não importa, me importa a presença de microrganismos ou não, para consequente aceitação ou não do meu lote.
→Procedimento de esgotamento: com a alça de inoculação faço as várias estrias na placa para isolar as colônias.
Dentro do trato de intestinal possuimos varios tipos de bactéria que consomem o mesmo alimento para sobreviverem no mesmo ambiente, então um único meio de cultura não vai conseguir selecionar o MO, pois possuem necessidades muito próximas. Até aqui a seleção não resolveu, ao fazer o esgotamento não existirá apenas a salmonella.
· Meios de cultura: 
	→Meios muito caros, variam de R$800 a R$1500.
→Utiliza-se mais de um meio de cultura (+ de 8 meios de cultura possíveis, não necessariamente vou usar todos, o tipo e quantidade, varia de acordo com as condições e preferências do laboratório).
→Totalmente seletivos e diferenciais: seletivos e diferenciais para enterobactéria. Por mais que não tenha conseguido isolar depois de todo esse processo, a diferenciação de coloração pela formação de metabólitos me ajudarão a identificar o MO.
4. Provas Bioquímicas: Serão feitas junto com todas as análises da família enterobacteriaceae
· 14/09/2020 - Aula Prática 5: Análise de Coliformes
NMP-Análise de número mais provável: Reconhecida pela legislação, serve para quantificar o grupo coliformes, verifica a quantidade de microrganismos no grupo em geral (não separando-os por grupos).
→ Por que número mais provável? Trabalhamos com tubos de ensaio, a fim de definir o número mais PROVÁVEL de microrganismos. Não temos quantidades iguais em cada tubo, etc, não é muito padronizada, então supomos o número.
→ Como? leva em conta a fermentação dos coliformes, e sua produção de gás pela captação de açúcar.
Procedimento de análise - Análise de número mais provável
→ Alimento Líquido: 3 Tubos de ensaio de 3 diluições diferentes - Ex: Leite, (leite diluído a probabilidade de achar coliformes é menor do que se tivesse o leite sem ser diluído, pois haveria mais microrganismos), a primeira diluição será 100 (amostra pura, faz direto da caixinha) , 101 e 102. Como : 1 ml de amostra + 9 ml solução salina (0,85%). Fora o original faço mais 3 diluições. Quando se olha o leite, não sabemos a contaminação dele, se você começa a diluir muito, não vai conseguir verificar resposta do teste, quanto mais perto do original melhor.
→ Quanto mais MO tiver no tubo de ensaio, melhor (trabalhar com as menores diluições, por não saber quanto exatamente de microrganismos, eu escolho não fazer muitas diluições).
100: Amostra Pura	101: Primeira diluição	102: Segunda diluição 
→ Todos os tubos de ensaio devem ser identificados!
→ Alimento Sólido: não tem 100, pois não tem como ter a amostra pura. Seria 25g para 225ml 101 (primeira diluição no liquidificador) , 102(tubo de ensaio) e 103(tubo de ensaio).
Observação: Primeira diluição maior (pois não é o alimento puro). Pode-se trabalhar com a amostra a partir do 102 se quiser. Quanto menor a diluição maior a chance de detectar o microrganismo, pois está mais próximo do alimento original → quanto mais próximo do alimento original, melhor para a análise.
· Teste Presuntivo Presença ou ausência de coliformes. Nesse teste não há possibilidade de realizar diferenciação entre coliformes totais ou fecais, somente se existem coliformes ou não.
→ Procedimento= 9 tubos de ensaio (cada um com um tubo de Duran- identifica formação de gás), cada tubo terá um caldo específico chamado L.S.T (Laurel sulfato) com 1 mL do MO (ou uma alçada) e 9 ml do caldo.
Quando for passar pelo vortex, tomar cuidado, pois o vidro do tubo de ensaio é mais fino.
Dependendo do alimento, para identificar as diluições só ver pela cor, ou seja vai ficando mais claro.
Os tubos de ensaio não necessariamente precisa ser de tampa de rosca, pode ser fechado com um algodão e uma tampa.
Sempre que for trabalhar com tubo de duran, é essencial autoclavar, por ser a vácuo, retira as bolhas de ar! (ETAPA MUITO IMPORTANTE)
*Lembrete: CALDO NÃO TEM ÁGAR
Caldo L.S.T (Lauril Sulfato de Sódio)
1° tubo: acabou de sair da autoclave.
No 2°, 3° e 4° têm formação de gás.
→ Incubação: 35°C por 24-48h. 
→ Inoculação: Da primeira diluição pegamos a pipeta volumétrica e colocamos 1 ml no tubo, ainda da primeira diluição colocamos 1 ml no 2 tubo, ainda da primeira diluição colocamos 1 ml no terceiro tubo. Amostras em triplicata. Cada 1ml irá para 3 tubos diferentes, e para a última diluição fazer a mesma coisa.
Esquema das amostras em triplicata (três tubos para cada diluição):
· Da primeira diluição, coloca-se nos tubos 1,2 e 3; 
· Da segunda diluição, coloca-se nos tubos 4, 5 e 6;
· Da terceira diluição, coloca-se nos tubos 7, 8 e 9.
→ Função do tubo de durhan: Verificar a formação de gás do coliforme, aprisionando o gás que o coliforme forma na hora do consumo da lactose (aprisiona o gás e fica uma bolha na bundinha do tubo);
→ Não temos como medir a quantidade de gás, pois são tubos diferentes, APENAS ANALISAMOS SE TEM PRESENÇA DE GÁS OU NÃO.
MO fica dentro do tubo também, então os que ficam dentro formam gás e expulsam o líquido, pode ter gás do lado de fora.
→Função do Caldo: verifica a degradação da lactose → crescimento do microrganismo, pois a presença de microrganismo torna o caldo opaco, e se existe coliformes, além de opaco possui a formação de gás.
→ Por que esse período de incubação? se tiver uma grande quantidade de microrganismo, em 24-48h já preencheram todos os tubos com gás, se não tiver, espero 48h. Não significa que precisa formar gás em todos os tubos, pois é dependente da concentração dos microrganismos → Se a amostra está contaminada ou não.
→ Resumindo:
→ Presença de microrganismo: solução opaca → Caldo
→ Presença de coliformes: Formação de gás → Tubo de Durhan
→ Após a incubação: analisar os tubos que teve formação de gás. 
ex: Os da primeira diluição formaram gás, da segunda diluição só dois formaram gás, e da última só um formou gás. Significa que por mais que você tenha coliformes na amostra, você também está diminuindo eles quando está diluindo.
	Para identificar se há a presença de gás, pode-se mexer o tubo (virar de ponta cabeça) e dar umas batidas, pois se houver gás, ele vaisubir e vai ficar visível perto da superfície do meio.
Resumo do Procedimento:
· Fazer a análise no fluxo laminar ou na bancada perto do bico de bunsen.
· Separar noves tubos de ensaio e 9 tubos de durhan. O Tubo de Durhan não é padronizado, esse é o problema para identificar qual teve maior formação de gás, mas podemos escolher aquele que achamos ter maior formação de gás. Presença ou ausência.
· Dissolver o caldo em água fria (não tem ágar), logo após esterilização (a esterilização é a parte mais importante da análise, a autoclave forma vácuo, tirando todo o ar do tubo de durhan).
· Preparar o caldo na bancada 9 ml de caldo e acrescentar o tubo de duran.
· Ao colocar primeiro o líquido e depois o tubo ou tubo e depois o líquido formará uma bolha de gás. Para chegar num sistema para ponto inicial de análise, ou seja sem bolha de gás e tomado pelo líquido (o microrganismo entra no tubo tbm, fermentando o líquido produzindo gás e expulsa líquido para fora, formando bolha de gás) o ideal é começar a análise com o tubo sem bolha de ar para ver se há formação de gás (autoclavar o tubo montado para que isso aconteça).
· Selar com algodão hidrofóbico e papel craft e colocar na autoclave para a esterilização. 
AUTOCLAVAÇÃO É MUITO IMPORTANTE!!
· Antes disso não posso começar a análise, esterilização é a parte mais importante (autoclave trabalha a vácuo, removendo todo o gás do tubo de durhan, a bolha sai enquanto está sendo autoclavado, deve-se retirar da autoclave e o tubo estar sem bolha de gás).
· Nomear três tubos como 10-1, três em 10-2, três em 10-3.
· Homogeneizar a amostra no stomacher.
· transferir para os tubos, passando no vortex mesmo com a presença do tubo de durhan. Flambar a boca do tubo antes de fechar.
· Não precisa trocar a ponteira se não quiser.
· estufa (35 + ou - 2- temperatura de tolerância) por 48hrs.
· Teste Confirmativo: Se tem coliformes totais ou fecais, consegue diferenciar (total 18 tubos para a análise).
-Fazemos este teste a partir dos resultados do teste presuntivo (ou seja, os que tiveram formação de gás).
→ Por que fazer o teste presuntivo então: pois torna o procedimento mais fácil. Aumenta a quantidade de microrganismos pois tem todos os tipos de microrganismos juntos no tubo de ensaio é melhor do que tentar separar eles de vez.
→ Procedimento: só usa um tubo de ensaio para cada diluição, o que tiver maior formação de gás, pois é o que tem maior contaminação. 
Terá 3 tubos, se em todas as diluições pelo menos um um tubo de ensaio conter gás, se não tiver formação de gás aí não usa os tubos da tal diluição.
· COLIFORMES FECAIS: 9 tubos com caldo E.C (escherichia coli) (Coliformes Fecais) com 10mL , Pega os 3 tubos escolhidos que tinham presença de gás (os que tiveram maior formação de gás entre os 3 da sua diluição), e passa do primeiro tubo para 3 novos tubos, do segundo tubo para 3 novos tudos e do terceiro tubo para 3 novos tubos. Para esta passagem, pega com a alça de inoculação e passa para um tubo, e faz assim em todos os tubos! 
	Caldo E.C.- no 2° e 3° tubo há crescimento de MO e formação de gás.
→ alças diferentes para cada tubo SEMPRE!!!
Observação: Se apenas em duas diluições tivessem formação de gás utilizaria apenas 6 tubos, descartando a diluição que não apresentou formação de gás:
→ Incubação: 44,5°- 45,5°C de 24-48h
Se tiver coliformes fecais, significa que a situação está bem ruim!
· COLIFORMES TOTAIS = Pega os 3 tubos que tiveram maior formação de gás 9 tubos de ensaio com Caldo V.B(verde Brilhante) 10 ml , passa uma alçada do primeiro tubo para novos 3 tubos,uma alçada do segundo tubo para 3 novos tubos e uma alçada do terceiro tubo para 3 novos tubos (nessa alçada utiliza-se a alça de inoculação, uma para cada tubo). Dependendo da pessoa, pode-se passar 1 mL ao invés da alçada.
· VB = Caldo mais escuro, é necessário verificar na luz, quando tem crescimento fica mais opaco, e mostra a formação de gás. EC= o caldo parece igual ao caldo presuntivo, não é difícil de visualizar.
→ Incubação: 35°C por 24-48h.
Caldo V.B. no 2° e 3° tubo há crescimento de MO e formação de gás.
→ Resultados: Vamos analisar a formação de gás nos tubos. Nos resultados a gente analisa quais tubos que formou gás, e anotar quantos tubos de cada diluição formou gás,e separar em E.C e V.B.
· Tabela de número mais provável: Posso fazer a análise com 3 tubos ou 10 tubos → porém dá mais trabalhos e já aceito na legislação realizar amostra com 3 tubos.
→ Exemplo do Print: procurar na tabela com a quantidade de diluições feitas e analisar o número de tubos com formação de gás.
→ E.C - 2,1,0: 15 NMP/mL
→ V.B- 3,3,2: 1100 NMP/mL 
Observação: A legislação não relaciona o NMP com UFC/ ml (torna-se apenas qualitativo e não quantitativo) um dos motivos para a mudança de legislação pois agora analiso só a E. coli, utilizando outro procedimento que me gera o resultado em UFC/ml (Quantitativo). Porém podemos comparar a legislação pois foram diversos testes que eles fizeram pra montar a tabela, Ex: Coliformes até 1000 (na legislação) se deu >1100 NMP/mL na tabela, estaria contaminado. 
Observação: as duas unidades ainda que diferentes, tem o mesmo princípio então na legislação acabo comparando o NMP/ml ou g com UFC/ml ou g (a diferença é que o NMP é contado em tubo, diferente de UFC, que contou as colônias na placa, além do mais, o NMP tem um nível de confiança de 95%).
· Análise de água: Em análise de água não temos como diluir!
→ 3 tubos 10 ml de água em cada tubo + 10 ml de caldo L.S.T (lactosado);
→ Para gelo: esperar derreter e fazer o mesmo procedimento.
→ A água não deve ter coliformes!
→ probabilidade de achar algo é menor, por isso pega-se mais amostra (no caso 10 mL).
→ Incubação: 35°C por 24-48h
→ Logo após a incubação, pega o tubo que tiver maior formação de gás, passa uma alçada para novos 3 tubos de E.C 9 ml (incubação= 44,5°-45,5°C por 24-48h), e passa uma alçada do que tiver maior formação de gás para novos 3 tubos de V.B 9 ml ( incubação = 35°C por 24- 48h).
→ Resultados na tabela: Procurar água pura na tabela, se cresceu gás em 1 dos 3 tubos de E.C e V.B , você procura 1,0, 0,1, ou 0,01 dependendo dos resultados, aí você olha na tabela. 
Resumo dos procedimento:
· Após as 48 hrs verificar quais tubos tiveram formação de gás e escolher uma para cada diluição (se não houver formação, não preciso prosseguir a análise para aquela diluição).
· E.C. pode ser de transparente a amarelo
· pode ser uma alçada ou 1ml de amostra!
· incubar: VERDE a 35°C, AMARELO a 45°C-Banho maria por 24 a 48 horas.
· 18/09/2020 - Aulas Práticas 4 e 5: Análise de Salmonella & Coliformes
→ Exemplo do vídeo: análise de Salmonella em carne de espeto: é importante fazer dois caldos pois não se conhece a preferência do microrganismo.
· Caldo lactosado: Pré-enriquecimento (o pré-enriquecimento deve ir em banho maria geralmente, porém dependendo do meio que se utiliza, precisa de uma temperatura mais alta, então pode ir na estufa). Colocar a amostra em pedaços no caldo lactosado e incubar→ Utiliza o vidro shot, tampa de rosca bem alta para incorporar a amostra no caldo lactosado.
· Selenito cistina e tetrationato (em tubos diferentes mas mesma placa) ou rapaport e tetrationato (em tubos diferentes mas mesma placa): Enriquecimento. Apesar do protocolo ser uma alçada, como é só pra verificar presença, ausência posso colocar só 1ml.
CALDOS NÃO SÃO AUTOCLAVADOS, MAS FEITOS NA HORA
· Plaqueamento: XLD, Bismuto Sulfito, Hektoen. 
A VARIEDADE DE MEIOS UTILIZADA DEPENDE MUITO DE MINHA EXPERIÊNCIA DE ANÁLISE, UTILIZO TANTOS QUANTO EU ACHAR QUE VAI SER SUFICIENTE PARA A IDENTIFICAÇÃO, LEVANDO SEMPRE EM CONTA A QUESTÃO DO CUSTO.
· AN (Ágar Nutriente): Serve para isolar a colônia.
A placa de petri pode apresentar uma divisão em duas partes para que possamos plaquear os dois meios juntos para comparação do crescimento do microrganismo. Ainda, podemos ter placas em meia lua que são aplicadas em análises em que não há necessidade de contagem de colônias, propiciando economia de meio, vouapenas realizar o esgotamento, que só consome metade da placa. Já são vendidas assim. São utilizadas para fazer esgotamento.
⇒ Como existem tipos diferente de Salmonella, utilizamos os meios diferentes para poder diferenciar (pois nem todas crescem no mesmo meio); é melhor fazermos dois caldos de enriquecimento para garantirmos que haja condições para as diferentes espécies se desenvolverem.
A placa dividida me ajuda a comparar o crescimento que houve nos dois meios de enriquecimento utilizados.
→ Quando uso selenito cistina e tetrationato- vai na estufa a 37°C. Porém, quando uso rappaport, é preferível que vá em banho maria pois necessita de temperatura de 45°C
→ Sempre é preferível o uso de banho maria!
· Plaqueamento: Apesar de análise de coliformes já me fornece uma contagem pelo NMP, posso realizar o plaqueamento, caso deseje.
Podemos fazer o plaqueamento de coliformes e Salmonella juntos:
· Plaqueamento de coliformes- se quiser, pode fazer em forma de estrias.
· Plaqueamento de salmonella: fazer em forma de estrias.
Conclusões: Nos dois vemos ausência e presença.
Os dois vem do trato intestinal, e temos os mesmos objetivos de plaqueamento (utiliza-se um meio seletivo e diferencial, diferenciando quem está crescendo através da cor). Podemos utilizar o mesmo meio de cultura, pois elas têm a mesma necessidade nutricional.
posso fazer separado mas geralmente o mesmo meio que uso para um eu uso pra outro
Observação: Se diferencia o crescimento através da cor, como precisamos fazer o mesmo procedimento para ambos, podemos fazer os dois plaqueamentos juntos.
→ O plaqueamento de coliformes geralmente ocorre para coliformes fecais (geralmente quando se quer verificar a presença de E. coli), a contagem já é feita nos tubos, então é meramente qualitativo.
→ Para melhor identificação, realizar as provas bioquímicas (para saber a espécie). Lembrando que plaqueamento de coliformes é opcional pois já fizemos a contagem por número mais provável
→ Provas bioquímicas vão me ajudar a identificar a colônia depois do plaqueamento→ passo da placa para um ágar nutriente e faço as análises.
· Meios de cultura: Possuem muitos nutrientes permitindo o crescimento de diversos MO Preciso depois inibir o crescimento dos indesejados de alguma maneira.
· Posso utilizar o mesmo meio de cultura para análise de coliformes e salmonella → MESMO MEIO, NÃO A MESMA PLACA. Apesar de possuírem as mesmas necessidades nutricionais, por serem bactérias do trato intestinal, crescerão em cores diferentes, pois uso um meio seletivo e diferencial.
Enterobactérias: possuem a presença do indicador verde brilhante (muda de cor quando for produzido no meio ácido) e sais biliares (são subprodutos da bile do estômago), pois enterobactérias crescem muito bem na presença deles.
A diferença entre os meios se dá pela presença de verde brilhante ou sais biliares e o tipo de indicador empregado (há vários indicadores com mesmo ponto de viragem).
Vai da prática do colaborador qual meio será utilizado, tem meios que vão representar respostas mais visíveis e outros um pouco mais difícil
· Ágar Verde Brilhante (VB): 
· Nutrientes: Peptonas= proteínas e extrato de levedura: vitaminas, açúcar e proteínas para o MO (proteína é sempre bom, fontes diferentes, substratos diferentes, consequentemente aminoácidos diferentes).
· Sistema inibidor: verde brilhante, onde as bactérias do trato intestinal conseguem crescer.
· Sistema indicador= carboidrato (lactose), a partir do carboidrato o MO fermentam produzindo ácido e mudar a cor da placa.
· Indicador de ph = vermelho de fenol (em meio ácido: amarelo e em meio alcalino; básico: vermelho).
· Cor inicial: Verde claro
→ Sempre vamos ter MO que fermentam e os que não fermentam.
→ Quando o MO usa a peptona ele tende a alcalinizar o meio (aumentar o pH);
→ Quando ele usa o carboidrato do meio ele tende a acidificar o meio pois produz ácido (reduz o pH). 
→ O indicador muda de cor junto com o pH. Pode usar mais de um tipo de carboidrato na placa, pois cada microrganismo prefere um carboidrato específico.
· Salmonella não fermenta a lactose (pode usar a peptona do meio ou a lactose para poder crescer) e cresce roxa (aumenta o pH), salmonella e proteus são parecidos, mas proteus fica vermelho.
· E. coli e Klebsiella fermentam o carboidrato, tendem a passar do vermelho para o amarelo (pois reduz o pH), o meio fica mais amarelado.
MEIOS INOCULADOS COM CULTURA PURA: O MICRORGANISMO FICA SUSPENSO EM SOLUÇÃO SALINA, SÓ TEM ELE NO TUBO DE ENSAIO, E COM ELE SE FAZ A ESTRIA.
 NA PLACA NÃO FICA APENAS DE UMA COR, APENAS ALGUMAS ÁREAS NA PLACA MUDAM DE COR.
OLHAR O MEIO DE CULTURA EM 24H E 48H PARA IDENTIFICAR BEM A COLORAÇÃO DO MEIO.
Importante: Geralmente meios de cultura tem ph de quase 7.
· Ágar Salmonella-Shigella (Ágar SS)
Cresce outras enterobactérias.
ESSE MEIO NÃO DEVE SER AUTOCLAVADO, FEITOS EM BANHO MARIA por conta dos indicadores, se autoclavar perde-se a função.
· Meio de cultura seletivo e diferencial
· Nutrientes= peptona e extrato de levedura.
· Sistema inibidor= verde brilhante (verde brilhante está no caldo).
· Sistema indicador= carboidrato (lactose);
· Indicador de pH= vermelho neutro.
· Meio rosado
· Salmonella cresce incolor e Shigella (também do trato intestinal) cresce rosa.
Difícil identificação, consequentemente pouco utilizado. Porém, existem pessoas que trabalham muito com esses MO, então conseguem diferenciar mais facilmente. 
E. Coli e Klebsiella também crescem neste meio, com uma coloração amarronzada.
SUPER ULTRA MEGA IMPORTANTÍSSIMO: OS MEIOS DE CULTURA ME AJUDAM APENAS NA DIFERENCIAÇÃO DO GÊNERO DO MICRORGANISMO, SOMENTE A PARTIR DAS PROVAS BIOQUÍMICAS QUE CONSIGO IDENTIFICAR A ESPÉCIE.
Algumas especificações:
→ LAC-: SALMONELLA E PROTEUS (não fermenta a lactose).
→ LAC+: E.COLI , KLEBSIELLA, ETC (TODOS DO TRATO INTESTINAL) Fermentam a lactose.
→ Alguns MO produzem H2S (gás sulfeto) Salmonella e Proteus (apenas algumas espécies, não a familia toda) crescimento de colônia com centros negros!
→ O meio oxida com facilidade (ficando meio amarronzado), tem que tomar cuidado, pois terá interferência na visualização dos resultados, se deixa mais de 48h pode oxidar (precisa de nutrientes e oxigênio, algo escasso dentro da estufa, porém tem!).
· Ágar XLD
· Seletivo e diferencial, nutrientes diferentes: cloreto de sódio, peptonas e leveduras.
· Sistema inibidor= desoxicolato de sódio (sal).
· Sistema indicador= carboidrato (lactose, sacarose e xilose);
· Indicador de pH= vermelho de fenol (alcalino= vermelho, ácido= amarelo)
· Indicador de produção de H2S: tiossulfato de sódio (ajuda na precipitação do gás sulfeto), citrato de ferro III e amónia.
· Meio original= vermelho.
· Salmonella irá fermentar um pouco da xilose (carboidrato com 5 carbonos), tenta acidificar, porém não há tanta xilose no meio, fazendo com que o resultado fique um pouco rosa.
· E. Coli fermenta a lactose, sacarose e xilose, acidifica melhor o meio, deixando o meio amarelo.
Ágar Rambach
· Meio mais caro RS 1500 à 3000;
· Vem separado em 8 potinhos:
· 4 potes com meio para preparar 250mL de meio + 4 potes com mistura cromogênica para preparar 250mL de meio (não tem como fracionar esse pó). Só consigo preparar 1L de meio. Prepara-se mais ou menos 45 placas.
· NÃO PODE SER AUTOCLAVADO;
· Melhor meio para diferenciar colônias!!!!
· Cor do meio inicial= Rosa bebe.
Observação: Faz parte de uma nova geração de meios de cultura = misturas cromogênicas. 
· Mistura cromogênicas: podem ser de vários tipos= Mistura que tem substâncias que podem ser metabolizadas pelos microrganismos caso possuam a enzima adequada, assimilar essa substância, a enzima que existe no microrganismo consegue fazer com que haja uma reação de mudança de cor (ação colorimétrica). Exemplo: essa substância passa de transparente para azul, significa que o MO está lá presente. 
· Exemplo da enzima Beta-Galactosidase (Existe na E.Coli e na klebsiella, faz parte do MO) Propileno glicol (está no material cromogênico e será usado pelo MO, tanto paracrescimento quanto fermentação; No caso da fermentação eles não tem beta-galactosidase).
· A salmonella não tem a Beta-Galactosidase, então ela vai usar o Propileno glicol para fermentar. Como não entra em contato com a mistura cromogênica, fica rosa o resultado da sua placa.
· Se a E. Coli tem essa enzima (Beta-Galactosidase), consegue provocar uma reação colorimétrica quando em presença do propileno glicol crescer, ficando um resultado azul para o crescimento do MO.
· Ágar bismuto sulfito: 
· Custo em torno de RS 800,00;
· Possui um sistema inibidor tenha a precipitação na placa, e a ação combinada do bismuto sulfito a com solução de sulfito de sódio e o verde brilhante.
· Melhor meio para análise de Salmonella (melhor visualização, pois ela cresce bem diferente).
· NÃO PODE SER AUTOCLAVADO POR CAUSA DA PRECIPITAÇÃO
· Nutrientes= Proteínas, carboidratos (glicose).
· Sistema inibidor= bismuto sulfito vai se transformar em bismuto sulfeto, faz com que a colônia de salmonella fique prateada.
· Cor inicial= verde;
· Cor final com salmonella=Brilhante e prateada.
· Sistema indicador= Fosfato ácido dissódico e sulfato ferroso (verificar formação de H2S- colônias com pontos negros).
· E. Coli sempre anda junto com Klebsiella= amarronzado
· Proteus = Verde escuro 
· Meio inicial- verde claro
⇒ E. COLI E KLEBSIELLA SÃO MELHORES AMIGAS, SEMPRE ANDAM JUNTAS. A ÚNICA DIFERENÇA É QUE A COLÔNIA DE KLEBSIELLA É MAIOR QUE A DA E.COLI.
Podemos diferenciar bem o crescimento por conta das cores!
· Ágar MC:
⇒ Verifica se o MO é lac+ ou Lac- (se consome ou não lactose);
⇒ lac +: colônias crescem no meio rosa escuro e ficam rosa claro (A da imagem).
⇒ Lac-: crescem de cor amarronzada (B da imagem).
· LAC-: SALMONELLA E PROTEUS (não fermenta a lactose).
· LAC+: E.COLI , KLEBSIELLA, ETC (TODOS DO TRATO INTESTINAL) Fermentam a lactose.
Ágar Hektoen: 
· Meio de cultura seletivo e diferencial;
· Para enterobactérias.
· NÃO PODE SER AUTOCLAVADO.
· Nutrientes: peptona, extrato de levedura e cloreto de sódio;
· Sistema inibidor: carboidrato (lactose, sacarose e salicina);
· Indicador de pH: fucsina ácida e azul de bromotimol( no ácido, o azul de bromotimol vai ficar amarelado, no básico fica mais azulado);
· Indicador de H2S: tiossulfato de sódio, citrato de ferro amoniacal.
· Inicialmente tem cor esverdeada.
⇒ Salmonella fica verde mais escuro por não fermentam os carboidratos.
⇒ Proteus pode formar H2S fermenta 1 dos carboidratos e pode ficar laranja (quantidade de ácido formada é tão pequena, que não consegue alterar tanto a cor).
⇒ E. coli e Klebsiella fermentam os 3 carboidratos, então ficam amarelas .
· Vibrio
· Não são mais enterobactérias, pois consomem lactose, fermentam glicose sem produção de gás (característica para ser enterobactérias é consumir o carboidrato e produzir gás).
· Ele tem sua própria família agora, microrganismos patogênicos… mais detalhes a frente.
· Possui bactérias halófilas (2-4% de sal).
· Doença causada: V. cholerae
· Doença intestinal aguda.
· Diarréia aquosa.
· Desidratação rápida.
· Pode levar a morte.
Uso dos Indicadores: devem ter pontos de viragem entre pH 7-3 em meios diferenciais.
· Esterilizando a alça de inoculação: Sempre inclinada (quase vertical) e perto da chama oxidante, deve ficar incandescente para saber que a alça foi esterilizada (parte de cima da chama), você vai saber se a alça vai estar fria colocando no meio de cultura e vendo se derrete ou não, para não matar o MO você só pega o MO depois que estiver fria.
· Para fazer o isolamento do MO (em estrias): a placa deve estar com a tampa virada para cima e pega-se a base com o meio (irá para a estufa de ponta cabeça, desse jeito evita contaminação que pode ter caído na tampa; assim que acaba de fazer uma estria, deve-se tampar a placa, só abrir quando for fazer a próxima; Esterilizar a alça (procedimento descrito acima), pega o MO e passar em uma placa (mergulhar no tubo com MO e fazer a raspagem de outra placa), fazemos isso para deixar concentrado os MO (1°), esteriliza-se a alça de novo e a partir da primeira passada, sem pegar mais MO, puxa-se (2°), esteriliza-se a alça de novo e a partir da primeira passada, sem pegar mais MO, puxa-se (3°), lembrando que acontece tudo na mesma placa.
· Provas Bioquímicas
Observação: Estudaremos dentro do grupo das enterobactérias mas servem para todos os tipos de microrganismos.
⇒ As réguas bioquímicas são utilizadas para saber se o MO são gram positivas ou gram negativas, para a identificação, fazemos a prova bioquímica.
⇒ Faço as provas quando achar necessário ou desconhecer um tipo de microrganismo que cresceu em minha placa (teste para colônia, nunca para água ou alimento), pois além de ser um teste caro, é descartável (kit de réguas bioquímicas).
· Teste TSI 
· Utiliza o meio de cultura TSI:Tem dois carboidratos: lactose e sacarose (dissacarídeos).
· Verificação da capacidade do MO em fermentar os dissacarídeos presentes no meio.
⇒ 3 resultados: 
· 1° se é fermentador ou não: Inicialmente o meio é vermelho, se o mo é fermentador o vermelho passa para laranja/amarelo, ele fermenta o carboidrato do meio, o ácido acidifica o meio mudando de cor. 
· 2° se é formador de gás ou não: se for, acontecem rupturas no meio, pois o gás não tem por onde sair, faz a pressão no meio causando uma ruptura ou corte (se o MO é capaz de fermentar glicose: a produção de gás é restrita e o tubo fica amarelo só no fundo).
· 3° se o Mo é formador de H2S ou não: Se for, aparece zona enegrecida (zona escura). 
· Glicose presente na concentração de 1%, é sempre fermentado por enterobactérias.
· Uma prova bioquímica pode dar várias respostas dependendo do m.o. que estamos trabalhando.
· Teste de utilização do Citrato 
⇒ Capacidade do MO utilizar o citrato como única fonte de carbono (separa os MO que utilizam o citrato e os que não utilizam), ou seja não crescem. A utilização do citrato, além de sais inorgânicos de amônia, alcaliniza o meio, pela produção de carbonatos e amônia.
⇒ Tira as fontes de carbono e só deixa o citrato de sódio. 
Quanto mais provas bioquímicas eu faço, melhor é meu resultado, pois vou afunilando os resultados e classificando eles mais precisamente geralmente 10-20- 30, etc provas)
⇒ Meio de cultura citrato de simmons= cor: esverdeado
⇒ Se o MO utiliza o citrato esse meio fica azulado.
⇒ Indicador: azul de bromotimol
⇒ Em 24h verifica-se o resultado.
⇒ Resultados: 
Positivo= mudança de cor (ÁPICE), fica um azul mais intenso.
Negativo= não muda a cor do meio.
*O ápice é onde inoculei o MO, por isso ele muda de cor primeiro e só depois o fundo. Em 24h apenas o ápice terá mudado de cor e já consigo avaliar o resultado, não precisando esperar 48 horas para mudar tudo.
· Teste de Lisina-ferro 
⇒ Mais utilizada para salmonella pois utiliza esses compostos como ajudantes em seu metabolismo.
⇒ Verifica se tem ou não Salmonella, pois a maioria dessas modifica a coloração do meio violeta e produzem H2S.
⇒ Cor do meio= caramelo claro.
⇒ Resultado: 
Positivo = formação de água no final do ápice e coloração mais intensa (intensificação da cor e formação de água pelo metabolismo da salmonella frente a lisina e o ferro).
· Prova de Fenilalanina
⇒ Prova utiliza para diferenciação de MO capazes de degradar a fenilalanina em ácido fenil pirúvico, por ação enzimática.
⇒ O aminoácido tem o grupo amina e grupo carboxila, ou o meio acidifica ou alcaliniza.
⇒ Desaminação = tirar o grupo amina do aa, acidifica o meio.
⇒ Descarboxilação= tirar o grupo carboxila do aa, alcaliniza o meio.
⇒ Verificar se o MO capazes de degradar (tirar o grupo amina) a fenilalanina em ácido fenil pirúvico, por ação enzimática.
⇒ Resultados:
Positivo: Uma cor verde aparecerá se o ácido fenilpirúvico tiver sido formado.
Negativo: A cor natural do meio não muda, somente aparecerá, deviam ao cloreto férrico, uma coloração amarela no ápice.
Como é um aminoácido, às vezes vários microrganismos utilizam ele na via metabólica, tornando essa prova não tão específica.
· Teste da gelatinase:
⇒ Provar