Técnicas de Preparo de Materiais para Microscopia de Luz - LAB. BIOLOGIA CELULAR - BIO 112

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PRÁTICA 01 
 
TÉCNICAS DE PREPARO DE MATERIAIS PARA MICROSCOPIA DE LUZ 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
 O estudo estrutural e ultra estrutural das células apresenta várias limitações, 
principalmente devido às reduzidas dimensões celulares, à ausência de contraste entre 
as organelas e entre outras estruturas da célula e à grande espessura dos materiais 
biológicos. Por esses motivos, o uso de equipamentos e de técnicas apropriadas para a 
obtenção e o processamento dos materiais biológicos para estudo da estrutura celular 
é de fundamental importância. 
 A observação direta das células, cujas dimensões são extremamente reduzidas, 
é feita por meio do microscópio de luz ou eletrônico. O primeiro apresenta um 
conjunto de lentes de vidro e o segundo, uma série de lentes eletromagnéticas que 
permitem a ampliação da imagem da célula e de suas estruturas. A questão do 
contraste é resolvida com o uso de corantes na microscopia de luz ou de 
contrastantes na microscopia eletrônica de transmissão, em uma etapa que é 
conhecida como coloração ou contrastação, respectivamente. Com isto, é possível 
identificar regiões específicas, organelas ou estruturas celulares, aumentando 
artificialmente o contraste entre elas, já que seus índices de refração são muito próximos 
entre si. Em outras palavras, as velocidades com as quais a luz atravessa essas 
estruturas não diferem significativamente entre si. 
 Devido à grande espessura dos materiais biológicos normalmente estudados e 
pelo fato da imagem ao microscópio ser formada a partir da luz (microscópio de luz) ou 
de elétrons (microscópio eletrônico) que atravessam a amostra, faz-se necessário obter 
camadas únicas de células, ou seja, sem sobreposição das mesmas. Como não existe 
grande resistência por parte da maioria dos tecidos ou órgãos para permitir cortes 
suficientemente finos, os materiais biológicos são incluídos em parafina ou resinas 
sintéticas que irão facilitar a microtomia, etapa esta que consiste em obter os cortes 
em equipamento apropriado denominado micrótomo. Alternativamente, existem 
outras formas de se obter camadas únicas de células, porém, não utilizando meios de 
inclusão, como por exemplo, o esmagamento e o esfregaço. 
 A seguir são apresentadas as principais etapas do processamento para 
obtenção de lâminas permanentes para estudos em microscopia de luz, utilizando a 
inclusão em resina sintética. 
 
1. OBTENÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO 
 
A primeira etapa do processo de preparo de uma lâmina consiste no isolamento 
do órgão ou um fragmento do mesmo que se pretende estudar, podendo ser tanto de 
origem animal ou vegetal. 
A retirada de amostras de tecidos, principalmente de animais, depende muitas 
vezes de lavagens sucessivas, para retirada de excesso de sangue ou de outros fluidos 
corporais. Para tanto, o órgão ou fragmento é lavado em solução fisiológica que 
apresenta concentração salina específica, conferindo-lhes pressões osmóticas 
equivalentes àquelas dos diferentes tipos celulares. A concentração dessa solução é 
importante para evitar alterações de volumes na célula em decorrência de entrada ou 
saída de água e/ou íons, causada por diferenças osmóticas. A solução fisiológica 
mais simples e mais utilizada é a de cloreto de sódio a 0,9% (m/v). 
 
 
 
 
 
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2. FIXAÇÃO 
 
A preservação das células é feita em uma etapa conhecida como fixação, 
processo que permite estabilizar as estruturas celulares e extracelulares, fazendo 
com que fiquem o mais próximo possível da sua condição “in vivo”. A fixação visa 
também evitar o processo de autólise (Ação que consiste na destruição ou 
aniquilamento dos tecidos e/ou células que se encontram no próprio organismo (corpo) 
por suas próprias enzimas), o que poderia alterar drasticamente a estrutura celular. 
Mesmo com todos os cuidados tomados nesta etapa, algumas alterações são 
introduzidas nas células, e desta forma as imagens obtidas ao microscópio apresentam 
artefatos. 
Uma boa técnica de fixação é aquela que interfere o mínimo possível na estrutura 
da célula, bem como na estrutura e localização das diferentes macromoléculas 
presentes na mesma. Esta etapa é importante tanto para a microscopia de luz quanto 
para a microscopia eletrônica, seja de transmissão ou de varredura. 
Existem vários métodos físicos e químicos de preservação de células, sendo que 
a fixação química é uma das mais empregadas na biologia celular. A fixação química 
pode ser conseguida utilizando-se substâncias que reagem com determinados 
sítios específicos de diferentes biomacromoléculas e promovem a sua 
estabilidade. Fixadores à base de aldeído (formaldeído, paraformaldeído e 
glutaraldeído), por exemplo, preservam melhor a estrutura celular, além de provocar 
baixa retração dos tecidos. O tempo e a temperatura de fixação vão depender do tipo 
de tecido e tamanho do fragmento a ser fixado. Fixadores mais drásticos, como o etanol, 
o ácido acético e outros, que promovem a desnaturação e precipitação de 
macromoléculas, podem também ser utilizados em estudos que não visem à análise 
estrutural das células. 
A criofixação é um método físico que se baseia no congelamento rápido de 
células, o que pode ser obtido com hélio ou nitrogênio líquido. Esse processo faz com 
que a água presente nos meios intra e extracelular passe do estado líquido para o sólido 
formando diminutos cristais de gelo, os quais podem danificar as estruturas celulares. A 
utilização de substâncias crioprotetoras, como o glicerol e a sacarose, impedem a 
formação de cristais de gelo durante o congelamento. 
As células também podem ser fixadas quando secas ao ar. Porém, a água, 
ao passar do estado líquido para gasoso, gera uma grande força de tensão superficial, 
induzindo grandes alterações na estrutura das células. 
É possível, também, a observação de materiais biológicos, ao microscópio de luz, 
sem o processo de fixação que são conhecidos como preparações a fresco. Neste 
caso o material é observado imediatamente após a sua obtenção e, em seguida, é 
descartado (lâminas não permanentes). Como exemplo de preparações a fresco pode-
se citar: esfregaço de líquidos corporais, cortes feitos à mão livre de tecidos vegetais, 
entre outros. 
 
3. DESIDRATAÇÃO 
 
Após a fixação, o material deve ser lavado para remover o excesso de fixador. 
Em seguida, é feita a desidratação utilizando-se uma solução apropriada, como o etanol 
ou a acetona, em banhos sucessivos de concentrações crescentes. A retirada da 
água é necessária para que a resina penetre nas estruturas do corte dando maior 
consistência ao mesmo. O tempo de desidratação depende do tecido em estudo e do 
tamanho do fragmento. 
 
 
 
 
 
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4. INCLUSÃO 
 
 A inclusão é feita para facilitar a obtenção de cortes finos e uniformes 
durante o processo de microtomia. O meio de inclusão mais indicado atualmente 
é uma resina sintética comercialmente conhecida como glicol metacrilato, constituída 
por monômeros de monoéster de etileno glicol do ácido metacrílico. Esta resina 
apresenta algumas características que são consideradas bastante importantes: 
afinidade pela água (hidrofilia), processamento rápido, fácil manejo, infiltração e 
polimerização à temperatura ambiente, baixos níveis de distorção e artefatos e permite 
a obtenção de cortes muito finos (próximos de 0,5 µm), com boa resolução ao 
microscópio de luz. 
 Uma característica que deve ser ressaltada é o fato de que os monômeros que 
constituem a resina ligam-se uns aos outros durante a polimerização formando uma 
trama tridimensional na qual as moléculas do tecido são envolvidas. Esta trama, agora 
um polímero, envolve as células, mas não se liga covalentemente aos componentes 
químicos celulares, e desta forma as macromoléculas presentes no tecido incluído 
mantêm seus radicais disponíveis, de forma a permitir a ligação de corantes, necessária 
à obtenção do contraste entre as estruturas e/ou regiões celulares. 
 A seguir são apresentadas as etapas de inclusão com a resina de glicol 
metacrilato. 
 
 4.1.Pré-infiltração 
 
 Esta etapa tem como objetivo permitir a penetração da resina na sua forma não 
polimerizada, de maneira gradual. Para isto, o tecido é embebido em uma mistura de 
glicol metacrilato e etanol absoluto na proporção de 1:1, por aproximadamente duas 
horas, em temperatura ambiente. Após esse período, é feita a infiltração propriamente 
dita. 
 
 4.2. Infiltração 
 
 Na infiltração o tecido permanece embebido em uma solução de infiltração 
(glicol metacrilato puro) por uma noite. Caso seja necessário, o tecido pode ser 
conservado na solução de infiltração por vários meses. Após a infiltração, o tecido é 
colocado em moldes plásticos, contendo solução de infiltração + catalisador. 
 
5. MICROTOMIA 
 
 Todo o processo descrito até agora proporciona um suporte para que os tecidos 
resistam à passagem da navalha durante a obtenção dos cortes. A espessura e a 
uniformidade dos cortes dependem da firmeza com que a navalha passa pelo material. 
Para tanto, aconselha-se o uso dos micrótomos automáticos. O avanço da navalha é 
regulável e pode fornecer cortes com espessuras de 0,5 a 12 µm. 
 Após a microtomia, os cortes são distendidos em água à temperatura ambiente 
e coletados em lâminas histológicas. Estes cortes devem ser secos em estufa a 45°C, 
por 15 minutos, ou em chapa aquecida a 45°C, por 30 minutos. 
 
6. COLORAÇÃO 
 
As diversas estruturas celulares apresentam baixo contraste entre si devido à 
proximidade dos seus índices de refração. Entretanto, esse contraste pode ser 
aumentado artificialmente por meio de coloração. 
Frequentemente, os corantes utilizados têm natureza ácida (ex: eosina) ou 
básica (ex: hematoxilina), evidenciando componentes celulares básicos ou ácidos, 
respectivamente. 
 
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O núcleo, por exemplo, tem maior afinidade por corantes básicos, devido à 
concentração nesta região de moléculas de caráter ácido (DNA e RNA). Já o 
citoplasma, que é rico em proteínas básicas, tem maior afinidade por corantes 
ácidos. 
 
7. MONTAGEM 
 
 Uma vez feita a coloração, torna-se necessário conservar o material 
corado. O procedimento normalmente utilizado consiste em cobrir o corte com uma 
lamínula, utilizando para isso uma resina de montagem (ex: Entellan). Assim, a 
lâmina permanente já está pronta para ser observada ao microscópio de luz. 
 Existem outras formas de se obter camadas únicas de células, porém não 
utilizando as etapas de inclusão e microtomia. No entanto, nestes casos as etapas de 
fixação, coloração e montagem são ainda necessárias para a obtenção de uma lâmina 
permanente. São exemplos de formas alternativas de obtenção de camadas únicas de 
células: 
- Esmagamento: consiste em colocar o material biológico sobre uma lâmina, 
cobri-lo com uma lamínula e promover, em seguida, uma pressão sobre a mesma, 
de forma que o material seja esmagado. A lamínula pode ser removida com o auxílio 
de nitrogênio líquido e a lâmina, após secar, transformada em lâmina permanente, 
bastando para isso utilizar a resina de montagem (por ex., Entellan). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
- Esfregaço: consiste em colocar uma gota de líquido corporal (por exemplo, 
sangue ou sêmen) na extremidade de uma lâmina e espalhar o material 
uniformemente sobre a mesma com o auxílio de outra lâmina inclinada em um ângulo 
de cerca de 45 graus. 
 
 
OBJETIVOS 
 
- Descrever os métodos comumente utilizados no preparo de lâminas histológicas de 
materiais biológicos. 
- Conhecer os passos do preparo de lâminas permanentes e justificar os propósitos de 
cada um. 
 
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ATIVIDADES 
 
Montagem de lâminas permanentes a partir de materiais incluídos em resina 
sintética 
 
 
a. Por que para serem observados ao microscópio de luz, os materiais biológicos não 
devem ser espessos? 
 
Para ser possível a passagem dos feixes de luz. 
 
b. Cite duas maneiras de obter camadas finas de células para a observação ao 
microscópio de luz. 
 
Esfregaço e esmagamento. 
 
c. Por que se utiliza soluções fisiológicas, e não água, para a lavagem de materiais 
biológicos? 
Para evitar alterações de volumes na célula em decorrência de entrada ou saída de água 
e/ou íons, causada por diferenças osmóticas. 
 
d. Qual é a importância da fixação do material biológico? Explique por que não é possível 
preparar lâminas permanentes com materiais não fixados. 
 
A fixação permite estabilizar as estruturas celulares e extracelulares, fazendo com que 
fiquem o mais próximo possível da sua condição “in vivo”. E evita a autólise celular. 
 
e. Por que é necessário desidratar os materiais biológicos antes da inclusão? 
 
Para poder ser possível a inclusão de resinas no material estudado. 
 
f. Qual é a importância da inclusão antes da microtomia? 
 
Aumentar a resistência do material para se obter cortes finos e com espessura 
homogênea. 
 
g. Qual equipamento é utilizado para se obter os cortes histológicos? 
 
Micrótomo. 
 
h. Qual é a importância da montagem no preparo de lâminas permanentes? 
 
Proteger o material que será estudado.