_Técnicas Histológicas 1 (1)

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Tecnicas 
HISTOLOGICAS
Histologia é o estudo das células e dos tecidos do
corpo e de como essas estruturas se organizam
para constituir os órgãos.
Tecnologia histológica é o conjunto de
procedimentos que envolvem a preparação de
amostras (tecidos ou células) para análise sob
microscopia de luz.
No microscópio de luz (microscópio óptico ou
fotônico) a imagem se forma a partir dos raios
luminosos de um feixe de luz que atravessou uma
estrutura. Células vivas, camadas delgadas de
tecidos e membranas transparentes de animais
podem ser observadas com facilidade. Na maioria
dos casos os tecidos são espessos e para serem
observados precisam ser fatiados em cortes
histológicos.
A técnica histológica pode ser dividida nas seguintes
etapas: coleta do material, fixação, clivagem,
descalcificação, processamento, inclusão,
microtomia, coloração, selagem e observação ao
microscópio. 
Introdução
Fixação
Finalidades: evitar a digestão dos tecidos por
enzimas das próprias células (autólise) e a
proliferação bacteriana, preservar os tecidos para
futuras colorações, endurecer os fragmentos,
manter as relações topológicas e morfológicas das
biomacromoléculas o mais próximo da situação "in
vivo" e parar o metabolismo celular, mantendo o
conteúdo bioquímico e preservando antígenos.
Fixação química: processo de estabilização de
biomoléculas pela ação de agentes químicos.
Um grande fragmento deve ser cortado em
outros menores antes de ser imerso no fixador, 
Fixação física 
A fixação por calor coagula proteínas, incluindo as
enzimas autolíticas, e dissolve lipídeos.
A fixação a frio age retardando ou interrompendo os
processos de autólise e necrose. No método de
resfriamento dos fixadores químicos, a penetração do
fixador nos tecidos é retardada, assim como os
processos de autólise e necrose, o que torna a fixação
mais lenta e efetiva. Já no método de congelamento, a
amostra é mergulhada em uma solução crioprotetora e
congelada, o que interrompe de forma imediata a
autólise. Após submeter o tecido a um congelamento
rápido, ele se torna rígido e pronto para ser seccionado.
O micrótomo para tecidos congelados é chamado
criostato ou criomicrótomo. Esse método é muito
utilizado por hospitais por ser rápido e porque não inativa
a maioria das enzimas e mantém muitas proteínas em
suas conformações naturais, ao contrário da fixação
química. Ele também é aconselhável para o estudo de
lipídeos, uma vez que a imersão em xilol os dissolve.
Fixação química
Dois dos fixadores mais usados para microscopia de luz
são uma solução de formaldeído a 4% e o
glutaraldeído. Para a microscopia eletrônica, é
necessária uma fixação dupla, usando uma solução de
glutaraldeído tamponado, seguida por uma fixação em
tetraóxido de ósmio, que preserva e fornece contraste
aos lipídeos e proteínas. 
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Fixação física: promove a preservação do tecido através
do aquecimento ou resfriamento da amostra.
para melhor penetração.
Desidratação: a água contida nos tecidos é
Infiltração: saturação das cavidades dos tecidos por
uma substância infiltrante. A parafina deve estar
fundida, com temperaturas em torno de 56ºC -
60ºC. 
necessitará de 3 etapas: desidratação → clarificação
→ infiltração.
extraída pela passagem dos fragmentos por
diversos banhos de concentrações crescentes
de etanol.
Clareamento: o etanol nos fragmentos deve ser
substituído por uma substância intermediária
(xilol ou toluol) que é miscível tanto no etanol
quanto no meio escolhido para a inclusão
(parafina ou resina). Quando os fragmentos são
embebidos no solvente orgânico, eles ficam
transparentes ou translúcidos. Em seguida, são
colocados em parafina derretida (56 a 60ºC), o calor
causa a evaporação do solvente orgânico, e a parafina
penetra nos tecidos.
Proporciona uma consistência rígida aos fragmentos
para possibilitar a obtenção de secções delgadas com
o micrótomo. 
A temperatura da parafina não deve exceder 5°C
acima do seu ponto de fusão, com riscos de causar
danos ao tecido. As pinças utilizadas para a inclusão
devem estar constantemente aquecidas. Pinças não
aquecidas dificultam a inclusão pois grudam no
tecido. 
Fatores que influenciam no processo da fixação:
O volume do fixador deve ser 20% maior que o
fragmento, pois durante o processo as moléculas do
fixador irão se ligar ao tecido, o que, em quantidade
não adequada, pode resultar no esgotamento dessas
moléculas antes da fixação se concluir. Cada fixador
possui um tempo característico de atuação. Ao
respeitar o período necessário para fixação,
estaremos preservando a morfologia do tecido, bem
como as ativadades enzimáticas e imunológicas.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Clivagem
Redução do tamanho e da espessura dos fragmentos,
permitindo de forma mais eficaz a penetração do
fixador para o interior das amostras e,
consequentemente, a melhor difusão dos reagentes
durante o processo histológico. A espessura
aconselhada é de 3 mm. Cada órgão possui um plano
ideal de clivagem que deve ser seguido.
Processamento
Reúne procedimentos que visam substituir a água que
se encontra nos tecidos por um meio mais sólido, que
confere a resistência e a dureza suficientes para ser
cortado. Normalmente em laboratórios utilizamos o
ACT como meio para as amostras congeladas e a
parafina para amostras fixadas quimicamente.
No caso da parafina, por sua natureza hidrofóbica e
solúvel em alguns solventes orgânicos como o xilol, 
Inclusão
Microtomia
Após os fragmentos serem retirados da estufa, a
parafina solidifica e eles se tornam rígidos. Os blocos
são levados ao micrótomo, onde são seccionados de
modo a fornecer cortes de 1 a 10 μm de espessura. 
Para realizar o corte, há navalhas permanentes de
aço ou descartáveis. As navalhas permanentes
possuem maior durabilidade mas precisam ser afiadas
à mão e possuem geralmente resultado inferior. As
navalhas descartáveis geram maior custo mas
economizam tempo do profissional e produzem
resultados melhores. 
temperatura
espessura do tecido
tempo de fixação
escolha do fixador
relação volume do fixador/tamanho do
espécime
pH do fixador
concentração de fixadores.
Após o corte, os tecidos devem ser aderidos às
lâminas. Esse processo ocorre por capilaridade, sendo a
água meio suficiente para adesão. Para auxiliar a adesão
dos tecidos podemos usar substâncias adesivantes
(como Albumina de Meyer, Getalina, etc).As fatias que
formam uma fita passam por um banho frio em álcool
30% para facilitar sua distenção. Em seguida, são
transferidos para banho-maria aquecido entre 40 e
45ºC. Recomenda-se que as lâminas sejam lavadas em
solução de água e sabão neutro a 5%. Depois, devem
ser levadas ao microondas, ajustado para alta potência,
por 15 minutos. Em seguida, banhá-las em água
corrente por meia hora. Em seguida, devem ser
colocadas em suportes apropriados para a secagem e
levadas à estufa (60ºC, 4h-24h). As amostras que não
forem levadas à estufa poderão desprender da lâmina
durante a coloração.
Permite o estudo de células, tecidos, objetos e
microrganismos.
A maioria dos cortes histológicos deve ser corada,
porque, com poucas exceções, os tecidos são
incolores. Muitos corantes se comportam como
substâncias de caráter ácido ou básico e tendem a
fazer ligações eletrostáticas (salinas) com
componentes ionizados dos tecidos. Os componentes
dos tecidos que se coram bem com corantes básicos/
ácidos são chamados de basófilos e acidófilos. Há ainda
os corantes neutros, que são uma combinação de um
corante ácido + um corante básico (exemplo:
cloridrato de eosinato e azul de metileno) e os
corantes indiferentes, insolúveis em água e solúveis
em lipídeos (exemplo: sudan).
Dentre todos os corantes, a combinação entre
hematoxilina e eosina (HE) é a mais utilizada. A
hematoxilina possui caráter básico e cora em azul ou
violeta o núcleo das células e a eosina possui caráter
ácido e cora o citoplasma e o colágeno em cor de rosa.
Antes de começar a coloração com HE, é preciso
remover a parafina do tecido para que o corante
penetre. Esse procedimento é chamado de
desparafinização e é feito com o xilol.Após a
desparafinização, iniciamos a hidratação, para remover
o xilol dos preparados histológicos. Deve ser iniciada 
Coloração
O microscópio de luz é composto de partes
mecânicas e ópticas. O componente óptico
consiste em três sistemas de lentes:
condensador, objetivas e oculares. O condensador
concentra a luz e projeta um feixe de luz sobre o
espécime, a objetiva recebe a luz que atravessou o
espécime e projeta uma imagem aumentada em
direção à ocular, que novamente amplia a imagem
e a projeta em uma tela.
com dois banhos de álcool absoluto, seguidas de
concentrações decrescentes de álcool 95 e 70%,
até a água destilada. Por fim, usamos entellan para
aderir uma lamìnula à lâmina.
Microscópio de luz (óptico ou de campo
claro)
Microscopia eletrônica de transmissão
Se baseia na interação entre elétrons e
componentes dos tecidos.
A lente condensadora focaliza o feixe de elétrons
no espécime. Alguns elétrons interagem com o
espécime e continuam em direção às outras
lentes, enquanto outros não. Ao alcançarem a
lente objetiva, forma-se uma imagem aumentada,
a qual é projetada nas outras lentes e aumentada
ainda mais.
Processamento do material: fixação com
glutaraldeído (fixa as proteínas) e tetróxido de
ósmio (fixa os lipídeos); inclusão em Epon;
ultramicrótomo (faca de diamante, 40 - 90 nm);
contrastação com uranila e chumbo.
Microscopia
Parâmetros importantes para a observação em
microscopia:
Aumento: é a capacidade de fazer um objeto parecer
maior do que ele realmente é.
Resolução: capacidade de discernir duas estruturas
distintas que estejam juntas.
Fracionamento celular
Processo físico pelo qual é usada a força centrífuga
para separar organelas e componentes celulares em
função de seus coeficientes de sedimentação. O
coeficiente depende do tamanho da partícula, sua
forma e densidade e viscosidade do meio em que está
suspensa.
M I C R O S C Ó P I O D E L U Z
M I C R O S C Ó P I O E L E T R Ô N I C O
Método: secções são iluminadas por uma fonte de
luz de mercúrio sob alta pressão. Filtros especiais
permitem selecionar o comprimento de onda que
alcança o espécime e também o que é emitido pelo
espécime, as substâncias fluorescentes são
observadas como objetos brilhantes e coloridos.
O microscópio de contraste de fase utiliza um
sistema de lentes que produz imagens visíveis de
objetos quase transparentes. Produz imagens
tridimensionais vistas em preto, branco e tons de
cinza (não é necessário coloração). Usa a
propriedade de refração da luz. Transforma
diferentes fases luminosas em diferentes
intensidades luminosas. É utilizado para o estudo de
células vivas e material não corado.
Fornece imagens pseudotridimensionais. Um
feixe de elétrons é focalizado sobre o espécime,
percorrendo sequencialmente (não atravessa o
espécime). Os elétrons varrem uma camada de
metal previamente aplicada ao espécime, são
refletidos pelos átomos do metal, captados por
um detector e transmitidos a amplificadores que
geram um sinal, formando a imagem.
Processamento do material: fixação com
glutaraldeído e tetróxido de ósmio; material não
sofre inclusão, é colocado no ponto crítico onde
ocorre a retirada total de água do sistema (utiliza-
se CO2); montagem no stub e metalização -
jateamento de metal na amostra utilizando o
metalizador (geralmente ouro e paládio).
Microscopia de contraste de fase e de
contraste diferencial de interferência
Microscopia de fluorescência 
Fenômeno da fluorescência: quando substâncias
são irradiadas por luz de um determinado
comprimento de onda, elas emitem luz com um
comprimento de onda mais longo.
Microscopia eletrônica de varredura
Microscópio de campo escuro
No microscópio de campo escuro, a amostra aparece
iluminada contra um fundo preto, o que aumenta a
capacidade de resolução do instrumento. Esse
microscópio é importante para a observação de
material não vivo que é pouco corado com corantes ou
para a análise de células vivas, ou seja, amostras que
não passaram por tratamento de imobilização
(fixação).