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Atividade Semipresencial 1) Referente ao artigo “Genotoxicity of flubendazole and its metabolites in vitro and the impact of a new formulation on in vivo aneugenicity”, responda: a) Quais parâmetros foram avaliados a partir dos bioensaios de mutagenicidade utilizados, cujos resultados estão indicados nas Tabelas 1 e 2, e como o flubendazol pode ser caracterizado? Justifique suas respostas. Na tabela 1 foi avaliado o potencial mutagênico do flubendazol em células de linfócitos humanos com e sem a ativação metabólica sob uma exposição aguda. Já na tabela 2 foi avaliado o potencial mutagênico do flubendazol em linfócitos humanos através de uma exposição crônica. Ambas as tabelas apresentam os resultados obtidos no teste de micronúcleos onde se avalia a presença ou ausência de micronúcleos. O flubendazol para o tratamento agudo (3h+21h) pode ser caracterizado como um agente com potencial mutagênico tanto na presença de s9 mix quanto na ausência. Porém, na ausência de metabolização na dose de 5µg/ml já apresentou um aumento significativo no número de micronúcleos em relação ao controle negativo. Entretanto, na presença da metabolização apenas na dose de 14µg/ml que foi possível observar um aumento significativo no número de micronúcleos. No tratamento crônico (24h+24h) a partir de pequenas doses (0,250 µg/ml) o flubendazol foi capaz de causar um número significativamente aumentado de micronúcleos quando comparado com o controle negativo. b) Qual informação adicional foi obtida a partir dos resultados da Tabela 3 e como isto foi realizado? É possível obter esta informação para o bioensaio in vivo? Explique. Na tabela 3 foram analisados os micronúcleos sem centrômero (dano clastogênico) e os micronúcleos com centrômero (dano aneugênico) através da técnica de Hibridação in situ fluorescente (Fish). Esta técnica pode ser aplicada tanto em in vitro como in vivo e permite a detecção e a quantificação de alterações cromossômicas (numéricas ou estruturais). Para o composto testado foi observada a presença significativamente maior de danos aneugênicos (perda de cromossomo inteiros) do que clastogênicos (perda de um fragmento do cromossomo). 2) Referente ao artigo “Cytotoxic and genotoxic potential of Cr(VI), Cr(III)-nitrate and Cr(III)-EDTA complex in human hepatoma (HepG2) cells”, responda: a) Descreva os resultados obtidos com o Cr(VI) apresentados na Figura 3 e explique cada parâmetro avaliado. O teste de micronúcleos com bloqueio da citocinese (BCMN) é uma excelente ferramenta para avaliar a mutagenicidade dos compostos. Os micronúcleos são causados por danos aneugênicos (perda de um cromossomo inteiro) ou clastogênicos (perda de uma parte do cromossomo), essa perda gera um pequeno núcleo que é incorporado juntamente ao citoplasma celular. As pontes nucleoplasmáticas são marcadores de instabilidade genômica, que são caracterizadas pela ligação entre núcleos em células binucleadas, estes danos ocorrem devido a rearranjos cromossômicos e cromátides que migram para polos opostos da célula. E por fim, os Brotos nucleares são resultantes das amplificações de DNA eliminadas, que serão observados como um pequeno apêndice ligado ao núcleo principal da célula. A figura 3 representa os resultados obtidos através do teste de micronúcleos com bloqueio da citocinese (BCMN) em células de HepG2, onde foi testado o potencial mutagênico do Cr(VI), Cr(III)-Nitrato e Cr(III)-EDTA. Para isso, os parâmetros analisados foram a frequência de células binucleadas com micronúcleos, pontes nucleoplasmáticas e brotos. Além disso, foi avaliada a citotoxicidade dos compostos testados a partir da frequência de células apoptóticas e necróticas. Os resultados mostraram uma frequência significativa no número de micronúcleos apenas para as concentrações de 0,2µg/mL e 0,5µg/mL de Cr(VI). Além disso, as doses de 0,5µg/mL e 1µg/mL de Cr(VI) apresentaram toxicidade quando comparadas com o controle. Já os Cr(III)-Nitrato e Cr(III)-EDTA não apresentaram riscos ao DNA. Também não foram encontradas pontes nucleoplasmáticas e brotos significativamente aumentadas para nenhuma das concentrações em nenhum dos poluentes testados. b) Por que alguns dos parâmetros descritos na Figura 3 não podem ser avaliados no teste de micronúcleos in vivo? No teste de micronúcleos (MN) in vivo é possível observar apenas o número de MN em células mononucleadas, não sendo possível observar pontes ou brotos. Isso ocorre pois no teste in vivo não temos como bloquear a citocinese e então não são formados os parâmetros adicionais proporcionados no teste de MN com bloqueio da citocinese. Entretanto, no teste de MN in vivo é possível observar o número de células policromáticas e normocromáticas. 3) Referente ao artigo “Cytotoxic, mutagenicity, and genotoxicity effects of guanylhydrazone derivatives”, responda: a) Faça a análise dos dados apresentados na Tabela 5 e Figura 4, descreva as propriedades genotóxicas dos compostos avaliados e explique as diferenças entre estes dois conjuntos de resultados. Qual a diferença metodológica? De acordo com os resultados do ensaio cometa com enzimas nas células V79 (figura 04) os derivados da guanylhydrazona 2,3 DMeB e 3,4 DMeB causaram danos oxidativos em todas as doses testadas. Na tabela 5, temos os resultados encontrados no ensaio cometa alcalino com e sem metabolização, onde podemos observar que o derivado 3,4 DMeB foi capaz de induzir danos genotóxicos apenas nas doses de 100µM e 1000µM tanto na presença de s9 mix quanto na ausência. Entretanto, o derivado 2,3 DMeB foi capaz de causar danos ao DNA em todas as doses quando testado sem S9 mix, porém quanto testado com a presença da metabolização apresentou danos ao DNA apenas nas doses de 100µM e 1000µM. Estas duas metodologias embora recebam o mesmo nome (ensaio cometa) diferem, pois no ensaio cometa alcalino podemos avaliar apenas se o composto causa ou não dano ao DNA, já no ensaio cometa com a adição de enzimas podemos observar se o composto testado causa danos oxidativos ao DNA. b) Seria possível avaliar através do teste cometa a cinética de reparação do DNA? Explique. Sim, o ensaio cometa é uma eficiente ferramenta para se detectar a cinética de reparo celular. Para isso, é necessário fazer uma coleta imediatamente após a indução do dano e uma coleta após o tempo de reparo celular, e posteriormente, avaliar os danos genotóxicos com e sem a enzima de reparo. Para isso, é necessário ser aplicada a seguinte fórmula: { 1-[(Enzi) – (Conti)] / [Enz0) – (Cont0)]} * 100. Onde Enz e Cont representam as medidas dos cometas com e sem o tratamento enzimático, respectivamente, e 0 é a medida imediatamente após a indução do dano e i é a medida após o tempo de reparo. c) Referente às Tabelas 1 e 2 caracterize os compostos estudados em relação à atividade mutagênica. Por que foram utilizadas diferentes cepas bacterianas? Explique também as diferenças entre os dados das Tabelas 1 e 2. No teste de Ames são utilizadas diferentes linhagens de Salmonela typhimurium (TA1535, TA1537, TA1538, TA97a, TA98, TA100, TA102 e TA104), estas linhagens apresentam diferentes mutações no operon do aminoácido histidina, o que as tornam auxotróficas para histidina. Estas cepas são incapazes de crescerem em meio sem histidina, a não ser que ocorra uma reversão da mutação e a sua síntese seja restaurada. As linhagens TA1535, TA100, TA102 e TA104 são capazes de detectarem mutações por substituições de pares de bases e as linhagens TA1537, TA1538, TA97a e TA98 são capazes de detectarem mutações por deslocamento no quadro de leitura. Para que se tornassem mais sensíveis aos agentes mutagênicos algumas características genéticas foram adicionadas, tais como: mutação no gene rfa (removendo a barreira lipopolissacarídea da parede bacteriana) e deleção uvrB (exceto TA102) aumentando o reparo por mecanismos sujeitos a erros. Algumas destas cepas (TA97a, TA98, TA100, TA102 e TA104) também receberam a adição de um plasmídeo pKM101, que carrega o gene mucAB, responsável pelo aumento do sistema de reparo passível de erros.A TA102 também recebeu o plasmídeo pAQ1 que carrega a mutação hisG428, aumentando o número de sítios específicos para mutagênese, tornando esta linhagem capaz de detectar danos oxidativos. De acordo com as tabelas 1 e 2 ambos os compostos não se mostraram mutagênicos para o teste ames nem sem a ativação metabólica (tabela 1) e nem com ativação metabólica (tabela 2). d) Como você explicaria os resultados do teste de Ames caso os dados obtidos fossem os seguintes: - Mutagênico sem S9, não mutagênico com S9. Neste caso o resultado demostraria que o composto testado apresenta um efeito mutagênico com ação direta, ou seja, ele não precisa ser metabolizado para causar dano ao DNA. Porém, após a sua metabolização ele pode perder esse efeito mutagênico. - Não mutagênico sem S9, mutagênico com S9. Neste caso o resultado demostraria que o composto testado apresenta um efeito mutagênico com ação indireta, ou seja, ele precisa passar pela metabolização para se tornar um agente com potencial mutagênico. - Mutagênico com e sem S9, sem diferenças significativas entre os mesmos. Neste caso o resultado demostraria que o composto testado apresenta um efeito mutagênico que não depende de metabolização, entretanto, após ser metabolizado ele ainda apresenta um potencial mutagênico.
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