MODULO I MICOLOGIA CLINICA

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MODULO I 
MICOLOGIA CLINICA 
Sumário 
1 Biologia dos fungos ................................................................................................................................... 2 
1.1 Nutrição e metabolismo dos fungos ....................................................................................................... 3 
2 Taxonomia e Classificação dos fungos...................................................................................................... 3 
2.1 Filo Chytridiomycota.............................................................................................................................. 3 
2.2 Filo Neocallimastigomycota ................................................................................................................... 4 
2.3 Filo Blastocladiomycota ......................................................................................................................... 4 
2.4 Filo Microsporídica ................................................................................................................................ 4 
2.5 Filo Glomeromycota ............................................................................................................................... 4 
2.6 Filo Ascomycota ..................................................................................................................................... 4 
2.7 Filo Basodiomycota ................................................................................................................................ 5 
2.8 Fungos Anamórficos .............................................................................................................................. 5 
3 Drogas Antifúngicas .................................................................................................................................. 5 
4 Laboratório de micologia .......................................................................................................................... 6 
4.1 COLETA DE ESCAMAS DE PELE ..................................................................................................... 6 
4.2 COLETA DE PELOS E CABELOS ...................................................................................................... 6 
4.3 COLETA DE UNHAS ........................................................................................................................... 6 
4.4 COLETA DE MUCOSAS, ORIFÍCIOS NATURAIS E SECREÇÕES DIVERSAS ............................ 7 
4.5 COLETA DE SANGUE PERIFÉRICO E MEDULA ÓSSEA .............................................................. 7 
4.6 COLETA DE PUS E LÍQUIDOS PATOLÓGICOS .............................................................................. 7 
4.7 COLETA DE URINA ............................................................................................................................ 7 
5 Diagnóstico laboratorial de fungos ............................................................................................................ 7 
5.1 Exame direto: Microscopia ..................................................................................................................... 7 
5.2 Exame microscópico com hidróxido de potássio (KOH) ....................................................................... 8 
5.3 Exame microscópico com Tinta Nanquim (Tinta da China) .................................................................. 8 
5.4 Exame microscópico com Coloração pelo Método de Gram ................................................................. 9 
5.5 Exame microscópico com Coloração Panótica (Giemsa, Leishman ou Wright) .................................... 9 
6 Exame indireto: Cultura celular ................................................................................................................. 9 
7 Identificação de fungos............................................................................................................................ 10 
7.1 Identificação de fungos filamentosos ................................................................................................... 10 
7.2 Identificação de fungos dimórficos ...................................................................................................... 11 
7.3 Identificação de leveduras .................................................................................................................... 11 
7.4 Identificação de Candida albicans e Candida sp. .................................................................................. 12 
7.5 Identificação de Cryptococcus .............................................................................................................. 12 
 
 
 
 
1 Biologia dos fungos 
Você certamente já notou, ao se deparar com um pão mofado, que ele estava cheio 
de pontinhos pretos, certo? Ou, ainda, já visualizou uma parede esverdeada mofada. Ou 
até mesmo já comeu queijo, tomou cerveja com os amigos comemorando algo. Você sabia 
que os fungos são grandes responsáveis por esses produtos? Eles se apresentam de 
diferentes formas, mas todos fazem parte do grande Reino Fungi. Vamos conhecer um 
pouco desse grande grupo? 
Os fungos são conhecidos pela população como mofos e bolores. Porém, quase 
sempre são lembrados somente como danosos, seja causando problemas de saúde como 
alergias e micoses em pessoas e animais, ou parasitando plantas. Ou, ainda, lembramos 
deles causando estragos em materiais, seja por deterioração ou por somente dar aquele 
aspecto esverdeado e envelhecido nos objetos arquitetônicos. Além disso, estima-se que 
milhares de doenças causadas por fungos em plantas economicamente importantes levem 
à um prejuízo de mais de um bilhão de dólares por ano (TORTORA; FUNKE; CASE, 
2012, p. 330). 
Os fungos são organismos eucarióticos, ou seja, seres que apresentam uma 
membrana nuclear que envolve o núcleo, o qual é definido e possui o material genético, 
formado pelos cromossomos e o nucléolo. 
Esses organismos podem ser unicelulares (possuem uma única célula), ou 
multicelulares (possuem mais de uma célula). Eles são seres heterotróficos, o que 
significa que não possuem pigmentos fotossintéticos capazes de absorver energia 
luminosa como forma de síntese de compostos orgânicos. A maioria dos fungos possui 
sua parede celular composta por quitina (polissacarídeo presente em artrópodes) e α-
glucano. Como exemplos de fungos multicelulares (os bolores) e podemos citar os fungos 
filamentosos, como os cogumelos. Já como fungos unicelulares, temos as leveduras 
(SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 41). 
Além disso, é válido ressaltar que, dentro do grupo de fungos filamentosos, existe 
uma variação que são os chamados fungos dimórficos, os quais se apresentam sob ambas 
as formas, dependendo principalmente da temperatura, mas sob influência também do 
teor de CO2 e condições nutricionais (ANVISA, 2016, p. 2). 
Estima-se que, atualmente, existem aproximadamente cerca de 1,5 milhões de 
espécies de fungos, e somente cerca de 69.000 espécies são conhecidas pelos especialistas 
da área, os micologistas. Infelizmente, devido à ação predatória do meio ambientes, 
algumas espécies acabam sendo extintas antes de serem descobertas e analisadas, 
causando prejuízo imensurável para o equilíbrio ecológico, além de se limitar a 
possibilidade de conhecimento acerca do potencial biotecnológico e biomédico dessas 
espécies. 
A maioria dos fungos que conhecemos se origina nos esporos (quando a 
reprodução é sexuada) ou nos conídios (quando a reprodução é assexuada). Para que essa 
germinação aconteça, é necessário condições específicas, como calor e umidade 
(MOLINARO et al., 2009, p. 400). 
O resultado dessa germinação é a formação de filamentos finos, que se chamam 
tubos germinativos. Esses tubos então vão se ramificando em vários sentidos e acabam 
formando uma grande massa filamentosa, formando o que chamamosde micélio, o qual 
constitui o sistema vegetativo (importante para a absorção nutricional do fungo e 
desenvolvimento do mesmo) (MOLINARO et al., 2009, p. 400). 
Existem também uma variedade de filamentos mais simples que, em conjunto, 
formam o micélio, os quais chamamos de hifas. As estruturas reprodutivas são 
denominadas de corpo de frutificação e essa normalmente é a estrutura visível a olho nu 
nos fungos. 
1.1 Nutrição e metabolismo dos fungos 
Conforme já falamos anteriormente, os fungos não possuem clorofila e, por isso, 
o substrato que ele se encontra necessita fornecer todas as substâncias que ele precisa para 
sobreviver, o que obriga os fungos a viverem em estado de saprofitismo, parasitismo, 
simbiose ou mutualismo. De acordo com Molinaro e colaboradores (2009, p. 402 e 403) 
sendo assim, podemos dividi-los em alguns grupos principais, tais como SAPRÓFITAS 
OBRIGATÓRIOS, PARASITAS FACULTATIVOS OU SAPRÓFITAS 
FACULTATIVOS, PARASITAS OBRIGATÓRIOS 
Para que cresçam e se desenvolvam, várias espécies não precisam de luz, já outras 
necessitam, para formar suas estruturas de reprodução, podendo ser consideradas 
fototróficas (as quais buscam a luz). A temperatura ideal para o desenvolvimento dos 
fungos se encontra entre 0º a 350°C, mas o ótimo para a maioria fica entre 20º a 300°C e 
a umidade ideal fica em torno da saturação (MOLINARO et al., 2009, p. 403). Ou seja, 
os fungos conseguem crescer e se desenvolver numa ampla faixa de temperatura, sendo 
considerados então cosmopolitas, pois estão presentes em qualquer parte do planeta, 
distribuindo-se no solo, no ar, na água, nos animais, nos vegetais, na matéria em 
decomposição, nos produtos de alimentação e entre outros. 
2 Taxonomia e Classificação dos fungos 
A taxonomia dos fungos é dividida, de forma tradicional, em características 
citológicas e morfológicas. É importante que você saiba que essa taxonomia atualmente 
pode ir mudando novas características serem adicionadas, com o desenvolvimento de 
técnicas bioquímicas e moleculares, como forma de auxiliar a identificação das espécies 
fúngicas. Técnicas como as baseadas na Reação de Cadeia da Polimerase (PCR), 
sequenciamento de DNA, isoenzimas e cromatografia são bons exemplos de 
possibilidades de identificação de novas espécies fúngicas (MOLINARO et al., 2009, p. 
403). 
Dividimos, então, o reino Fungi em sete filos: Chytridiomycota, 
Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microsporídia, Glomeromycota, 
Ascomycota e Basidiomycota, e um grupo, os fungos anamórficos. Este último grupo não 
possui valor taxonômico, sendo seus membros relacionados aos filos Ascomycota e 
Basidiomycota (MOLINARO et al., 2009, p. 403). Não se assuste com os nomes, logo 
falaremos de cada filo! 
2.1 Filo Chytridiomycota 
De acordo com Molinaro e colaboradores (2009, p. 404), esses são fungos 
saprófitos aquáticos, sendo poucos marinhos e muitos de água doce. Um exemplo de 
fungo desse filo é Chytriomyces sp. 
Segundo Silva e Coelho (2009, p. 10) a maior parte desse tipo de fungo 
quitridiomicetos são saprófitos, existindo também espécies parasitas de plantas, animais 
e outros fungos. Quando são hospedeiros de vegetais, eles parasitam plantas superiores, 
musgos e fitoplancton. Em animais podem parasitar nematóides, rotíferos, mosquitos e 
besouros 
2.2 Filo Neocallimastigomycota 
Representantes desse filo são encontrados no trato digestivo de mamíferos 
herbívoros e bem possivelmente em demais ambientes terrestres e aquáticos que sejam 
anaeróbicos. Exemplo desse filo são os Neocallimastix sp (MOLINARO et al., 2009, p. 
404) 
2.3 Filo Blastocladiomycota 
Representantes desse filo são assexuados, habitam locais restritos de água e 
parasitam principalmente insetos. Exemplo desse filo são os Allomyces sp. e 
Coelomomyces sp (MOLINARO et al., 2009, p. 404). 
2.4 Filo Microsporídica 
Representantes desse filo não possuem mitocôndria na sua estrutura celular, além 
de serem parasitas obrigatórios de animais e, normalmente, hospedarem-se em peixes e 
insetos (MOLINARO et al., 2009, p. 404). 
2.5 Filo Glomeromycota 
Representantes desse filo são fungos filamentosos de micorrizas arbusculares, ou 
seja, participam de uma relação mutualistíca com algumas plantas. Exemplos são o Mucor 
sp. e Glomus sp. (MOLINARO et al., 2009, p. 404 e 405). 
 
2.6 Filo Ascomycota 
Esse é o maior grupo do reino Fungi, representando quase 75% de todos os fungos 
já descritos taxonomicamente. Representantes desse filo são fungos saprófitas, 
cosmopolitas e são parasitas especialmente de algumas plantas. Além disso, podem viver 
em associação mutualística com algas unicelulares formando o que chamamos de líquens. 
Exemplos são o Eurotium sp. e Emericella sp. (MOLINARO et al., 2009, p. 405). 
Segundo Silva e Coelho (2009, p. 13) também existem ascomicetos parasitas de 
vegetais, os quais representam um grande problema econômico para muitos países, uma 
vez que por exemplo a espécie Cryphonectria parasítica ataca folhas de castanheiras, o 
que acaba comprometendo seu crescimento e prejudicando as plantações 
Os fungos comestíveis, conhecidos como morchelas, e também as trufas, são 
ascomicetos. Apreciadores procuram, e muito, o ascoma de Morchella esculenta e o 
cultivo dessa espécie só foi possível de ser realizado em 1983, não permitindo produção 
em escala industrial, o que torna essa espécie mais desejada ainda (SILVA; COELHO, 
2009, p. 13). 
Outra espécie de ascomiceto muito desejada por apreciadores é a espécie Tuber 
melanosporum é uma trufa comestível. Essa espécie é micorrízica das raízes de carvalho 
e mantém seus ascomas sob o solo, liberando seus esporos quando apodrecem ou são 
destruídos por animais (SILVA; COELHO, 2009, p. 13). 
A maioria das leveduras também são ascomicetos unicelulares, e elas irão se 
dividir em diferentes 60 gêneros com aproximadamente 500 espécies conhecidas 
2.7 Filo Basodiomycota 
Os fungos desse filo são saprófitos e cosmopolitas. São os cogumelos que tanto 
conhecemos. Exemplos desses fungos são Agaricus sp. e Rhodotorula sp. (MOLINARO 
et al., 2009, p. 406). 
Portanto, dentro desse filo estão os fungos conhecidos popularmente como 
cogumelos e orelhas de pau, outros, chamados de fungos gelatinosos, gasteromicetos, 
ferrugens e carvões, e ainda espécies unicelulares. Na maioria, são fungos terrestres, 
existindo também muitas espécies parasitas (ferrugens), e, ainda, espécies que se formam 
de forma liquenizada. Estão por toda parte e são facilmente vistos em bosques, na 
natureza, em gramados e locais com umidade, devido ao fato de possuírem um 
considerável tamanho (SILVA; COELHO, 2009, p. 14). 
2.8 Fungos Anamórficos 
Os fungos desse grupo estão relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota 
e. por esse motivo, não foram classificados como um filo específico, pois possui 
sequências gênicas comparadas com esses dois. São cosmopolitas, saprófitos e parasitam 
especialmente animais e plantas. Os exemplos mais comuns são Aspergillus sp e 
Penicillium sp (MOLINARO et al., 2009, p. 406). 
 
 
3 Drogas Antifúngicas 
Cada vez mais as ciências biomédicas buscam novos tipos de fármacos 
antifúngicos, buscando atender as demandas cada vez maiores da micologia médica. As 
drogas antifúngicas surgiram muito depois das drogas antibacterianas, uma vez que os 
fungos, ao contrário das bactérias, são eucarióticos. Esse fato faz com quem terapias 
antifúngicas levem à efeitos colaterais e dificulte os estudos de novos possíveis fármacos 
(SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 50). 
O primeiro composto utilizado como antifúngico foi o iodeto de potássio. Esse 
composto químico, por mais que a micologia tenha se desenvolvido nos últimos anos, 
continua sendo a primeira escolha para tratamento de esporotricose ((SIDRIM; ROCHA, 
2004, p. 50). 
No início da década de 1950, a nistatina tomou importância para tratar infecções 
causadas por leveduras, como aquelas relacionadas com Candida spp.e ela é muito 
utilizada até hoje para tratar infecções de pele e mucosas em geral. Em 1956, surgiu a 
anfotericina B e assim as micoses tiveram um grande avanço no que tange à possibilidade 
de tratamento, uma vez que fora somente essa droga capaz de terminar com as infecções 
fúngicas mais profundas (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 50). 
O grande “boom” da micologia no que tange ao descobrimento de novas drogas 
antifúngicas fora a partir de 1965, com o benzimidazol e a partir dele, novos compostos 
conhecidos como miconazol, cotrimazol, econazol, isoconazol, ticonazol, cetoconazol, 
oxioconazol. E anos depois, da década de 1990, com derivados desses compostos, como 
fluconazol, itraconazol, voriconazol, ravuconazol e entre outros. 
Em resumo, as drogas antifúngicas podem ser divididas em duas categorias 
principais: Agentes originados de micro-organismos (a nistatina e anfotericina B) 
Agentes químicos (o iodeto de potássio, derivados azólicos, alilaminas, derivados 
morfolínicos e equinocandinas). 
 
4 Laboratório de micologia 
De acordo com Sidrim e Rocha (2004, p. 63), as atividades dentro de um 
laboratório que atua com micologia devem seguir metodologias clássicas e seguir 
exigências prévias. A colheitas de materiais clínicos é a primeira etapa do diagnóstico 
laboratorial e deve ser feita de maneira mais correta possível, uma vez que se não for feita 
com cuidado e com técnica, pode inutilizar o material e prejudicar as análises posteriores. 
Deve-se sempre questionar o paciente se ele se encontra em utilização de 
medicação antifúngica e, caso ele esteja utilizando, deve ser suspenso por um período de 
15 dias antes da colheita, se for de uso tópico, e por 1 mês, quando se tratar de drogas de 
uso sistêmico (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 63). 
É importante ressaltar que todo material coletado deve estar acompanhado de uma 
ficha padrão, contendo todos os dados pessoais do paciente, bem como os dados clínicos 
e epidemiológicos. Normalmente, as análises devem seguir no máximo em 2 horas 
depois, porém, quando não puder ser realizado nesse período de tempo, elas podem ser 
acondicionadas em refrigerador por até 24 horas, exceto em caso de zigomicose. 
 
4.1 COLETA DE ESCAMAS DE PELE 
Primeiramente deve-se realizar uma análise visual da lesão e, posteriormente, a 
assepsia com álcool isopropílico 70%. A seguir, com auxílio de uma cureta dermatológica 
ou lâmina de bisturi, deve-se raspar vigorosamente as bordas das lesões cutâneas ativas 
distribuídas pelo corpo. Esse material deve ser acondicionado em uma placa de Petri 
estéreis (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 63). 
 
4.2 COLETA DE PELOS E CABELOS 
Normalmente, quando se coleta cabelos, desconfia-se de dermatofitose do couro 
cabeludo. Para isso, deve-se coletar pelos e cabelos que tenham probabilidade de estarem 
infectados, otimizando o processo de isolamento de fungos dermatófitos e esses pelos 
encontram-se nas regiões de alopecia (áreas de rarefação de pelos). Sendo assim, eles 
devem ser retirados por arrancamentos com auxílio de uma pinça flambada (SIDRIM; 
ROCHA, 2004, p. 65). 
 
4.3 COLETA DE UNHAS 
Para colheita de material das unhas, deve-se sempre possuir como material 
tesouras de várias dimensões, limas, alicates de unhas e diversas curetas dermatológicas. 
Quando coletas, deve-se sempre procurar retirar material da região de progressão e 
confluência do tecido doente (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 65). 
 
4.4 COLETA DE MUCOSAS, ORIFÍCIOS NATURAIS E SECREÇÕES 
DIVERSAS 
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 66), sempre que se coletar esse tipo de material, 
utiliza-se swab estéril e deve-se coletar, no mínimo, duas amostras de cada lesão. Caso 
não puder levar o material direto para o laboratório, deve-se acondicionar o swab em 
solução salina e mantê-los refrigerados por no máximo 24 horas. 
No caso de lesões na boca, deve-se realizar uma raspagem ou biópsia da lesão 
com cureta dermatológica. No caso de lesões na vagina, coletam-se dois swabs, um para 
confeccionar lâmina histológica e outro para cultura microbiológica. 
 
4.5 COLETA DE SANGUE PERIFÉRICO E MEDULA ÓSSEA 
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 66), a metodologia é a mesma preconizada para 
hemocultura bacteriana, ou seja, realiza-se assepsia na região, coleta-se de 5 a 10 ml de 
sangue e precede-se com as recomendações do meio de cultura utilizado. Para análise de 
fungos no sangue, existem atualmente muitos sistemas automatizados, como o ESP 
(Difco), o BacT/Alert (Organon Teknika), o BACTEC e o BACTEC NR. 
 
4.6 COLETA DE PUS E LÍQUIDOS PATOLÓGICOS 
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 68), esse tipo de coleta deve ser feito de forma 
mais limpa possível, ou seja, mas asséptica possível. De preferência, deve-se obter por 
punção de abcessos não abertos após realizar processo de assepsia com álcool 70% ou 
álcool iodado. Nesse tipo de coleta, entram os líquidos pleural, sinovial, ascítico, os quais 
devem ser processados imediatamente. 
 
4.7 COLETA DE URINA 
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 67), a metodologia é a mesma preconizada 
normalmente para coleta de urina, porém deve-se ter cuidadosa degermação da região 
geniturinária externa com água e sabão neutro antes. 
 
5 Diagnóstico laboratorial de fungos 
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 69), existem principalmente duas etapas no 
diagnóstico laboratorial fúngico, a microscopia e a cultura. 
5.1 Exame direto: Microscopia 
A microscopia é a primeira etapa do diagnóstico laboratorial micológica, sendo 
ela considerada o exame direto nesse caso. Essa primeira etapa vai nos dizer se o material 
coletado possui ou não estruturas fúngicas e vai possibilitar uma análise prévia do tipo de 
fungo que estamos lidando (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 69). 
São elas preparações montadas entre lâminas e lamínulas, imersas em alguma 
substância que facilite a sua visualização microscópica, como compostos químicos como 
hidróxido de potássio (KOH), hidróxido de sódio (NAOH), tinta da China ou K-tinta. 
A coloração é muito utilizada nos laboratórios de Micologia para visualização das 
estruturas vegetativas e reprodutivas dos fungos, as formas de leveduras, e realizar testes 
de viabilidade. 
Para análise de escamas de pele, pelos, cabelos e unhas colocam-se de 1 a 2 gotas 
de solução clarificante (hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio a 40% ou K-tinta) e, 
sobre estas, algumas escamas ou pelos/cabelos, ou ainda os fragmentos de unhas. Cobre-
se com lamínulas e deve-se aguardar um período de 5 a 20 minutos. Em seguida, deve-se 
analisar o material em microscópio óptico com objetiva de 40x (SIDRIM; ROCHA, 2004, 
p. 69). 
Para análise de mucosas, oríficos naturais e secreções diversas, como a coleta fora 
realizada com dois swabs, somente um é utilizado para preparação da lâmina. Realiza-se 
um esfregaço, que será corado pela prata-metenamina e outra lâmina com KOH. O 
segundo swab é utilizado para realização da cultura (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 70). 
No caso de análise de escarro, pus e líquidos patológicos são preparadas três 
lâminas, uma do tipo lâmina-lamínula com KOH e as outras com esfregaços para ser 
corado com prata-metenamina e outro pela Giemsa. 
 
5.2 Exame microscópico com hidróxido de potássio (KOH) 
Realizar técnicas de microscopia com hidróxido de potássio é indicado para pelos, 
pele, unha, tecido obtido por biópsia, exsudatos espessos e outros materiais densos. Deve-
se adicionar uma gota de KOH (aquoso a 20%) em uma lâmina de microscopia e sobre 
esta, uma pequena porção da amostra a ser analisada. Deve-se imediatamente cobrir a 
preparação com uma lamínula e, para intensificar a clarificação, pode-se aquecer 
ligeiramente, sobre a chama de um bico de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examina-
se a preparação após aproximadamente 20 minutos, em microscópio óptico comum, 
inicialmente, com objetiva de 10x, seguida de 40x (ANVISA, 2016, p. 7). 
 
5.3 Exame microscópico com Tinta Nanquim (Tinta da China) 
Segundo a Anvisa(2016, p. 7) essa técnica é usada em amostras de líquor, urina, 
secreções ou exsudatos, para visualização de leveduras capsuladas do gênero 
Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra o fundo negro, proporcionado pela 
tinta. Para realização da técnica, deve-se adicionar uma gota de tinta nanquim e uma gota 
do sedimento da amostra centrifugada sobre uma lâmina. Após, deve-se cobrir a 
preparação com lamínula e observar ao microscópio óptico (objetivas de 10x e 40 x). 
Diferencia-se os tipos celulares pela refringência da parede celular e das inclusões 
no citoplasma das leveduras, em relação aos linfócitos, além da presença de brotamentos. 
 
5.4 Exame microscópico com Coloração pelo Método de Gram 
Segundo a Anvisa (2016, p. 7), como todos os fungos são caracterizados por serem 
gram-positivos, utiliza-se esse tipo de técnica não para diferenciar os organismos, mas, 
sim, para discriminar elementos fúngicos de artefatos existentes em urina, secreções e 
fezes. A amostra deve ser homogeinezada, em movimentos circulares, em uma lâmina de 
microscopia, fixada com calor e submetida à coloração. 
 
5.5 Exame microscópico com Coloração Panótica (Giemsa, Leishman ou Wright) 
Segundo a Anvisa (2016, p. 7), esse tipo de técnica é escolhida para pesquisa de 
Histoplasma capsulatum em diferentes amostras biológicas: medula óssea, sangue, 
aspirados e secreção cutânea. Nestes casos, deve-se fazer um esfregaço semelhante ao 
usado para coloração de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o método 
escolhido. 
 
6 Exame indireto: Cultura celular 
Após o exame direto, a cultura é extremamente necessária para a possibilidade de 
se isolar e identificar corretamente o fungo que estamos lidando. Assim sendo, as 
amostras devem ser semeadas em diversos meios de isolamento, sendo eles escolhidos de 
acordo com os achados micológicos do exame direto ou das preparações coradas e, 
também, pelo caso clínico da pessoa ou animal. 
 
Os meios de cultura utilizados na micologia são preparações que devem conter as 
fontes nutricionais necessárias para o crescimento e multiplicação dos organismos. 
Cultivar micro-organismos dentro de uma placa de Petri pode ter diferentes finalidades, 
mas é importante saber que todo meio de cultura deve suprir as necessidades mínimas 
para que in vitro se consiga um ambiente parecido ao que se encontrava o organismo na 
natureza (MOLINARO et al., 2009, p. 425). Os meios de cultura mais utilizados na 
micologia são o Ágar Sabouraud dextrose (ASD), o Ágar Batata Dextrose, o Ágar 
Mycosel, o Ágar BHI (ágar infusão de cérebro e coração), Ágar extrato de malte (MEA). 
Segundo a Anvisa (2016, p. 8), a amostra, após o processo de exame direto pode 
ser usada para isolamento do agente etiológico fúngico. Para isso, deverá ser semeada em 
movimentos de estrias (movimentos de “zig-zag”) sobre a superfície de meios sólidos de 
cultura, seja em tubos de ensaio ou ainda em placas de Petri, de acordo com o método de 
escolha. 
De acordo ainda com a Anvisa (2016, p.9), esses meios de culturas, para que se 
possa isolar primariamente os fungos a partir de amostras biológicas, podem ser 
adquiridos prontos ou ainda podem ser produzidos no próprio laboratório, seguindo a 
recomendação dos fabricantes. Quando comprados comercialmente, eles vêm 
desidratados e devem sofrer processo de hidratação, conforme instruções do fabricante, 
e, assim, o meio deve ser distribuído, de preferência, em tubos ou placas de Petri e 
esterilizados por autoclavação. 
Quando estamos falando de solidificar um tubo contendo ágar, recomenda-se 
deixar o mesmo inclinado, deixando espaço de 3 cm do final do meio até a tampa, para 
evitar contaminação via meio externo. E quando necessitarmos isolar um fungo a partir 
de alguma amostra biológica dentro do laboratório? Para isso, devem ser utilizados meios 
não seletivos, que permitam crescimento de fungos patogênicos e bolores de crescimento 
rápido, ou seja, fungos que crescem em menos de 7 dias. Esse isolamento é muito 
importante para diagnóstico laboratorial das infecções ditas oportunísticas (ANVISA, 
2016, p. 9). 
O meio dito básico em um laboratório de micologia é o ágar Sabouraud dextrose 
(ASD), conhecido de ágar Sabouraud. Na maioria das vezes, deve-se adicionar um 
antibiótico para impedir o crescimento de bactérias que prejudicariam o isolamento 
fúngico (ANVISA, 2016, p. 9). 
 
7 Identificação de fungos 
O profissional responsável por analisar os exames micológicos deve tentar 
identificar todas as culturas positivas e emitir o resultado mais correto possível. Na 
maioria das vezes, o exame microscópico direto da amostra é suficiente para medidas de 
controle da infecção, entretanto, outras vezes, o isolamento por meio de cultura e 
identificação do fungo são imprescindíveis para orientar a conduta clínica. 
Essa identificação dos fungos deve contemplar o gênero e a espécie. Porém, em 
alguns casos, devido à complexidade do exame, não é possível dizer exatamente qual 
gênero e espécie é aquele fungo, assim nesses casos somente fala-se o grupo dos fungos 
(ANVISA, 2016, p. 12). 
 
7.1 Identificação de fungos filamentosos 
Segundo a Anvisa (2016, p.16), a identificação de fungos filamentosos baseia-se 
fundamentalmente na observação da morfologia da colônia e aspectos microscópicos. A 
análise da colônia objetiva observar: a cor, textura, superfície, pigmento difusível no meio 
de cultura, entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura primária do 
fungo. Porém, o mais correto de se fazer é analisar o chamamos de “colônia gigante”, ou 
seja, uma cultura feita no ponto central de uma camada de ágar distribuído em placa de 
Petri. A velocidade de crescimento, que pode ser rápida (menor que 7 dias), intermediária 
(de 8 a 14 dias) ou lenta (maior que 15 dias) é fundamental para que se possa identificar 
presuntivamente o fungo. 
Mas como sabemos que se trata de um fungo filamentoso? Normalmente, ao 
observar microscopicamente, somente ao observar estruturas típicas, como hifas hialina 
ou demácia, septada ou cenocítica, forma, disposição e formação de esporos já são 
suficientes para podermos concluir que estamos diante de um fungo filamentoso 
(ANVISA, 2016, p. 12). 
Segundo Almeida (2011, p. 27) uma possibilidade é a técnica de esgarçamento, a 
qual é sempre utilizada como primeira tentativa, por ser mais rápida para identificar as 
colônias filamentosas. As estruturas fúngicas são quebradas, porém isso torna mais difícil 
a identificação. 
Outra possibilidade de identificação é a de micro cultivo em lâmina. No micro 
cultivo em lâmina, as estruturas permanecem íntegras além de ser utilizado um meio de 
cultura (ágar batata ou ágar ASD), os quais estimulam a produção de macro e 
microconídeos, que na maioria das vezes identificam o fungo (ANVISA, 2016, p. 16; 
ALMEIDA, 2011, p. 27-30). 
 
7.2 Identificação de fungos dimórficos 
Fungos dimórficos são aqueles fungos filamentosos que podem, em algumas 
situações, assumir forma de levedura. Nessa forma, eles diminuem sua capacidade de 
filamentação e dividem-se por brotamento e, assim, suas colônias ficam com aspecto 
cremoso (ANVISA, 2016, p. 18). 
Este tipo fúngico vai ocorrer normalmente sob temperatura acima de 30°C, 
preferencialmente à 37°C. São fungos de crescimento lento, na maioria das vezes mais 
de 15 dias, no primo-isolamento (Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides 
brasiliensis ou moderado (8 a 14 dias), como Sporothrix schenckii. Para que possamos 
identificar esses fungos, devemos comprovar por meio da visualização do e comprovação 
do dimorfismo e pelo aspecto microscópico característico de cada fase (ANVISA, 2016, 
p. 19). 
 
7.3 Identificação de leveduras 
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 89), em pessoas saudáveis, sabe-se que existe 
uma população de leveduras em pleno equilíbrio que fazem parte da flora microbiana 
normal do organismo. Seu número vai variarde acordo com o local, mas sempre vai estar 
em estado de equilíbrio sem causar-lhe dano. Isso quando está tudo certo com o estado 
imunológico. Porém, quando estamos com nossas defesas imunológicas descompensadas, 
esse número pode variar e elas podem colonizar um local anatômico, gerando infecções 
e problemas mais graves, levando a doenças geradas pelas leveduras, como é o caso por 
exemplo da candidíase, ocasionada pela Candida spp. 
Ao contrário dos fungos filamentosos, a estrutura morfológica das leveduras não 
apresenta muita diversidade e, portanto, nem sempre é um parâmetro suficiente para sua 
identificação. Em determinadas situações, no entanto, a identificação rápida, simples e 
presuntiva pode ser feita, e isso vai contribuir significativamente para o diagnóstico da 
infecção que acometeu o paciente (ANVISA, 2016, p. 12). 
Deste modo, ao observarmos a levedura pelo microscópio e visualizarmos hifas 
hialinas e ramificadas, é sugestivo do gênero Candida sp e se, além disso, desenvolver 
clamidósporos, que são células de reserva, ou tubos germinativos, em determinadas 
condições “in vitro”, é identificada como Candida albicans. Outros gêneros como 
Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporo, podem ser identificados apenas 
visualizando sua morfologia característica (ANVISA, 2016, p. 12). 
As outras espécies e gêneros, por sua vez, necessitam de outras análises, como 
provas bioquímicas para identificação. No entanto, do ponto de vista clínico, na maioria 
das vezes não se necessita saber acuradamente o tipo da levedura. No caso, essa 
identificação pode ter interesse epidemiológico. Já quando falamos de leveduras 
relacionadas a episódios de infecção hospitalar, há muita preocupação e necessidade de 
saber qual espécie estamos lidando (ANVISA, 2016, p. 12). 
Mas então, como analisar leveduras? Deve-se realizar plaqueamento de cada 
colônia morfologicamente diferente e pura. De cada colônia se faz um repique em ágar 
ASF para posterior identificação. Importante ponto aqui é que somente podem ser 
utilizadas colônias de leveduras obtidas de amostras biológicas, quando estas encontram-
se puras, ou seja, sem contaminação por bactérias ou outras espécies (ANVISA, 2016, p. 
12). 
 
7.4 Identificação de Candida albicans e Candida sp. 
Segundo a Anvisa (2016, p. 13), as provas fisiológicas realizadas que são mais 
comuns e simples para identificar esse tipo de levedura são: tubo germinativo e 
filamentação em cultivo em lâmina. No cultivo em lâmina, avalia-se a capacidade de 
produção de hifas hialinas ramificadas, que podem se fragmentar em esporos, 
denominados artroconídios. Estas hifas ocorrem nos gêneros Geotrichum e Trichosporon. 
Ao analisar, caso a levedura forme essas hifas hialinas ramificadas sem fragmentação, 
provavelmente vai pertencer ao gênero Candida e se houver formação de clamidósporos 
característicos, vamos poder dizer que é Candida albicans. 
 
7.5 Identificação de Cryptococcus 
Para identificar esse tipo de levedura, normalmente utiliza-se a pesquisa de 
cápsula, a qual é uma característica marcante do gênero Cryptococcus. Essa técnica é 
realizada com uma gota de tinta nanquim e uma alçada da cultura. A cápsula, constituída 
de material polissacarídeo, aparece como um halo claro ao redor dos blastoconídios de 
Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lâmina (ANVISA, 2016, p. 13). Além 
disso, ainda segundo a Anvisa (2016, p. 13), a prova positiva no teste da Urease é outra 
possibilidade de confirmação de Cryptococcus. 
Segundo Almeida (2011, p. 30), o teste do tubo germinativo é uma prova que vai 
caracterizar rapidamente a levedura da espécie Candida albicans. A técnica é bem simples 
e é basicamente necessário semear um pequeno inóculo dessa levedura em soro, o qual 
pode ser de várias espécies animais. Os soros recomendados são o humano, o fetal bovino 
ou de cavalo ou albumina de ovo. 
A técnica de micro cultivo de leveduras baseia-se no princípio de que elas quando 
incubadas em meio contendo o detergente “Tween-80”, podem apresentar a capacidade 
de filamentar-se, formando pseudo-hifas e/ou hifas verdadeiras. E isso faz com que, por 
essas características específicas filamentosas, possa-se sugerir a espécie da levedura 
(ALMEIDA, 2011, p. 31). 
A técnica de auxanograma (assimilação de carboidratos e nitrogênio), baseia-se, 
primeiramente, em avaliar a capacidade que as leveduras possuem de utilizar um 
carboidrato como única fonte de carbono. Assim, utiliza-se um meio basal sem carbono, 
onde a levedura será semeada. Após a semeadura, adiciona-se um carboidrato e observa-
se a capacidade de utilização da fonte de carbono adicionada. Quando esse carboidrato é 
assimilado pela levedura, há crescimento desta ao redor da fonte de carbono (ALMEIDA, 
2011, p. 34). 
 
Além da capacidade de assimilar carboidratos, analisa-se também a capacidade de 
assimilar fonte de nitrogênio. Demonstrando a capacidade que algumas leveduras 
possuem de assimilar nitrato de potássio (nitrogênio inorgânico) como uma única fonte 
de nitrogênio na sua viabilidade biológica (ALMEIDA, 2011, p. 35). 
 
ALMEIDA, S. R. de. Apostila de micologia clínica. Faculdade Ciências Farmacêuticas, 
São Paulo. 2011. 
ANVISA. Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Módulo VII 
2016. 
MOLINARO, E. M. et al. Conceitos e métodos para a formação de profissionais em 
laboratórios de saúde, v. 4. 2009. 
SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos. 
Guanabara Koogan, 2004. 
SILVA, R. R.; Coelho, G. D. Fungos: Principais grupos e aplicações biotecnológicas. São 
Paulo, 2006. 
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. Microbiologia. 967 p. 
2012.