Citoquímica - LAB. DE BIOLOGIA CELULAR - BIO 112

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PRÁTICA 03 - CITOQUÍMICA 
 
INTRODUÇÃO 
 
 A constituição química e a localização dos componentes celulares podem ser 
estudadas mediante técnicas especiais de coloração, denominadas técnicas 
citoquímicas. Nessas técnicas, a reação entre certos tipos de substâncias e os 
componentes celulares resulta em produtos detectáveis ao microscópio. 
 Para que uma determinada técnica de coloração tenha valor citoquímico é 
necessário que: 1) a substância a ser identificada esteja imobilizada em sua localização 
original na célula, 2) o produto da reação seja insolúvel e colorido (ou eletrondenso) e 
3) a reação seja específica para uma determinada substância ou grupamento químico. 
 
A. REAÇÃO DE FEULGEN 
 
 É a reação mais conhecida e utilizada para determinações qualitativas e 
quantitativas de DNA in situ. Ela se baseia na exposição de grupamentos aldeídos 
na molécula de DNA, como resultado de uma hidrólise ácida. Em seguida, o DNA é 
evidenciado pelo tratamento com o reativo de Schiff. Antes da montagem da lâmina, 
o material é tratado com água sulfurosa para retirar o excesso de corante. 
 O Reativo de Schiff é uma solução praticamente incolor, preparada a partir 
da fucsina básica. A fucsina básica é uma mistura de corantes de cor vermelha que, sob 
a ação do anidrido sulfuroso (HSO3-), tem o seu grupamento cromofórico alterado, 
originando assim um leucoderivado (leuco = branco) com afinidade por grupos aldeídos 
(-CHO). 
 A hidrólise ácida, geralmente com HCl, tem como principais funções 
desnaturar o DNA e remover suas bases púricas e parte das proteínas associadas. A 
remoção das bases púricas resulta na formação de grupamentos aldeídos nas 
desoxirriboses anteriormente ligadas às purinas. A segunda etapa se caracteriza pela 
reação dos grupamentos aldeídos com o reativo de Schiff. Essa reação restaura 
os grupos cromofóricos das moléculas do corante, resultando num produto de cor 
vermelho-violeta. 
 As bases púricas do RNA também são removidas pela hidrólise ácida, porém, 
as riboses não formam radicais aldeídos, de modo que o RNA é Feulgen-negativo. Além 
disso, dada à sua constituição química, o RNA é pouco resistente à hidrólise ácida, 
sendo degradado nesta etapa da reação. 
 
B. REAÇÃO DE PAS (Periodic Acid Schiff) 
 
 Esta reação é usada para identificar açúcares neutros (polímeros, não vai 
funcionar em carboidratos soltos), envolvendo duas etapas. Na primeira, o 
polissacarídeo neutro é submetido a uma oxidação pelo ácido periódico (HIO4). O 
ácido periódico oxida os grupos glicólicos (-OH) ligados a carbonos vizinhos, produzindo 
radicais aldeídos (Figura 1). A segunda etapa é caracterizada pela reação dos radicais 
aldeídicos com o reativo de Schiff que terá reconstituído o seu grupamento 
cromofórico, formando um produto insolúvel e de cor vermelho-violeta. 
 Em células animais, a reação do PAS é utilizada para a detecção de glicogênio, 
de glicoproteínas e de proteoglicanos (proteínas associadas a cadeias de carboidratos 
neutros). Em células vegetais esta reação é positiva para o amido, celulose, 
hemicelulose e pectinas. 
 Como vários carboidratos respondem positivamente ao PAS, devem ser 
aplicados testes controle que permitam a identificação inequívoca do polissacarídeo 
pesquisado. Esses testes são feitos extraindo-se enzimaticamente o polissacarídeo de 
interesse, tendo-se, dessa maneira, um controle negativo. 
 
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Por exemplo, a distinção entre o glicogênio e as glicoproteínas existentes nas células 
animais é feita tratando o material previamente com amilase (enzima que digere 
glicogênio e amido). 
Assim, aquelas estruturas que, em relação a um grupo controle, perdem a coloração são 
consideradas como contendo glicogênio, enquanto as outras que permanecem coloridas 
devem conter glicoproteínas. 
 
 
 
Figura 1. Esquema da reação do ácido periódico com a glicose de um polissacarídeo neutro. Sendo: A, 
os grupamentos glicólicos vizinhos; B, o ácido periódico e C, os radicais aldeídos formados a partir da 
oxidação dos grupos glicólicos vizinhos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C. COLORAÇÃO DIFERENCIAL 
 
 Como os diversos componentes celulares podem apresentar diferentes 
afinidades por diferentes tipos de corantes, pode-se empregar mais de um corante 
em um único procedimento de coloração. Quando se utiliza um corante específico 
para determinada estrutura celular, faz-se uma “coloração diferencial”. A coloração 
diferencial é uma técnica citoquímica para um determinado componente celular. Um 
exemplo deste tipo de coloração pode ser observado em preparado de fígado, no qual 
os grânulos de glicogênio (citoplasmáticos) são corados pelo PAS (coloração 
diferencial). 
 
1. OBJETIVOS 
 
- Identificar o DNA das células a partir das reação de Feulgen. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. ATIVIDADE PRÁTICA 
 
2.1. Esmagamento de ponta de raiz de cebola (Allium cepa) e coloração pela 
reação de Feulgen. 
 
2.1.1. Obtenção de raízes 
 
- Colocar os bulbos de cebola em frascos escuros de boca larga contendo água, durante 
2 dias, até a obtenção de raízes de cerca de 1,0 - 1,5 cm. 
- Coletar as raízes e fixá-las em etanol-ácido acético na proporção de 3:1, por 2 a 24 
horas. 
- Conservar as raízes fixadas em etanol 70% em geladeira. 
 
2.1.2. Reação de Feulgen 
 
- Lavar as raízes em água destilada (três banhos de 1 minuto cada). 
- Transferir uma raiz diretamente para o reativo de Schiff 
- Fazer a hidrólise utilizando HCl 5 M à temperatura ambiente, durante 25 minutos. Com 
a finalidade de interromper a hidrólise, lavar novamente as raízes em água destilada, 
por 3 vezes. 
- Transferir as raízes para o reativo de Schiff, deixando-as por 30 minutos na ausência 
de luz. 
- Lavar as raízes em água sulfurosa recém preparada. Separar a extremidade da raiz 
mais intensamente corada (meristema) e transferi-la para uma lâmina. Pingar sobre as 
raízes uma gota de ácido acético a 45%. Esmagar as raízes com uma lamínula, batendo 
levemente com a ponta do lápis/pinça (use a extremidade oposta da ponta) na superfície 
da lamínula para espalhar o material. 
 
2.2. Identificação de DNA - reação de Feulgen 
 
- Interprete as imagens obtidas por esmagamento de pontas de raiz de cebola 
submetidas à reação de Feulgen. 
- Note que com procedimento de esmagamento, as células que compõem o tecido 
espalham-se, sendo observadas isoladamente. No material submetido à reação de 
Feulgen, apenas o núcleo e os cromossomos das células em divisão mostram-se 
intensamente corados. Os nucléolos são vistos como regiões claras (não coradas) no 
núcleo. O citoplasma não é evidenciado. 
 
- Após a observação, responda: 
 
a. Qual é o componente químico da célula responsável por essa coloração? 
 
O DNA, ácido desoxirribonucleico. 
 
b. Descreva o mecanismo da reação de Feulgen. 
 
Hidrólise ácida para exposição de grupos aldeídos e reação desses grupos com o reativo 
de Schiff, o que resulta em um produto insolúvel colorido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2.3. Identificação de glicogênio (Polissacarídeo neutro) - Reação de PAS. 
Corte histológico de fígado (hepatócitos) de rato corado por PAS e 
hematoxilina 
 
- Analise o corte de fígado submetido à reação de PAS, dependendo da imagem, o corte 
pode estar contracorado com hematoxilina. O glicogênio é uma substância de reserva 
animal e encontra-se distribuído pelo citoplasma das células hepáticas na forma de 
grânulos. 
 
- Após a observação, responda: 
 
a. Qual é o aspecto da coloração apresentada pelo citoplasma? 
 
Rosa granular, coloração heterogênea 
 
b. Descreva o mecanismo da Reação de PAS. 
 
Oxidação pelo ácido periódico para exposição do grupo aldeído e reação dos radicais 
aldeídicos com o reativo de Schiff, o que resulta em um produto colorido. 
 
c. O que deveria ocorrer com os hepatócitos se antes da reação de PAS eles fossem 
tratados com a enzima amilase? 
 
Não haveria coloração, porque o glicogênio é degradado em monômeros de glicose e 
não sofrem oxiadação. 
 
d. Qual é a diferença básica entreos procedimentos das reações de Feulgen e de 
PAS? 
 
A forma como o grupo aldeído é exposto/utilização dos ácidos diferentes. 
 
e. Por que o reativo de Schiff pode ser empregado para a identificação de ambos, DNA 
e polissacarídeo neutro? 
 
Porque em ambas reações foram expostos grupos aldeídos, que é o grupo que interage 
com o reativo de Schiff. 
 
 
f. Explique por que a reação de PAS é uma técnica citoquímica. 
 
1) a substância a ser identificada esteja imobilizada em sua localização original na 
célula, 2) o produto da reação seja insolúvel e colorido (ou eletrondenso) e 3) a reação 
seja específica para uma determinada substância ou grupamento químico. 
 
g. Qual é a finalidade do emprego da hematoxilina após a reação de PAS? 
 
Contrastar núcleo e citoplasma. A hematoxilina é um corante básico e vai corar grupos 
ácidos. A hematoxilina colore o núcleo.