3- Aula Prática - Coloração de Gram

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Aula Prática de Coloração de Gram 
 
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INTRODUÇÃO 
Desde o trabalho original de Hans Gram, vários pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, 
determinar o mecanismo envolvido no método de coloração. Conceitos diversos têm sido 
apresentados, tais como: 
i) A existência de um substrato Gram-positivo e específico; 
ii) As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam diferentes afinidades com o 
corante primário cristal de violeta; 
iii) A existência de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos 
Gram-positivos e Gram-negativos. Este último é o mais aceito atualmente. Tanto a 
espessura da parede celular, quanto as dimensões dos espaços intersticiais, por 
exemplo, diâmetro do poro , parecem ser determinantes do resultado final da 
coloração de Gram. 
Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares são cobertas pela violeta-de-metila, 
todas se coram em roxo. Com a adição do lugol, também chamado de mordente, ocorre a 
formação do completo iodo-pararosanilina. Esta reação tem a propriedade de fixar o corante 
primário nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando 
se aplica um agente descorante, como álcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais 
lentamente ou não perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas. 
Escherichia coli (Gram Negativa) e o Staphylococcus Aureus (Gram Positivo). 
A Escherichia coli (E. coli) assume a forma de um bacilo e pertence à família das 
Enterobacteriaceae. São aeróbias e anaeróbias facultativas. O seu habitat natural é o lúmen 
intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue quente. Possui múltiplos flagelos 
dispostos em volta da célula. A E. coli é um dos poucos seres vivos capaz de produzir todos os 
componentes de que é feita, a partir de compostos básicos e fontes de energia suficientes. Ela 
é lactase positiva, uma enzima fermentadora de açucares que é grandemente responsável pela 
flatulência de cada pessoa, especialmente após o consumo de leite e seus derivados. 
Possuem fímbrias ou adesinas que permitem a sua fixação, impedindo o arrastamento pela 
urina ou diarréia. Muitas produzem exotoxinas. São susceptíveis aos ambientes secos, aos 
quais não resistem. Possuem lipopolissacarídeo (LPS), como todas as bactérias Gram-
negativas. Esta molécula externa ativa o sistema imunitário de forma desproporcionada e a 
vaso dilatação excessiva provocada pelas citosinas produzidas pode levar ao choque séptico e 
morte em casos de septicémia. Na E. coli, o genoma tem quase 5 milhões de pares de bases e 
vários milhares de genes codificando mais de 4000 proteínas (o genoma humano tem 3 mil 
milhões de pares de bases e cerca de 27.000 proteínas). 
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Staphylococcus aureus, também conhecido como estafilococo dourado, é uma espécie de 
estafilococo coagulase-positivos. É uma das espécies patogênicas mais comuns, juntamente 
com a Escherichia coli. É a mais virulenta espécie do seu gênero. Têm forma esférica (são 
cocos), cerca de 1 micrometro de diâmetro, e formam grupos com aspecto de cachos de uvas 
com cor amarelada, devido à produção de carotenóides, sendo daí o nome de "estafilococo 
dourado". Cresce bem em ambientes salinos. Cerca de 15% dos indivíduos são portadores de 
S. aureus, na pele ou nasofaringe. A infecção é freqüentemente causada por pequenos cortes 
na pele. 
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias que consiste no tratamento 
sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, 
etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas 
em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das 
amostras analisadas. O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes 
celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante 
um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-
negativas não o fazem. 
Procedimento: 
1- Confeccionar o esfregaço; 
2- Corar com violeta de cristal por 60 segundos; 
3- Lavar com esguicho de água destilada; 
4- Cobrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos; 
5- Lavar com esguicho de água destilada; 
6- Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos; 
7- Lavar com esguicho de água destilada; 
8- Corar com safranina por 60 segundos; 
9- Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio. Resultados: Gram (+) 
coram de roxo, gram (-) coram de rosa. A lavagem com álcool 99,5º GL dissolve o 
complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permeável a este, arrasta-o para 
fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa do 1º corante, o 
violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a 
diferenciação com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, 
designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas 
nas bactérias Gram-negativas. Nesta etapa de diferenciação, as bactérias gram-
positivas coram-se de roxo e as bactérias gram-negativas descoram-se por 
possuírem uma parede celular menos espessa em relação à parede das gram-
positivas. 
 
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METODOLOGIA 
• Bico de Bulsen, 
• Alça de Platina; 
• Tubos de Ensaio; 
• Algodão; 
• Estante para tubo de ensaio; 
• Conta-gotas; 
• Placa de Patrick; 
• Hagar Chocolate; 
• Microscópio Ótico 
• Lamina 
• Lamínula 
• Cristal Violeta 
• Lugol 
• Fucsina 
Métodos 
Com todos os materiais sobre a bancada inicia-se pelo processo de esterilização da alça de 
platina sobre o bico de bulsen, para esterilizá-la deve-se segura-la da mesma forma como se 
segura uma caneta, e rodá-la em cima do bico de bulsen para que o fogo percorra toda sua 
extensão, depois deve-se incliná-la aproximadamente 45º e esperar que ela fique 
incandescente; após a esterilização a alça de platina deve ficar apoiada no bico de bulsen para 
que ela não saia da área de proteção do mesmo. 
Tudo que for pego com a mão direita ou esquerda deve-se permanecer neste mesmo lado, 
visto que a troca de objetos de uma mão para a outra pode ocasionar acidentes devido ao risco 
que o bico de bulsen apresenta por se tratar de um emissor de chama. 
Manuseando na área de segurança, pega-se o tubo de ensaio, retira-se o algodão que esta 
tampando-o e com um conta gotas coleta-se a salina que está no tubo; esta salina deve ser 
pingada (uma gota) na lâmina que vai ao microscópio; no final deste procedimento deve-se 
passar o tubo de ensaio no bico de bulsen e tampá-lo novamente com algodão. 
Segurando de maneira leve a alça de platina, deve se abrir a placa de Patrick e esfregar a alça 
nela superficialmente para que possa ser retirada uma finíssima camada de microrganismos 
que ali cresceram; tampa-se novamente a placa e realiza-se um esfregaço desta camada na 
lâmina que contem a salina. 
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Com o bico de bulsen aceso, e com um prendedor segurando a lamina, realiza-se a secagem 
da placa de maneira lenta, sem que ela corra risco de estourar. 
Após a secagem foi realizado o processo de coloração; para corar devem-se realizar os 
seguintes passos: 
a. Pingar o cristal violeta e esperar um minuto 
b. Sobre ele pingar lugol e esperar mais um minuto, 
c. Colocar solução de álcool cetona e lavar com água, 
d. Cobrir com Fucsina e esperar 30 segundos, 
e. Lavar e deixar secar. 
Observar ao microscópio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de óleo mineral na 
lâmina e focalizar com objetiva de imersão. 
 
Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -), a forma e o 
arranjo das células. 
Após o uso, a objetiva de imersãodeve ser limpa com papel absorvente. 
As bactérias que tiverem a característica irão formar cristais violeta em seu interior e se 
diferenciarão das demais pela coloração mais acentuada. 
Desenhe o que você observou: 
OBSERVAÇÃO: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Lâmina: Lâmina: 
Aumento: Aumento: 
 
 
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Lâmina: Lâmina: 
Aumento: Aumento: 
 
 
 
 
 
 
 
7-CONCLUSÃO: 
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Complete o quadro a seguir. 
 
 
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Como você explica o comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram? 
As bactérias do gênero Mycobacterium não se coram pelo método de Gram. Qual seria uma 
explicação para esse fato?