Aula prática 3 - Coloração de gram

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19/05/2020
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Colorações 
em 
Microbiologia 
Prof. Dr.ª janaina vieira
Fundamentos de 
microbiologia
OBJETIVO
• As técnicas de coloração usadas em microbiologia se destinam 
à observação de estruturas morfológicas como esporos, 
flagelos e forma das células, diferenciando microrganismos.
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As colorações podem ser:
Ex. Coloração de Gram, Coloração de esporos, Coloração de Flagelos, 
Coloração de Corpúsculos de inclusão, etc.
Diferencial ou Composta (quando se utiliza dois ou mais corantes): estudo 
morfológico e de algumas ultra estruturas dos microrganismos.
Simples (quando se utiliza apenas um corante): estudo morfológico básico da 
célula, como forma e agrupamentos dos microrganismos. Ex. coloração por 
azul de metileno
Qualquer processo de coloração segue 
basicamente três passos:
• Preparo do esfregaço: O esfregaço é a colocação dos 
microrganismos na lâmina de vidro para serem submetidos à 
coloração. Deve ser oval e delgado.
• Fixação do esfregaço: serve para fixar os microrganismos do esfregaço 
na lâmina de vidro, para que posteriormente não sejam removidos 
durante o processo de coloração.
• Este procedimento faz com que o protoplasma das células dos 
microrganismos se coagule,aderindo-os desta forma na lâmina.
• A forma mais utilizada de fixação de esfregaço, é passá-lo pela chama 
umas três vezes. Há também outros processosutilizando produtos
químicos.
• 3. Coloração propriamente dita: são os procedimentos de cada 
técnica de coloração.
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PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇO
Para sucesso na observação, é 
necessário que o esfregaço 
seja bem feito, apresentando-
se em monocamadas, 
suficientemente concentrado 
de forma a facilitar a 
visualização.
A secagem dos esfregaços deve 
ocorrer ao ar. Depois de secos, 
os esfregaços podem ser 
fixados com calor, passando 
rapidamente 2 a 3 vezes 
através da chama de bico de 
Bunsen.
Alça de Inoculação
ID
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Ç
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OCultura de microrganismos (em tubo 
ou placa)
Lâmina com o esfregaço
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ID
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O
FIXAÇÃO DO ESFREGAÇO
Após secar, passar a 
lâmina com o esfregaço 
para cima, por três vezes 
pela chama do bico de 
Bunsen.
Bico de Bunsen
PREPARAÇÕES PARA A 
MICROSCOPIA E TÉCNICAS 
DE VISUALIÇÃO DE 
MICRORGANISMOS
•A perfeita visualização dos microrganismos 
e/ou das suas estruturas só é possível se, 
além da escolha do tipo mais eficiente de 
microscopia, a preparação estiver adequada.
• A escolha do tipo de preparação depende da 
informação desejada e do microrganismo a ser
avaliado.
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TÉCNICA A
FRESCO:
❖ células, pequenos organismos vivos ou 
fragmentos de tecidos vivos →meio líquido o 
mais próximo possível do meio natural
❖ Conservadores fisiológicos
TÉCNICA A
FRESCO
• não produz modificações na forma e 
função
• serve de contraprova para outros 
métodos
• rapidez
Vantagem:
• objetos finos e transparentes
• não permite observações prolongadas
• mostra parte dos detalhes das estruturas
Restrições:
• lâmina com lamínula
• gota pendente
Modo de preparo
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TÉCNICA AFRESCO:
Microscopia e técnicas de 
visualização de microrganismos
TÉCNICAS FIXADAS E CORADAS:
❖Morfologia de células mortas
Etapas:
Esfregaço Fixação Coloração
Simples ou diferencial
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TÉCNICAS FIXADAS E CORADAS:
❖Coloração simples
TÉCNICAS FIXADAS E CORADAS:
❖Coloração diferencial – Coloração de Gram
Escherichia coli 
Salmonella sp 
Shigella sp 
Enterobacteriaceae
Sthaphylococcus sp 
Clostridium sp 
Pseudomonas sp
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Bactérias
• Quanto a coloração de Gram:
• Christian Gram (1884) classificou as bactérias em
Gram- positivas ou Gram-negativas;
• Neste procedimento as bactérias são submetidas
à ação de diferentes corantes e se coram de 
maneira diferente, dependendo da parede
celular.
COLORAÇÃO DE GRAM
• A coloração de Gram utiliza características diferenciais das células 
bacterianas. Estas características diferenciais se referem à 
estrutura da parede celular dos microrganismos.
• Os microrganismos que contêm altos teores de ácido teicóico 
(peptideoglicano) em sua parede celular se coram, pela coloração 
de Gram, em roxo-azulado intenso e são chamados de "Gram
positivos".
• Os microrganismos que contém lipopolissacarídeos na membrana 
externa somente se coram com o contracorante, mostrando-se da 
cor do mesmo (vermelho), e são denominados "Gram negativos".
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TÉCNICAS FIXADAS E CORADAS:
❖Coloração diferencial – Coloração de Gram
Violeta
Gram +:Violeta Gram - :Incolor
Gram +:Violeta Gram - :Rosa
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Esfregaço
Coloração de GRAM
Passar a lamina c/ 
esfregaço por 3x
sob a chama.
Proceder a coloração 
de GRAM
Alça
Bactériasisolada
Técnicade GRAM
1. Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min.
2. Escorrerexcesso do corante e lavar.
3.Cobrirlamina com Lugol e deixar por 1 min.
4. Escorrerexcesso do corante e lavar.
5.Cobrirlamina com Eter-acetona e deixar por 30s.
6.Escorrerexcesso do corante e lavar. 
7.Cobrirlamina com Fucsina e deixar por 30s.
8 . Escorrerexcessodo corante, lavar e deixar secar.
Fixação do 
esfregaço pelo 
calor
Fucsina
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Etapas da 
Coloração 
de Gram
Parede Celular de Bactérias Gram Positivas e Gram Negativas
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FIM... 
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