Genética médica - Duplicação do DNA e PCR

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A adição de um desoxirribonucleotídeo à extremidade 3’ de uma cadeia
polinucleotídica (fita iniciadora) é a reação fundamental da síntese do
DNA. Como mostrado, o pareamento das bases entre o
desoxirribonucleosídeo trifosfato a ser incorporado e uma fita de DNA
existente (fita-molde) determina a formação da nova fita de DNA,
resultando na sequência de nucleotídeos complementares.
Duplicação do DNA
Taxa de mutação humana = 1 nucleotídeo alterado a cada 10^10 nucleotídeos cada
vez que o DNA é replicado.
A manutenção de uma alta estabilidade genética é muito importante para a viabilidade
de uma espécie.
separação da dupla hélice
Cada nucleotídeo presente nas
fitas-molde precisa
reconhecer o nucleotídeo
complementar livre. A enzima
DNA-polimerase catalisa esse
processo e refaz as ligações
de hidrogênio entre as bases.
A replicação do DNA é
semiconservativa e
ocorre apenas na fase
S do ciclo celular
A DNA-polimerase também
catalisa o processo de adição
do desoxirribonucleotídeo à
extremidade 3' da fita
iniciadora
DNA-helicases + SSB (ptns
ligadoras de fita simples de
DNA)
@estetodamaria
A forquilha de replicação possui uma estrutura assimétrica. A fita-filha de DNA
sintetizada continuamente é denominada fita-líder, ou fita contínua. Sua síntese
precede levemente a síntese da fita-filha sintetizada de modo descontínuo, conhecida
como fita retardada, ou fita descontínua. Na fita retardada, a direção da 
 polimerização dos nucleotídeos é oposta à direção do crescimento da cadeia de DNA.
A síntese dessa fita pelo mecanismo descontínuo e “ao contrário” significa que
apenas o tipo de DNA-polimerase 5' para 3' é utilizado na replicação de DNA.
A DNA-polimerase realiza a primeira etapa da correção e ocorre imediatamente
antes da adição covalente de um novo nucleotídeo à cadeia crescente.
Se ocorrer um encaixe incorreto de nucleotídeos, a DNA-polimerase corrige o erro
com um sítio catalítico próprio para tal (correção exonucleolítica).
A correção eficiente de erros ocorre apenas na direção 5'-3'.
São necessários mecanismos de correção para que se mantenha a integridade do
código genético e se evite mutações.
Na fita-líder, apenas um iniciador é necessário para o início da replicação: uma vez
que a forquilha de replicação esteja estabelecida, a DNA-polimerase é continuamente
apresentada à extremidade da cadeia com o pareamento ao qual irá adicionar novos
nucleotídeos. No lado descontínuo da forquilha, por outro lado, cada vez que a DNA-
-polimerase completa um pequeno fragmento de Okazaki (o que leva alguns 
 segundos), ela deve novamente iniciar a síntese de um fragmento completamente
novo em um sítio mais adiante na fita-molde. Um mecanismo especial produz uma
fita iniciadora complementar necessária à DNA-polimerase. Esse mecanismo depende
de uma enzima chamada de DNA-primase, que utiliza ribonucleosídeos trifosfato
para sintetizar pequenos iniciadores de RNA na fita retardada.
A síntese de cada fragmento de Okazaki termina quando a DNA-polimerase encontra o
iniciador de RNA ligado à extremidade 5' do fragmento anterior. Para produzir uma
cadeia contínua de DNA a partir de vários fragmentos na fita retardada, um sistema
especial de reparo atua rapidamente 
para retirar o iniciador de RNA e 
substituí-lo por DNA. A seguir, uma 
enzima chamada de DNA-ligase liga 
a extremidade 3' do novo fragmento 
de DNA à extremidade 5' do 
fragmento anterior, completando
o processo.
estrutura em forma de Y, que contém a DNA-polimerase
Uma cinta deslizante mantém a DNA-polimerase em movimento sobre o DNA. Essa
cinta mantém a polimerase firmemente associada ao DNA enquanto está em
movimento, mas a libera tão logo a polimerase encontre um região de fita dupla.
 A montagem da cinta ao redor do DNA requer hidrólise de ATP por meio de um
complexo proteico especial, o montador da cinta, que hidrolisa ATP enquanto monta a
cinta em uma junção molde-iniciador
Proteínas e enzimas que atuam na replicação do DNA
DNA-topoisomerases evitam o emaranhamento
do DNA durante a replicação
Importante para que se evitem predisposições
a certos tipos de câncer.
A fita retardada de DNA recém-sintetizada contém
quebras temporárias (antes de serem unidas pela
DNA-ligase), e essas quebras (também chamadas
quebras de fita-simples) fornecem o sinal que
direciona o sistema de correção de malpareamento
à fita correta. Essa estratégia requer que as fitas
de DNA recém-sintetizadas na fita-líder também
sejam transitoriamente clivadas; ainda não está
claro como isso ocorre.
Um sistema de reparo de pareamento incorreto
remove erros de replicação que escapam da
maquinaria de replicação.
A replicação do DNA necessita da cooperação de várias proteínas, incluindo (1) a
DNA-polimerase e a DNA-primase, que catalisam a polimerização dos
nucleosídeos trifosfato; (2) as DNA-helicases e as proteínas ligadoras de DNA de
fita simples (SSB), que auxiliam na abertura da dupla-hélice para permitir que as
fitas sejam copiadas; (3) a DNA-ligase e uma enzima que degrada os iniciadores
de RNA, para ligar os fragmentos descontínuos de DNA formados na fita
retardada, e (4) as DNA-topoisomerases, que aliviam a tensão causada pelo
enrolamento helicoidal e os problemas de emaranhamento do DNA. Muitas
dessas proteínas associam-se entre si na forquilha de replicação, formando uma
“maquinaria de replicação” altamente eficiente, em que as atividades e os
movimentos espaciais dos componentes individuais são coordenados.
Novos nucleossomos são formados a partir
das chaperonas de histonas (NAP1 e CAF1)
A maioria das sequências de DNA
que pode atuar como uma origem
contém (1) um sítio de ligação para
uma grande proteína de iniciação
com múltiplas subunidades
chamada ORC (complexo de
reconhecimento da origem; do
inglês, origin recognition complex);
(2) uma sequência de DNA rica em
As e Ts e, portanto, fácil de
desnaturar; e (3) pelo menos um
sítio de ligação para proteínas que
facilitam a ligação do ORC,
provavelmente pelo ajuste da
estrutura da cromatina.
Sítios de origem da replicação
O iniciador de RNA final, sintetizado no molde da fita retardada não pode ser
substituído por DNA porque não há uma extremidade 3'-OH disponível para a
polimerase de reparo. Na ausência de um mecanismo para contornar esse problema, o
DNA das extremidades de todos os cromossomos seria perdido cada vez que uma
célula se dividisse. 
Os eucariotos resolvem esse problema de um modo diferente: por meio de sequências
nucleotídicas especiais nas extremidades dos cromossomos, incorporadas em
estruturas denominadas telômeros. Os telômeros contêm várias repetições
consecutivas de sequências curtas semelhantes em organismos tão diversos, como
protozoários, fungos, plantas e mamíferos. Em humanos, a sequência da unidade de
repetição é GGGTTA, sendo repetida aproximadamente mil vezes em cada telômero. As
sequências de DNA telomérico são reconhecidas por proteínas ligadoras de DNA que
reconhecem uma sequência específica de DNA e atraem uma enzima, chamada de
telomerase, que repõe essas sequências cada vez que a célula se divide. A telomerase
reconhece a extremidade de uma sequência telomérica de DNA existente e a estende
na direção 5'-3', utilizando um molde de RNA que compõe a própria enzima para
sintetizar novas cópias da repetição. 
PCR (reação em cadeia da polimerase)
clonagem de genes
diagnóstico (detecção de patógenos invasores em estágios iniciais de infecção)
área forense
Um par de iniciadores promove a síntese de um segmento de DNA de interesse em um
tubo de ensaio. Cada ciclo da PCR inclui três etapas: 
(1) O DNA de fita dupla é aquecido brevemente para separar as duas fitas. 
(2) O DNA é exposto a uma quantidade excessiva de um par iniciadores específicos –
projetados para limitar a região do DNA a ser amplificada – e a amostra é resfriada
para permitir que os iniciadores hibridizem com as sequências complementares nas
duas fitas de DNA. 
(3) Essa mistura éincubada com DNA-polimerase e os quatro desoxirribonucleosídeos
trifosfato, de modo que o DNA possa ser sintetizado, a partir dos dois iniciadores.
Para amplificar o DNA, o ciclo é repetido muitas vezes por meio do reaquecimento da
amostra para separar as fitas de DNA recém-sintetizadas.
A técnica depende do uso de uma DNA-polimerase especial isolada a partir de uma
bactéria termofílica; essa polimerase é estável a temperaturas muito mais altas do
que as DNA-polimerases eucarióticas, assim ela não é desnaturada pelo tratamento de
calor mostrado na etapa 1. Portanto, essa enzima não precisa ser adicionada
novamente após cada ciclo.
Empregos do PCR: