slide replicação do DNA

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Replicação do DNA
AcadÊmicas:Dayane Sarmento Romão, Emanuella Roberto Ribeiro, Emily Lima Cunha Perciliano e Ketrin Ribeiro Fávaro
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A síntese de DNA requer desoxinucleosideos trifosfatados e uma junção iniciador: molde
A síntese de DNA necessita de dois substratos fundamentais: 4 desoxiribonucleosídeos trifosfatados (Fig. 1) e o segundo substrato essencial para a síntese de DNA é o arranjo molecular do mesmo (ssDNA) em fita simples e em dupla (sdDNA) que se chama: Junção Iniciador: MOLDE (Fig.1b)
Onde o molde fornece ssDNA que atua dirigindo a adição de cada desoxinucleotideo complementar e o junção iniciador é um curto segmento de DNA complementar do molde, este deve possuir também um grupo 3’-OH adjacente exposto para a região de fita simples do molde, este grupo que será entendido a medida que os nucleotídeos forem adicionados, formalmente apenas uma porção do iniciador da junção iniciador:molde é um substrato para a síntese de DNA. 
Figura 1: (a) a estrutura geral dos 2’-desoxinucleosídeos trifosfatados e (b) Estrutura geral de uma junção iniciador:molde. A fita iniciadora (mais curta) está completamente anelada a fita DNA-molde (mais longa) e deve apresentar 3’-OH livre adjacente a uma região de ssDNA.
O DNA é sintetizado pela extensão da extremidade 3’ do iniciador
O que permite isso são as bases químicas do DNA (Fig. 2).
 A ligação fosfodiéster é formada em uma reação SN2 na qual o grupo hidroxila da extremidade 3’ da fita do iniciador ataca o grupo α-fosforil do nucleosídeo trifosfatado que será adicionado, tendo como produto da reação o pirosfosfato.
A fita molde (apresenta orientação paralela) orienta qual dos 4 nucleosídeos trifosfatados será adicionado. O nucleosideo trifosfatado que realizar o pareamento de bases com esta fita é altamente favorecido para ser adicionado á fita do iniciador, a disposição da fita-molde significa que a síntese de DNA tem orientação oposta ao DNA que está sendo sintetizado.
Figura 2. Diagrama do mecanismo de Sintese do DNA, iniciada quando o 3’OH do iniciador promove um ataque nucleofílico do α-fosforil-fosfato do dNTP que será corporado. Isso resulta na liberação de uma molécula de pirofosfato.
A hidrólise de pirofosfato é a força promotora da síntese de DNA
A adição de um nucleotídeo a uma cadeia polinucleotidica crescente de comprimento “n” é indicada pela reação (energia livre relativamente pequena)
XTP + (XMP)n  (XMP)n-1 + P ~ P
E qual força propulsora da polimerização de nucleotídeos do DNA ? A energia livre adicional é fornecida pela rápida hidrólise do pirofosfato em dois grupos fosfatos pela enzima pirosfosfatase: 
P ~ P  2Pi
UMA REAÇÃO FAVORÁVEL E IRREVERSIVEL
O resultado líquido da adição de um nucleotídeo e da hidrolise do pirofosfato é então a quebra de duas ligações fosfato de alta energia, sendo um processo acoplado com a seguinte reação geral: 
XTP + (XMP)n  (XMP)n+1 + 2Pi
As DNA-polimerases utilizam um único sítio ativo para catalisar a síntese de DNA
enzima responsável por catalisar a síntese de DNA: DNA-polimerase;
a DNA-polimerase utiliza um único sítio ativo para catalisa qualquer uma das quatros reações; 
ao invés da DNA-polimerase identificar o nucleotídeo que entra no sítio ativo, ela observa a capacidade do nucleotídeo em formar um par de bases; 
pares de bases correto é formado, o grupo 3’-OH do iniciador e grupo α-fosfato do nucleosídeo trifosfatado estão em posição ótima para a catálise; 
pares de bases incorretos geram a diminuição das taxas de adição de nucleotídeos
Figura 3. Pares de bases formadas corretamente (a) e incorretamente (b).
As DNA-polimerases utilizam um único sítio ativo para catalisar a síntese de DNA
outra função da DNA-polimerase: capacidade em distinguir ribonucleosídeos (rNTPs) dos desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dNTPs);
os rNTPs são incorporados 1.000 vezes menor que os dNTPs, pois a exclusão estérica de ribonucleosídeos do sítio ativo da DNA-polimerase; 
existe alguns nucleotídeos que possuem requerimentos para serem usados pela DNA-polimerase para inibir a síntese de DNA pela terminação de alongamento; esses tipos são muito usados em outra função, como no tratamento de câncer e infecções virais.
Figura 4. Ilustração esquemática das restrições estéricas que previnem o uso de precursores ribonucleosídeos pela DNA-polimerase. (a) Ligação de um desoxirribonucleosídeo trifosfatado corretamente pareado à DNA-polimerase. (b) Ligação de um ribonucleosídeo incorretamente pareado à DNA-polimerase.
As DNA-polimerases assemelham-se a uma mão que segura a junção iniciador:molde
pesquisadores descobriram como as DNA-polimerases catalisam a síntese de DNA.;
o substrato de DNA consegue encaixar em uma grande fenda, semelhante a uma mão direita parcialmente fechada;
 em analogia com a mão, os três domínios da polimerase são chamados de polegar, dedos e palma. 
 Figura 5. A estrutura tridimensional da DNA-polimerase lembra uma mão direita. (a) Representação esquemática da DNA-polimerase ligada a uma junção iniciador: molde. (b) Imagem similar da DNA-polimerase de T7 ligada ao DNA.
Domínio da palma
composto por uma folha β e os elementos principais do sítio catalítico;
liga a dois íons metálicos divalentes (Mg2+ ou Zn2+);
modificam o ambiente químico entorno do dNTPs corretamente pareado da 3’-OH por seu hidrogênio;
verificar a precisão do pareamento entre nucleotídeos recém-adicionados;
efetua inúmeros contatos por ligações de hidrogênio com pares de bases na fenda menor do DNA recém-sintetizado.
Figura 6. Dois íons metálicos ligados à DNA-polimerase catalisam a adição de nucleotídeos. (a) Ilustração do sítio ativo de uma DNA-polimerase. (b) Estrutura tridimensional do sítio ativo dos íons metálicos associado à DNA-polimerase de T7.
DOMÍNIO DOS DEDOS
apresenta um papel importante na catálise, pois muitos resíduos localizados nos dedos ligam-se a dNTPs que será incorporado;
esse domínio se desloca quando o par de bases correto entre dNTPs e o molde é formado;
esse formato de mão fechada da DNA-polimerase promove a catálise porque aproxima o nucleotídeo que será incorporado dos íons metálicos catalíticos; 
Figura 7. A DNA-polimerase “prende” o molde e o nucleotídeo que será incorporado quando um par de bases correto é formado. (a) Ilustração das alterações na estrutura da DNA-polimerase após o pareamento correto entre nucleotídeo que será incorporado e o molde de DNA. (b) Estrutura da DNA-polimerase de T7 ligada a seu substrato na conformação fechada. (c) Estrutura tridimensional da DNA-polimerase.
DOMÍNIO DOS DEDOS
se associa à região do molde, tendo uma volta de 90°do esqueleto fosfodiéster entre a primeira e a segunda base do molde;
essa conformação do molde serve para mostrar apenas a primeira base do molde, após o iniciador no sítio catalítico.
Figura 8. Ilustração do trajeto do molde de DNA na DNA-polimerase.
DOMÍNIO DO POLEGAR
não está diretamente ligado a catálise;
interage com o DNA recém-sintetizado;
acontece devido a dois motivos:
manter a posição correta do iniciador e do sítio ativo;
auxiliar na manutenção da forte associação entre a DNA-polimerase e seu substrato.
 Figura 9. Representação esquemática da DNA-polimerase ligada a uma junção iniciador: molde. 
As DNA-polimerase são enzimas processivas
apresenta uma natureza de processividade, que é uma característica das enzimas que atuam sobre substratos poliméricos;
DNA-polimerase possui uma catálise rápida;
o grau de processividade é definido como o número médio de nucleotídeos adicionados cada vez que a enzima se liga à junção iniciador:molde. 
Cada DNA-polimerase apresenta uma processividade específica, mas que pode variar de alguns nucleotídeos
Figura 10. As DNA-polimerases sintetizam o DNA de maneira processiva.
As DNA-polimerase são enzimas processivas
etapa limitante da síntese de DNA: ligação inicial da polimerase à junção iniciador:molde;
uma polimerase altamente processiva aumenta a velocidade total de síntese de DNA em cerca de 1.000 vezes, em comparação a uma enzima completamentenão processiva;
quando a DNA-polimerase é ligada a uma junção iniciador:molde, ela interage com grande parte da região de dupla-fita do DNA de maneira não sequência específica;
essas interações incluem interações eletrostáticas entre o esqueleto fosfatado e o domínio de polegar, e interações entre a fenda menor do DNA e o domínio da palma;
o aumento adicional na processividade são alcançados por meio de interações entre a DNA-polimerase e proteínas acessórias.
Exonucleases realizam uma revisão de leitura no DNA recém-sintetizado 
Nucleotídeos malpareados como molde devem ser eliminados.
A remoção desses nucleotídeos malperados é medida por um tipo de nuclease que foi originalmente identificada no mesmo polipeptídeo que a DNA-polimerase, chamadas de exonucleases de revisão de leitura.
A remoção de nucleotídeos malpareados é facilitada pela capacidade reduzida de a DNA-polimerase adicionar um nucleotídeo adjacente a um iniciador contendo um par e bases incorreto.
O nucleotídeo incorreto é eliminado da extremidade 3´ da fita e dá a oportunidade à DNA-polimerase de adicionar o nucleotídeo correto.
Exonucleases realizam uma revisão de leitura no DNA recém-sintetizado
Quando um nucleotídeo malpareado é adicionado, ele diminui a velocidade de adição de novos nucleotídeos e aumenta a velocidade da atividade da exonuclease de revisão de leitura.
A remoção da base malpareada possibilita o restabelecimento da junção iniciador:molde e sua ligação ao sítio ativo da polimerase, permitindo que a síntese de DNA continue.
Em média, a DNA-polimerase insere um nucleotídeo incorreto a cada 105 nucleotídeos adicionados e as exonucleases de revisão de leitura diminuem a ocorrência de uma base incorreta para cada 107, aumentando assim a precisão da síntese de DNA.
Figura 11. Etapas da remoção de bases malpareadas pela exonuclease.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
Ambas fitas do DNA são sintetizadas juntas na forquilha de replicação
A junção entre as duas fitas-molde recém-separadas e o dúplex de DNA não replicado é conhecido como forquilha de replicação.
A forquilha de replicação desloca-se continuamente em direção à região do dúplex de DNA não replicado, deixando em seu trajeto dois moldes de ssDNA que coordenam, cada um, a síntese de uma fita de DNA complementar.
A natureza antiparalela do DNA dificulta à replicação simultânea dos dois moldes expostos pela forquilha de replicação.
Ambas fitas do DNA são sintetizadas juntas na forquilha de replicação
Como o DNA é sintetizado apenas pelo alongamento da extremidade 3´, apenas um dos dois moldes expostos pode ser replicado de forma contínua à medida que a forquilha de replicação se movimenta. A fita de DNA recém-sintetizada, coordenada por esse molde, é conhecida como fita-líder.
O molde de ssDNA faz a DNA-polimerase se deslocar em direção oposta à forquilha de replicação. A fita de DNA sintetizada a partir desse molde é chamada de fita tardia ou fita retardada, onde essa fita de DNA é sintetizada de maneira descontínua.
Fragmentos de Okazaki é o nome dado aos pequenos fragmentos de DNA recém-sintetizados, formando uma fita tardia. Logo após a sua síntese, os fragmentos de Okazaki são covalentemente ligados, produzindo a uma nova fita de DNA contínua e intacta, portanto, tais fragmentos são intermediários temporários na replicação do DNA
Figura 12. Forquilha de replicação. (Vermelho) DNA recém-sintetizado; (verde) iniciadores de RNA. Os fragmentos de Okazaki estão representados bem mais curto do que realmente ocorrem, por propósitos ilustrativos. Na célula, os framentos de Okazaki podem ter de 100 a 2000 bases, dependendo do organismo.
A iniciação de uma nova fita de DNA requer um iniciador de RNA
As DNA-polimerases não conseguem iniciar novas cadeias de DNA de novo e quem realiza essa atividade são as RNA-polimerases.
A primase é uma RNA-polimerase especializada em sintetizar pequenos iniciadores de RNA sobre um molde de ssDNA, onde tal iniciadores são estendidos pela DNA-polimerase.
Ambas as fitas, líder e tardia, necessitam da primase para iniciar a síntese de DNA. Cada fita-líder necessita apenas de um único iniciador de RNA, em contrapartida a síntese descontinua da fita tardia requer a síntese de um novo iniciador para cada fragmento de Okazaki.
A iniciação de uma nova fita de DNA requer um iniciador de RNA
A primase não necessita de uma sequência de DNA estendida para iniciar a síntese de RNA, em vez disso preferem iniciar a síntese de RNA usando um molde de ssDNA contendo um trímero específico.
A atividade da primase é aumentada quando ela se associa a outra proteína que atua na forquilha de replicação, chamada de DNA-helicase. Essa proteína desenrola o DNA na forquilha de replicação, criando um molde de ssDNA onde a primase pode atuar. 
Figura 13. Ação da RNA-polimerase.
Os iniciadores de RNA devem ser removidos para finalizar a replicação do DNA
Para completar a replicação do DNA, os iniciadores de RNA,utilizados para a iniciação, devem ser removidos e substituídos por DNA;
A enzima RnaseH remove a maior parte de cada iniciador de RNA para substituir os iniciadores de RNA por DNA, ela degrada o RNA e remove todo o inciador de RNA;
A DNA-ligase utiliza ATP para formar uma ligação diéster;
A síntese de DNA estará completa somente após a substituição de todos os inniciadores de RNA e a ligação de todas as quebras.
Figura 14. Remoção dos iniciadoresde RNA a partir do DNA recém sintetizado.
As DNA-helicasesdesenrolam a supla-hélice á frente da forquilha de replicação
A DNA-helicases, catalisa a separação das duas fitas dúplex de DNA, ela liga-se ao ssDNA;
A liberação da helicase do seu substrato de DNA requer a abertura do anel proteico hexamérico mas elas também dissociam-se do DNA quando alcança a extremidade da fita de DNA;
há mecanismos especializados que abrem o anel da DNA helicase e a posicionam em torno do DNA antes do restabelecimento do anel;
A direção 5’→3’ ou 3’→5’ sempre é definida de acordo com a fita de DNA ligada em vez da fita que é deslocada;
Figura 15. As DNA-helicases separam as duas fitas da dupla-hélice.
A DNA-helicase puxa o DNA de fita simples através de um poro poteico central
A determinação da estrutura atômica de uma helicase hexamérica viral ligada a um substrato de ssDNA é circundado pelas seis subunidades de helicases;
Cada uma das seis diferentes subunidades está em um estágio diferente no processo de translocação do DNA;
Á medida que uma única subunidades se liga, hidrolisa e libera ATP, ela passa através das conformações do topo, do centro e da base;
O movimento coordenado de grampos proteicos consegue puxar o ssDNA através do poro central;
Figura 16. Estrutura e mecanismo proposto para uma DNA-helicase;
Proteínas de ligação ao DNA de fita simples estabilizam o ssDNA antes da replicação
A ssDNA recém-gerada deve permanecer livre de pareamentos para ser utlizada como molde na síntesede DNA;
A ligação de uma SSB gera a ligação de outra SSB ao ssDNA, chamada de ligação cooperativa.
A ligaçõ cooperativa assegura que o ssDNA seja rapidamente coberto por SSB á medida que ele é liberado da DNA-helicase;
As SSBs formam poucas ou nenhuma ligação de hidrogênio com as bases do ssDNA.
Ocorrerá ligação ás outras moléculas de ssDNA somente após as moléculas de SSB terem coberto completamente as moléculas de ssDNA já ligadas;
Figura 17. Ligação da proteína de ligação ao DNA de fita simples(SSB) ao DNA.
As topoisomerases removem as supertorções produzidas pelo desenrolamento do DNA na forquilha de replicação 
A medida que as fitas do DNA são separadas na forquilha de replicação, o dsDNA em frente á ela se torna progressivamente supertorcido (Fig ?) 
Esse acumulo de supertorções é o resultado da ação da DNA-helicase, que por sua vez rompe o pareamento das bases entre as duas fitas, se elas não sofrerem quebras, não há como reduzir o numero de ligação para acomodar esse desenrolamento do duplex de DNA. 
Figura 18. Imagem ilustrativa representando a ação da DNA- helicase
Autor (A) - 
Assim,a medida que a DNA-helicase atua o DNA deve acomodar o mesmo número de ligação em um número de pares de bases cada vez menor e para que ele permaneça relaxado uma laçada do DNA deve ser removida a cerca de 10PB de DNA desenrolado, caso não existisse um mecanismo para aliviar o excesso de superenrolamentos, a maquinaria de replicação giraria como uma manivela até parar.
No cromossomo circular de bactéria o problema é mais claro, mas também se aplica em celular eucarióticas, como esses cromossomos eucarióticos não são círculos fechados eles poderiam a principio sofrer rotações em toda sua extensão para dissipar as supertorções introduzidas, mas nem sempre é assim, até porque é praticamente impossível rodar uma molécula de DNA
A topoisomerase:
Essas supertorções induzidas pela DNA-helicase são removidas por topoisomerases (Fig ?), essas enzimas provocam a quebra de uma ou duas das fitas do DNA e permanecem ligadas ao DNA, passando o mesmo numero de fitas de DNA através da quebra, essa ação alivia o acumulo de supertorçoes. 
Figura 19. A ação da topoisomerase. 
Enzimas da forquilha de replicação expandem a amplitude de substratos da DNA-polimerase
A DNA-polimerase, por si só, pode estender de forma eficiente apenas iniciadores com uma extremidade 3’-OH anelados a moldes de ssDNA. 
A adição da primase, da DNA-helicase e da topoisomerase amplica, consideravelmente, os possíveis substratos para a DNA-polimerase. 
A primase possibilita que novas fitas de DNA sejam iniciadas sobre qualquer segmento de ssDNA, a utilização desta impõe a necessidade de remoção dos iniciadores de RNAs para complementar a replicação. Da mesma maneira, a separação das fitas pela DNA-helicase e a remoção de supertorçoes positivas pela topoisomerase permite á DNA-polimerase replicar o dsDNA. 
Embora os nomes das proteínas sejam diferentes nos diferentes organismos (fig?), o mesmo conjunto de atividades enzimáticas é utilizado desde bactérias e leveduras até seres humanos para efetuar a replicação do DNA cromossômico (Fig ?)
Tabela 1. Enzimas que atuam na forquilha de replicação.
É notável que a DNA-helicase e a topoiromerase realizem suas funções sem alterar permanentemente a estrutura química do DNA ou sintetizar qualquer molécula nova. A DNA-helicase rompe apenas as ligações de hidrogênio que mantem as duas fitas de DNA unidas (Fig ?), sem qualquer rompimento de ligação covalente. 
Figura 20. DNA-helicase rompendo pontes de hidrogênio. 
As proteínas que atuam na forquilha de replicação interagem firmemente com o DNA, mas de maneira independente da sequência. 
Essas interações exploram as características comuns do DNA, independente de um par especifico de bases: a carga negativa e a estrutura do esqueleto fosfatado (ex., o domínio de polegar da DNA-polimerase); os resíduos que atuam nas ligações de hidrogênio na fenda menor (p. ex., o domínio de palma da DNA-polimerase) (Fig 21); e as interações de empilhamento hidrofóbicas entre as bases (p.ex.,SSBs).
Figura 21. O domínio de palma da DNA-polimerase
ESPECIALIZAÇÕES DAS DNA-POLIMERASES
As DNA-polimerases são especializadas em diferentes funções na célula
Para que ocorra a replicação de forma eficiente é necessário que as células apresentem diversas DNA-polimerases especializadas.
A DNA-polimerase III (DNA Pol III) é a principal enzima envolvida na replicação do cromossomo e deve ser altamente processiva. 
A DNA Pol III geralmente é encontrada como parte de um complexo maior, que confere uma processividade muito alta – um complexo conhecido como holoenzima DNA Pol III.
As DNA-polimerases são especializadas em diferentes funções na célula
A DNA-polimerase I (DNA Pol I) é especializada na remoção dos iniciadores de RNA utilizados para iniciar a síntese de DNA.
Em contrapartida a DNA Pol III, a DNA Pol I não apresenta alta processividade (ideal para remoção do iniciador de RNA e para a síntese de DNA sobre a lacuna de ssDNA).
Adiciona apenas 20 a 100 nucleotídeos por evento de ligação.
Como são envolvidas na replicação do DNA, a DNA Pol I e a DNA Pol III precisam ser altamente precisas, assim, as duas proteínas contêm uma exonuclease de revisão de leitura associada.
As DNA-polimerases são especializadas em diferentes funções na célula
As células eucarióticas também apresentam múltiplas DNA-polimerases.
Três DNA-polimerases são essenciais na duplicação do genoma: DNA Pol δ, DNA Pol ε e DNA Pol α/primase.
A DNA Pol α/primase está especificamente envolvida na iniciação de novas fitas de DNA.
Por possuir uma processividade relativamente baixa, a DNA Pol α/primase é rapidamente substituída pelas DNA δ e Pol ε de alta processividade.
Essa substituição é chamada de troca de polimerase e resulta em três diferentes DNA-polimerases atuando na forquilha de replicação eucariótica.
Tabela 2. Atividades e funções das DNA-polimerases.
Os grampos deslizantes aumentam significativamente a processividade da DNA-polimerase
A alta processividade das DNA-polimerases que atuam na forquilha de replicação é graças a associação delas com proteínas chamadas grampos deslizantes de DNA. 
Essas proteínas são formadas por múltiplas subunidades idênticas que se unem em formato de uma “rosquinha”.
Figura 22. Estrutura de um grampo deslizante de DNA.
Os grampos deslizantes aumentam significativamente a processividade da DNA-polimerase
Na ausência do grampo deslizante, uma DNA-polimerase dissocia-se e afasta-se do molde de DNA em média uma vez a cada 20 a 100 pb sintetizados. 
Na presença do grampo deslizante, a DNA-polimerase ainda desprende seu sítio ativo da extremidade 3´-OH do DNA frequentemente, mas a associação com o grampo impede que ela se difunda para longe do DNA. 
Ao manter a polimerase próxima do DNA, o grampo deslizante assegura que a DNA-polimerase se religue rapidamente à mesma junção iniciador:molde, aumentanto muito a processividade da DNA-polimerase. 
Figura 23. Os grampos deslizantes de DNA aumentar a processividade das DNA-polimerases associadas
Os grampos deslizantes aumentam significativamente a processividade da DNA-polimerase
Após o molde de ssDNA ter sido totalmente copiado, a DNA-polimerase é liberada dos dsDNA e do grampo deslizante, para atuar em uma nova junção iniciador:molde.
Uma vez liberado de uma DNA-polimerase, os grampos deslizantes não são imediatamente removidos do DNA replicado. Em vez disso, outras proteínas que atuam no sítio de síntese recente de DNA interagem com as proteínas grampos.
As proteínas grampos deslizantes são uma parte conservada da maquinaria de replicação de DNA, derivada de organismos tão diversos como vírus, bactérias, leveduras e seres humanos.
Em cada caso, o grampo apresenta o mesmo eixo de simetria sêxtupla e o mesmo diâmetro, contudo, apesar da similaridade na estrutura geral, o número de subunidades que se associam para formar o grampo é diferente.
Figura 24. Estruturas tridimensionais dos grampos deslizantes de DNA isolados de diferentes organismos. 
OS GRAMPOS DESLIZANTES SÃO ABERTOS E POSICIONADOS NO DNA POR CARREGADORES DO GRAMPO
O grampo deslizante é um anel fechado em solução;
se abre para envolver a dupla-hélice de DNA;
os carregadores do grampo deslizante catalisa a abertura e a colocação dos grampos deslizantes no DNA;
grampos deslizantes do DNA é removido pelo carregador do grampo;
DNA-helicases e as topoisomerases altera a conformação de seu alvo (grampo deslizante), mas não a sua composição química;
OS GRAMPOS DESLIZANTES SÃO ABERTOS E POSICIONADOS NO DNA POR CARREGADORES DO GRAMPO
grampo deslizante só pode ser removido do DNA se não estiver sendo utilizado por outra enzima;
os carregadores de grampos e as DNA-polimerases não podem interagir com os grampos deslizantes;
grampo deslizante que está ligado à DNA-polimerase não poderá ser removido do DNA; 
grampos deslizantes são removidos do DNA apenas quando todas as enzimas que interagem com eles tiverem completado suas funções.
Síntese de DNA na forquilha de replicação
As fitas líder e tardia são sintetizadas simultaneamente;Existe um reparo para a quebra completa no cromossomo que leva á mutação do DNA;
Para coordenar a replicação de ambas as fitas do DNA, diversas DNA-polimerases atuam na forquilha de replicação, a ação coordenada dessas polimerases é facilitada pela ligação física entre elas em uma grande complexo multiproteico – holoenzima DNA Pol III;
Quatro enzimas em cada cópia da holoenzima Pol III;
O fixador do grampo deslizante inclui três cópias da proteína τ, e cada uma inclui um domínio que interage com o núcleo da DNA Pol III;
Figura 25, Composição da holoenzima DNA III;
Síntese de DNA na forquilha de replicação
Síntese de DNA na forquilha de replicação
O molde da fita-líder é exposto e atua na enzima, o molde da fita tardia não sofre imediatamente a ação da DNA-polimerase;
O molde é liberado como ssDNA que é rapidamente ligado por SSBs;
A holoenzima DNA pol III interage com a DnNA-helicase por meio das subunidades τ;
Um núcleo da DNA Pol III replica a fita-líder, enquanto os outros dois núcleos replicam a fita tardia. 
Figura 26, Modelo de “trombone” para a coordenação da replicação por duas DNA-polimerases na forquilha de replicação de E. coli.
SÍNTESE DE DNA NA FORQUILHA 
DE REPLICAÇÃO
ssDNA adicional é gerado pela helicase e um novo iniciador de RNA é sintetizado nesse molde;
estudos comprovaram a presença de uma terceira DNA Pol III;
a DNA Pol III liberada permanece presa à helicase pela subunidade τ do carregador do grampo deslizante, sendo que essa polimerase está pronta para se ligar à próxima junção iniciador de RNA:molde depois da adição de um grampo deslizante;
 “modelo de trombone”: referente à alteração no formato da alça de DNA fita simples formada entre a DNA-polimerase e a DNA-helicase no molde da fita tardia.
SÍNTESE DE DNA NA FORQUILHA 
DE REPLICAÇÃO
A replicação do DNA nas células eucarióticas necessita de três DNA-polimerases: DNA pol α/primase, DNA Pol δ e DNA Pol ɛ. A DNA Pol α/primase inicia novas fitas, e as DNA Pol δ e Pol ɛ estendem essas fitas.
 Varias proteínas adicionais faze parte da forquilha de replicação eucariótica. Suas funções são desconhecidas mas é provável que atuem na coordenação das três DNA-polimerases e acoplem sua ação a DNA helicase eucariótica (complexo Mcm2-7). 
As interações entre as proteínas da forquilha de replicação formam o replissomo de E. coli
as interações adicionais entre proteínas da forquilha de replicação facilitam a rápida progressão;
interação mais importante: entre a DNA-helicase e a holoenzima (Figura 7);
essa interação mantém a helicase e a holoenzima DNA Pol III juntas;
	1. esta junção estimula a atividade da helicase, fazendo com que a velocidade do movimento aumente em 10 vezes;
	2. porém a DNA-helicase fica mais lenta se estiver separada da DNA-polimerase (Figura 7);
Figura 27. A ligação da DNA-helicase à holoenzima DNA Pol III estimula a velocidade de separação das fitas do DNA.
As interações entre as proteínas da forquilha de replicação formam o replissomo de E. coli
uma segunda interação proteína-proteína é entre a DNA-helicase e a primase; 
a primase se associa à helicase e ao ssDNA coberto por SSB e sintetiza um novo iniciador de RNA; 
depois da síntese de um iniciador de RNA, a DNA-helicase libera a primase, ficando em solução;
replissomo: combinação de todas as proteínas que atuam na forquilha de replicação.
Sequências de DNA genômicas específicas promovem a iniciação da replicação do DNA
formação inicial de uma forquilha de replicação requer a separação das duas fitas de dúplex de DNA para produzir o ssDNA necessário para ligação à DNA-helicase e para atuar como molde para síntese do iniciador de RNA e do novo DNA;
a síntese de DNA inicia em regiões internas mesmo que as fitas de DNA sejam mais fáceis de desenrolar nas extremidades dos cromossomos; 
ausência de extremidades cromossômicas nos cromossomos circulares torna o desenrolamento do DNA interno essencial ao início da replicação;
as origens de replicação sítios específicos que o DNA é desenrolado e o início da replicação ocorre.
Modelo de replicon para iniciação da replicação
Em 1963 três cientistas propuseram um modelo para explicar os eventos que controlam a iniciação da replicação nas bactérias:
Definindo que todo DNA replicado a partir de uma determinada origem compõe um replicon.
Em contrapartida, a presença de múltiplas origens de replicação divide cada cromossomo eucariótico em múltiplos replicons (um a cada origem).
O modelo:
Este modelo propunha dois componentes que controlavam o inicio da replicação: o replicador e o iniciador (Fig 28). 
O replicador é definido como as sequencias de DNA que atuam em cis e são suficientes para dirigir o inicio da replicação do DNA. 
Isso vai contra a origem da replicação uma vez que o sitio físico do DNA onde a molécula é desenrolada e a síntese de DNA começa. 
O segundo componentes do modelo de replicon é a proteína iniciadora. Essa proteína reconhece especificamente um elemento de DNA no replicador e ativa o inicio da replicação (Fig 28). 
 Essa proteína iniciadora conhecida é regulada pela ligação e hidrolise do ATP, e compartilham um motivo comum de ligação a ATP no núcleo, AAA, que é relacionado, mas diferente do usado pelos carregadores de grampo deslizante de DNA.
Figura 28. Modelo de replicon (a ligação da proteína iniciado ao replicador estimula o inicio da replicação e a duplicação do DNA associado)
As sequências do replicador incluem sítios de ligação ao iniciador e um DNA fácil de desenrolar
As sequencias de DNA dos replicadores apresentam duas características em comum,a inclusão de um sitio de ligação para a proteína iniciadora que induz a montagem da maquinaria de iniciação da replicação e segundo, elas contem uma sequencia de DNA rica em A-T que se desenrola facilmente (não espontaneamente).
 A separação de fitas de DNA nos replicadores é controlada pelas proteínas de iniciação e replicação.
O único replicador necessário para a replicação do cromossomo de E.coli é chamado oriC. 
O único replicador necessário para a replicação do cromossomo de E.coli é chamado oriC. Existem dois motivos repetidos que são fundamentais a função do mesmo (Fig 29), o motivo de 9 nucleotídeos é o sitio de ligação para a proteína iniciadora de E. coli, DnaA, e esta repetido cinco vezes na OriC. O motivo de 13 nucleotídeos, repetidos três vezes, é o sitio inicial da formação de ssDNA durante a iniciação.
Os replicadores encontrados nos eucariotos multicelulares não estão bem caracterizados. Sua identificação e caracterização foram dificultadas pela falta de analises genéticas que permitiam a propagação estável de pequenos DNAs circulares
Nos poucos casos em que os replicadores foram identificados, eles se apresentaram maiores do que os replicadores foram identificados em S. ceravisiae e nos cromossomos bacterianos. 
Ao contrario de suas contrapartidas menores, mutações simples que eliminam a função desses replicadores não foram encontradas (identificadas). 
De fato, é provável que as sequencias de DNA especificas não possuam um papel importante na definição dessas replicadores. Em vez disso, estudos recentes sugerem que densidade nucleossomica local reduzida e transcrição próxima são determinantes importantes ao replicador
LIGAÇÃO E DESENROLAMENTO: 
SELEÇÃO E ATIVAÇÃO DA ORIGEM PELA 
PROTEÍNA INICIADORA
proteínas iniciadoras desempenham duas funções: 
ligar ao DNA replicador;
interagir com fatores adicionais necessários para o início da replicação, recrutando para o replicador 
algumas dessas proteínas apresentam uma terceira função: distorcer ou desenrolar uma região de DNA adjacente a seus sítios de ligação com finalidade de facilitar a abertura do dúplex de DNA.
LIGAÇÃO E DESENROLAMENTO: 
SELEÇÃO E ATIVAÇÃO DA ORIGEM PELA 
PROTEÍNA INICIADORA
o DNA desenrola e fornece um molde de ssDNA;
a formação de ssDNA em um sítio cromossômico não é suficiente para a associação da DNA-helicase e das outras proteínas de replicação;
a DnaA recruta proteínas de replicaçãoadicionais para o ssDNA formado no replicador, incluindo a DNA-helicase;
a regulação da replicação de E. coli está ligada ao controle da atividade de DnaA.
LIGAÇÃO E DESENROLAMENTO: 
SELEÇÃO E ATIVAÇÃO DA ORIGEM PELA 
PROTEÍNA INICIADORA
complexo de reconhecimento de origem (ORC) é o inciador;
ORC – células de levedura;
função: reconhecer uma sequência conservada encontrada em replicadores de leveduras, denominada “elemento A”;
ORC liga-se e hidrolisa ATP;
a hidrólise de ATP é necessária para que o ORC participe no carregamento da DNA-helicase eucariótica no DNA replicador;
ORC é necessário para recrutar, direta ou indiretamente, todas as proteínas de replicação restantes para o replicador. 
Interações proteína-proteína e proteína-DNA promovem a iniciação
as etapas restantes na iniciação da replicação são comandadas por interações proteínas-proteínas e proteínas-DNA;
complexo de duas proteínas: a DNA-helicase (DnaB) e a proteína carregadora da helicase (DnaC) (Figura 1);
Figura 29. Modelo para a iniciação da replicação do DNA em E.coli.
Interações proteína-proteína e proteína-DNA promovem a iniciação
interações proteína-proteína entre a helicase e outros componentes da forquilha de replicação promovem a organização do restante da maquinaria de replicação (Figura 2);
A helicase recruta a DNA-primase para a origem do DNA, resultando na síntese de um iniciador de RNA sobre cada uma das fitas da origem;
Figura 30. Modelo para a iniciação da replicação do DNA em E.coli.
Interações proteína-proteína e proteína-DNA promovem a iniciação
um novo ssDNA é exposto pela ação da helicase, ele é coberto por SSBs;
a DNA-primase sintetiza os primeiros iniciadores da fita tardia;
os primeiros fragmentos de Okasaki são estendidos e mais molde de DNA de fita tardia de ssDNA é gerado = um novo iniciador de RNA sintetizado;
Depois da montagem de um grampo deslizante de DNA, o segundo fragmento de Okasaki é iniciado pela terceira enzima DNA Pol III (Figura 3);
forquilhas de replicação terão sido montadas, e o início da replicação estará concluído. 
Figura 31. Modelo para a iniciação da replicação do DNA em E.coli.
Os cromossomos eucarióticos são replicados exatamente uma única vez por ciclo celular
A replicação do DNA ocorre apenas durante a fase S do ciclo celular; 
todo o DNA na célula deve ser duplicado exatamente uma vez, porém a replicação incompleta de qualquer parte de um cromossomo provoca ligações inadequadas entre os cromossomos-filhos
a segregação de cromossomos ligados provoca quebras ou perdas cromossômicas (Figura 32);
cada par de base em cada cromossomo seja replicado apenas uma única vez em cada divisão da célula eucariótica.
Figura 32. As quebras cromossômicas como resultadoda replicação incompleta do DNA.
Os cromossomos eucarióticos são replicados exatamente uma única vez por ciclo celular
replicar o DNA apenas uma única vez é um desafio para os cromossomos eucarióticos;
nem todas as origens necessitam ser ativadas para completar a replicação, mas se poucas forem ativadas, algumas regiões do genoma não serão replicadas;
se um replicador for ativado para realizar sua própria replicação ou se ele for replicado por uma forquilha de replicação derivada de um replicador adjacente, ele deve ser inativado até o próximo ciclo de divisão celular (Figura 33). 
 Figura 33. Os replicadores são inativados pela replicação do DNA.
O carregamento da helicase é o primeiro passo para iniciação da replicação em eucariotos
Os eventos da iniciação da replicação eucariótica ocorrem em momentos distintos do ciclo celular. 
O carregamento da helicase em todos os replicadores durante a fase G1 (antes da fase S). 
A ativação do replicador ou da origem, incluindo a ativação da helicase e a montagem do replissomo, ocorre apenas após a entrada da célula em fase S.
O carregamento da helicase eucariótica necessita que quatro proteínas atuem em cada replicador 
 A etapa inicial do carregamento da helicase é o reconhecimento do replicador pela proteína iniciadora eucariótica, ORC, ligada ao ATP. 
Á medida que as células entram na fase G1 do ciclo celular, o ORC ligado a origem recruta duas proteínas carregadoras de helicase as Cdc6 e a Cdt1 e duas copias da helicase Mcm2-7 para a origem. 
A hidrolise de ATP por Cdc6 resulta no carregamento de um dímero cabeça a cabeça do complexo Mcm2-7, fazendo com que envolvam a origem de DNA dupla-fita. Durante esse evento, Cdt1 e Cdc6 são liberadas da origem. 
Figura 34. Carregamento da helicase eucariótica.
Acredita-se que a hidrolise de ATP por ORC restabelece o processo e permite o inicio de uma nova rodada de carregamento de Mcm2-7 após a ligação de ATP. 
As helicases carregadas são ativadas por duas proteínas quinases: CDK e DDK (fig 35), essas proteínas ligam covalentemente grupos fosfatos as suas proteínas-alvo. 
Essas quinases são ativadas quando as células chegam a fase S e uma vez ativada, a DDK atua sobre a helicase carregada e a CDK sobre outras proteínas de replicação. 
A fosforilação dessas proteínas resulta na ligação das proteínas Cdc45 e GINS á helicase Mcm2-7 (fig 34), formando um complexo ativo da DNA helicase.
Figura 35. A ativação da helicases carregadas leva a montagem do replissomo eucariótico.
O carregamento e ativação da helicase são regulados para permitir apenas um único ciclo de replicação por ciclo celular.
O controle esta na oscilação entre dois estados de replicação que ocorre uma vez a cada ciclo celular. Durante a fase G1, as células estão em fase de carregamento de helicase e são competentes para o carregamento da helicase, mas não conseguem ativar as helicases carregadas. 
Com a entrada na fase S e seguimento para G2 e M, as helicases carregadas durante G1 podem ser ativadas, mas o novo carregamento de helicase é estritamente inibido (Fig 36).
Figura 36. O carregamento e a ativação da helicase eucariótica ocorrem durante diferentes estágios do ciclo celular.
Mecanismo visto em todas células eucarióticas .
Assim cada ciclo celular existe apenas uma única oportunidade para que as helicases sejam carregadas em suas origens (durante G1) e apenas uma oportunidade para que essas helicases carregadas sejam ativadas.
Essa regulação e atingida geralmente acoplada a função das CDKS (ex-levedura S. cerevisiae) conforme (fig. 37).E essas enzimas:
 Primeiro, elas são necessárias na ativação de helicases carregadas, iniciando a replicação do DNA. 
Segundo, a atividade da CDK inibe o carregamento da helicase. 
Figura 37. A regulação da atividade de CDK pelo ciclo celular controla a replicação.
Semelhanças entre a iniciação da replicação do DNA em procariotos e eucariotos
O principio geral é o mesmo em ambos os casos, a etapa inicial é o reconhecimento do replicador pela proteína iniciadora. A proteína iniciadora, associada a uma ou mais proteínas carregadoras de helicases, recruta a DNA-helicase para o replicador. A helicase geram uma região de ssDNA que atua como molde para síntese do iniciador de RNA.
Embora eventos de iniciação sejam semelhantes, a regulação da replicaçãoo em bactérias e eucariotos é bastante diferente. Por exemplo, ao contrario das células eucarióticas, as células bacterianas de divisão rápida iniciam a replicação mais de uma vez por ciclo celular.
TERMINO DA REPLICAÇÃO
A finalização da replicação do DNA requer um conjunto de eventos específicos;
Eventos esses distintos em cromossomos circulares e cromossomos lineares;
Cromossomos circulares: a maquinaria da forquilha de replicação convencional pode replicar a molécula inteira, mas as moléculas-filhas resultantes estão topologicamente unidas;
Cromossomos lineares: a replicação das extremidades não pode ser finalizada pela maquinaria de replicação discutida até o momento;
Organismos que possuem cromossomos lineares desenvolveram estratégias específicas para a replicação das extremidades de seus cromossomos;
Topoisomerases tipo II são necessárias para separar moléculas-filhas de DNA
Topoisomerases tipo II desembaraçamas moléculas-filhas de DNA resultantes permanecem ligadas ou concatenas em um cromossomo circular;
A ação dessas enzimas separa facilmente os dois cromossomos-circulares pela quebra de um círculo de DNA e passagem do segundo pela quebra, permitindo sua segregação em células separadas; 
As topoisomerases tipo II são fundamentais para a segregação de longas moléculas lineares;
Apesar de não existir uma ligação topológica inerente aos a replicação de uma molécula linear, o imenso tamanho do cromossomo eucariótico necessita do intricado dobramento do DNA em alças, ligadas a um arcabouço proteico;
Figura 38. A topoisomerase II catalisa o desencadeamento dos produtos de replicação em DNA circular.
A síntese da fita tardia é incapaz de copiar as regiões das extremidades de cromossomos lineares 
A necessidade de um RNA iniciador para iniciar qualquer síntese de um novo segmento de DNA origina um dilema para a replicação das extremidades dos cromossomos lineares;
Problema da replicação das extremidades;
A necessidade de múltiplos iniciadores para completar a síntese da fita tardia implica que uma cópia completa de seu molde não pode ser feita;
Figura 39. Problema da replicação das extremidades
A síntese da fita tardia é incapaz de copiar as regiões das extremidades de cromossomos lineares
Bactérias, alguns vírus bacterianos e vírus que infectam animais resolvem o problema da replicação das extremidades de várias maneiras;
Uma solução é utilizar uma proteína, em vez de um RNA, como iniciador para o último fragmento de Okazaki em cada extremidade do cromossomo;
Figura 40. A iniciação com proteína como uma solução para o problema da replicação das extremidades
A síntese da fita tardia é incapaz de copiar as regiões das extremidades de cromossomos lineares
A maioria das células eucarióticas emprega uma solução diferente para replicar as extremidades de seus cromossomos;
As extremidades de cromossomos eucarióticos são chamas de telômeros e são em geral compostas por repetições in tandem de uma sequência de DNA rica em TG;
Telomerase;
A telomerase é uma nova DNA-polimerase que não requer um molde exógeno
A telomerase, uma ribonucleoproteína, atua alongando a extremidade 3’ de um substrato de DNA;
A telomerase não necessita de um molde de DNA exógeno para adicionar novos dNTPs;
Seu componente RNA serve como molde para a adição telomérica na extremidade 3´ terminal do cromossomo;
A chave para o funcionamento da telomerase é revelada pelo componente RNA da enzima chamada de “RNA da telomerase” (TER). 
Figura 41. Replicação dos telômeros pela telomerase.
A topomerase resolve o problema da replicação das extremidades por meio da extensão da extremidade 3’ do cromossomo
A maquinaria de replicação do DNA da fita tardia;
A telomerase fornece um molde adicional para a maquinaria de replicação da fita tardia;
A ação da telomerase garante que o telômero seja mantido em um comprimento suficiente.
A natureza repetitiva da sequência de DNA inplicam nas variações no comprimento dos telômeros;
Figura 42. A extensão da extremidade 3’ do telômero pela telomerase resolve o problema da replicação das extremidades.
Proteínas de ligação ao telômero regulam a atividade da telomerase e o comprimento do telômero
As proteínas que se ligam a regiõs de dupla-fita do telômero regulam cuidadosamente o comprimento do telômero.
Quando os telômeros são relativamente curtos, poucas proteínas de ligação ao telômero estarão presentes, e a inibição será fraca;
Mecanismo simples de retroalimentação negativa;
Proteínas que reconhecem a forma de fita simples do telômero também podem modular a atividade da telomerase;
Aumentando o tamanho dos telômeros, aumenta a probabilidade de sua ligação aos ssDNA do telômero e a inibição da telomerase.
A ligação dessas proteínas aumenta o nível de inibição;
Figura 43. Regulação do tamanho telométrico por proteínas de ligação ao telõmero.
Proteínas de ligação ao telômero protegem as extremidades dos cromossomos
Em uma célula, normalmente a presença das extremidade de DNA é considerada o sinal de uma quebra de dupla-fita no DNA;
Reparo de DNA;
Proteínas ligadas ao telômero distinguem entre telômeros e outras estremidades de DNA na célula;
A estrutura chamada de alça t;
Quanto mais ocorra o encurtamento dos telômeros maior será a dificuldade para formar a alça t;
O processo dedobramento seria muito mais difícil á medida que o telômero encurta;
Figura 44. Os telômeros formam uma estrutura de alça na célula..