TUTORIAL ESTERILIZAÇÃO REATORES II

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Tutorial de Estudo - Esterilização de Gases
1. Introdução ao assunto: 
a. Qual foi a grande importância do domínio da esterilização de ar para a indústria bioquímica? 
	 Em comparação aos processos químicos industriais, os processos biológicos possuem algumas peculiaridades, justamente por envolverem a conversão de matéria- prima em produto através da ação de micro-organismos. Devido a isso, o desenvolvimento de processos como esterilização de ar possibilitou a condução de técnicas em larga escala em condição de assepsia, em particular, a esterilização de grandes volumes de ar necessários a processos biológicos aeróbios.
b. Todo processo bioquímico requer esterilização do ar de entrada? Durante todo o tempo do processo? Para responder, pense nas diferentes fases do processo e que processos são mais ou menos suscetíveis à contaminação.
	Não, a preocupação com a esterilização do processo provém de um conhecimento prévio sobre a suscetibilidade de contaminação da técnica. Normalmente, levando em consideração um processo fermentativo descontínuo, o período inicial é o mais crítico, pois existe uma alta concentração de substrato e uma baixa concentração de micro-organismos; com o decorrer do processo, a concentração do micro-organismo vai aumentando o que diminui as chances de contaminação do caldo fermentado.
2. Fontes de micro-organismos no ar: 
a. O que são os aerossóis microbianos? 
	São espécies microbianas suspensas no ar atmosférico
b. Qual é, em média, a concentração de micro-organismos no ar? 
	 A concentração de micro-organismos presentes no ar varia de acordo com a localidade analisada, porém, em média os valores ficam entre 10³ partículas/m³ a 12x10³ partículas/m³.
c. Qual a origem dos micro-organismos no ar? Eles se encontram livres no ar ou associados a algum suporte? Esporos tendem a se encontrar livres ou associados?
	 Os micro-organismos presentes no ar atmosférico são provenientes do solo, de plantas, ou ainda, de cursos de água, sendo postos em suspensão pela movimentação do ar ambiente. Esses micro-organismos frequentemente apresentam-se associados a partículas de poeira, com exceção dos esporos que apresentam-se livres. 
d. Como o clima interfere na concentração de micro-organismos no ar?
	O clima interfere drasticamente na concentração de micro-organismos suspensa no ar atmosférico, como exemplo, em um ambiente mais úmido, nota-se uma maior concentração de células vegetativas, já em um clima mais ensolarado, nota-se uma maior concentração de espécies bastante resistentes, tais como, esporo e bactérias.
e. Onde deve ser coletado o ar para um bioprocesso?
	Deve-se evitar que o local de captação seja muito próximo do solo ou ainda, voltado para lugares particulares e sujeitos a um maior nível de contaminação.
f. Qual o tamanho dos micro-organismos presentes no ar? Isso será importante para definir o tamanho adequado de filtros absolutos!
	As dimensões de micro-organismos suspensos no ar apresentam valores da ordem de 0,5 micrometros a 1 micrometro, ou seja, dimensões de bactérias e seus esporos.
3. Amostradores: 
a. Qual é o princípio básico de funcionamento dos amostradores estudados?
	Os amostradores são instrumentos que determinam a concentração de micro-organismos suspensos no ar atmosférico, o princípio básico destes aparelhos, consiste em reter, de alguma forma, os micro-organismos suspensos em um determinado volume de ar, dando-se condições para que essas células possam proliferar, de maneira a tornar possível a contagem de colônias para a quantificação dos contaminantes no volume de ar amostrado.
b. Explique dois dos amostradores estudados, abordando funcionamento, vantagens e problemas associados com seu uso
	Impinger: O impinger é um dos amostradores mais conhecidos e sobre o qual há inúmeras referências. Existem, inclusive, várias versões desse amostrador.
	Funcionamento: Ao se iniciar a amostragem do ar, liga-se a abertura 2 a uma bomba de vácuo, de forma a reduzir a pressão no interior do recipiente. Dessa forma, o ar entrará no amostrador através da abertura 1, borbulhando no líquido coletor através do tubo de vidro, o qual é capilar em sua parte final para gerar bolhas de pequeno diâmetro. Espera-se, portanto, que os microrganismos existentes no ar fiquem retidos no líquido. Terminada a tomada de amostra, o frasco é agitado, a fim de promover a desagregação dos eventuais aglomerados de células, determinando-se, então, a concentração de microrganismos no líquido coletor, através dos métodos usuais de diluições e contagem de colônias em placas. Conhecendo-se a vazão de ar e o tempo de amostragem, conhece-se o volume de ar amostrado, tendo-se, portanto, todos os dados necessários para o cálculo da concentração de microrganismos neste ar.
 
 Imagem do amostrador impinger 
Vantagens: Não é necessário o uso de medidor de vazão de ar, uma vez executada a calibração do aparelho, pois o tubo capilar funciona como um "orifício crítico".
Shipe: Esse outro tipo de instrumento consiste em um erlenmeyer de 125 mL, sendo a entrada do ar feita através de um "orifício crítico". Ele opera de forma similar ao AGI, colocando-se no erlenmeyer 25 mL do líquido coletor e ligando-se a saída de ar a uma bomba de vácuo. Devido à entrada do ar em alta velocidade ser efetuada na superfície do líquido, isto provoca um movimento circular do líquido coletor, sendo importante a localização do orifício de entrada, a fim de evitar uma excessiva umidificação das paredes do frasco.
 
 Imagem do amostrador Shipe 
Vantagens: Esse amostrador não conta com o tubo de entrada, e ainda lança as partículas contra a superfície do líquido coletor que está em movimento. Isso evita a mencionada retenção e também reduz a possibilidade de destruição de células vegetativas.
c. O que é o orifício crítico no amostrador Impinger e qual sua função?
	Orifício crítico significa uma condição de trabalho na qual a relação entre as pressões reinantes nas extremidades do tubo capilar é suficiente para produzir velocidade do ar igual à do som. Essa velocidade não é mais ultrapassada, mesmo que a pressão do lado do vácuo diminua ou oscile abaixo desse valor crítico. Para o ar, a relação de pressões é de 0,53, significando que se a amostragem for efetuada de um ambiente à pressão de 1 atm, a pressão do lado do vácuo deverá ser inferior a 0,53 atm, podendo inclusive oscilar entre valores abaixo deste e, mesmo assim,' a vazão permanecerá constante.
d. Como é feito um teste de efetividade de esterilização e quais micro-organismos são utilizados? (este assunto está abordado no item “Amostradores” mas vai um pouco além do amostrador) 
	Como existem diversas espécies de micro-organismos no ar atmosférico, é difícil assegurar que todas elas consigam crescer e formar colônias contáveis em um único tipo de meio de cultura em um determinado tempo, por essa razão os testes de efetividade são feitos preparando uma suspensão de determinado micro-organismo em ar, previamente submetido à esterilização. Esse ar, artificialmente contaminado com o micro-organismo usado como marcador, é passado através do filtro, determinando-se a concentração (ou o número) de micro-organismos no ar antes e após o elemento filtrante, desde que também se conheça o volume de ar amostrado, medindo-se a vazão de ar e o tempo do ensaio. Pode-se assim quantificar a eficiência de retenção do filtro em teste. O fato de se conhecer o microrganismo empregado para esse tipo de determinação, significa que se conhece perfeitamente o aspecto das colônias que se quer contar (formato, aparência, cor), além de se conhecer o meio de cultura e as condições mais adequadas para a sua proliferação. O micro-organismos mais frequentemente utilizados em teste de eficiência são: Serratia marcescens, Pseudomonas diminuta e esporos de Bacillus subtilis var.niger. 
f. (Questão indicada nos slides) Procure na internet outros tipos de amostradoresde gases, mostrando a figura, indicando a fonte, demonstrando o princípio básico de funcionamento e o preço. 
AMOSTRADOR AR MAS 100 ECO P/INDÚSTRIA DE ALIMENTOS MERCK UND
 
· O amostrador conta com um sistema aberto: Trabalha com placas de petri 90 mm de diâmetro ou placas de contato de 60 mm (necessita suporte). Não exige consumíveis.
· Diferentes meios de cultura podem ser utilizados nas placas de petri: para contagem ou isolamento de micro-organismos.
· Resultados precisos e reprodutibilidade: Possibilita a programação do volume a ser analisado, de 10 a 1000 litros de ar por ciclo.
· Aspira 100L/min com alta precisão. 
· Baseado no princípio descrito por Andersen.
· O aparelho possui um anemômetro calibrado à 100 L/minuto, onde o ar é então aspirado através de uma placa perfurada (400 orifícios).
· As partículas se aderem a superfície do ágar, onde após o termino da amostragem a placa é incubada e as colônias são contadas e expressas em UFC/m3
4. Calor é o segundo método mais usado na indústria para esterilizar ar em bioprocessos. 
a. Como é operacionalizada a esterilização de ar por calor? Aborde o funcionamento do equipamento e as faixas de temperatura e tempo necessários. 
Segundo Borzani, sabe-se que a resistência à destruição de microrganismos, quando submetidos ao calor seco, é bem superior quando comparada à resistência ao calor úmido. Por esse motivo, a esterilização do ar pelo calor seco exige temperaturas relativamente elevadas, assim como tempos de permanência nestas temperaturas também elevados. Ainda, o transporte de microrganismos por partículas sólidas de poeira, em virtude da possibilidade de alguma proteção térmica, acaba contribuindo para a necessidade de condições de esterilização mais drásticas. Como em uma escala industrial a aplicação da esterilização de ar por calor seco acaba sendo bastante complicada por demandar altas vazões de ar, além da dificuldade de fazer com que as temperaturas elevadas sejam alcançadas, esse tipo de esterilização é feita usualmente apenas em aplicações para pequenas instalações Existe uma tabela que relaciona o tempo de permanência do micro-organismo dentro do aparelho e a temperatura demandada para sua destruição e ela é representada abaixo: 
	Temperatura (Graus Celsius) 
	Tempo de permanência (segundos)
	218
	24
	246
	10
	274
	5
	300
	3
Esterilização de ar por calor seco. Ensaios com esporos de Bacillus globigii 
	Em virtude da facilidade de construção e de controle, a esterilização de ar por aquecimento através de resistores elétricos ainda encontra possíveis aplicações, para o caso de ar de exaustão de câmaras assépticas, especialmente quando se trabalha com microrganismos patogênicos, ou para o fornecimento de ar esterilizado para instalações de laboratório ou plantas piloto de pequenas dimensões. O processo consiste em forçar a passagem do ar através de resistores elétricos, onde o ar é aquecido e, através de sistema adequado, obrigá-lo a permanecer o tempo necessário a altas temperaturas.
b. Schmidell (pg 76) cita um equipamento para esterilização da New Brunswick. Pesquise esse equipamento.
 5. Para vencer diversas situações de perda de carga (listadas em aula) é necessário fornecer ar sob pressão aos reatores. Normalmente se usa um compressor para tal. 
a. Qual é a relação da compressão com a esterilização do ar? 
	A compressão do ar acarreta em um aumento de sua temperatura, por esse motivo é necessária a instalação de um sistema de resfriamento do ar após a compressão, para evitar a circulação do ar aquecido, assim como evitar a introdução de ar quente nos reatores, o que complicaria o controle de temperatura, além de possivelmente causar gradientes de temperatura ao longo da altura da coluna líquida em fermentação: Esse resfriamento é efetuado logo à saída do compressor, de forma que o ar permanece aquecido por um pequeno intervalo de tempo (frequentemente inferior a 1 segundo). Experimentos feitos para quantificar a concentração de micro-organismos depois de efetuar a técnica mostraram-se bastante significativos.
b. É possível esterilizar ar com um compressor? 
	Existe menção na literatura a respeito da condução de processos fermentativos com sucesso, sem a presença de sistemas para a esterilização do ar, contando-se apenas com essa destruição de contaminantes durante a compressão. Isso, de forma alguma, deve significar que essa idéia deva ser generalizada e que seriam dispensáveis os sistemas adicionais para a esterilização do ar, especialmente quando se está diante de processos de longa duração e empregando condições e meios de cultivo pouco seletivos.
6. O método mais usado para esterilizar grandes quantidades de ar, ou ar em grandes vazões na indústria e até mesmo em laboratório é a filtração.
 a. Schimidell recomenda um filtro para cada reator, e não uma filtração central e distribuição do ar estéril. Por quê?
 	Segundo Schimidell,esse procedimento centralizado não é conveniente, independentemente das dimensões dos reatores e, portanto, das vazões de ar necessárias, pois coloca-se em risco todo o conjunto de reatores, caso ocorra a falha do sistema de filtração. A eventual economia que se possa fazer, quanto ao investimento inicial, não justifica o risco que se irá correr ao longo da operação da planta.
 b. O que são filtros absolutos e em profundidade? c. Quais as características de cada um deles? Classifique-as como vantagens ou desvantagens.
	
	Os filtros de membranas microporosas, elaboradas a partir de materiais poliméricos, em geral apresentando características hidrofóbicas, proporcionam a retenção dos aerossóis microbianos na superfície do elemento filtrante, havendo portanto a retenção apenas por impacto direto das partículas contra o filtro, o qual apresenta poros de dimensões menores do que os microrganismos a serem retidos. Normalmente· utilizam-se membranas com poros de 0,2 ou 0,22 m, ou ainda membranas de 0,45 m. Essa é a razão pela qual esses filtros são também chamados de filtros absolutos. 
	Nos filtros absolutos, em princípio, a retenção dos microrganismos independe da velocidade de passagem do ar, ao contrário dos filtros de camadas fibrosas, mas o aumento da velocidade superficial do ar acarreta um aumento da perda de carga no elemento filtrante. Além disso, velocidades excessivas podem provocar vibrações inconvenientes, comprometendo os sistemas de vedação.
	Os filtros de profundidade são feitos de um emaranhado de microfibras que formam uma minúscula rede capaz de reter até partículas bem finas, menores do que nosso olho é capaz de enxergar.
	São produzidos principalmente com polímeros, celulose ou vidro, separadamente ou compostos. Apesar da formação de uma rede geralmente aleatória de caminhos tortuosos onde as partículas são retidas em toda a profundidade do filtro (daí vem a nomenclatura), há como se determinar um valor estimado do tamanho dos poros formados e, consequentemente, rotular um valor nominal médio dos tamanhos de poro. Mas isso não quer dizer que partículas maiores obrigatoriamente ficarão retidas e nem que partículas menores irão passar facilmente.