Coloração de Gram

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Disciplina: Microbiologia Geral 
DAIANE STEFANIE 
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 
Técnica de Coloração de Gram 
 A técnica de coloração de Gram é uma técnica de coloração diferencial que permite 
distinguir os dois principais grupos de bactérias por microscopia óptica. 
Foi descoberta pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Este cientista 
obteve com a coloração realizada uma melhor visualização das bactérias em amostras de 
material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este método 
o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 
sem ter conseguido que fosse reconhecida a devida importância ao seu método de coloração. 
 Atualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, 
sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia. 
 A técnica de coloração de Gram consiste em expor as células bacterianas à seguinte 
sequência: 
Corante primário – violeta de cristal: cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo 
de célula. 
Mordente – solução de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a célula e forma 
com o corante um complexo insolúvel dentro da célula. 
Agente descolorante – álcool, acetona ou ambos: solvente lipídico. 
Contrastante – safranina ou fucsina básica: cora o citoplasma de vermelho. 
 O que se verifica, quando se observam as diferentes bactérias sujeitas a esta coloração 
ao microscópio, é que estas têm um comportamento diferente face à coloração de Gram, o que 
permite classificá-las em: 
Bactérias Gram-positivo (apresentam cor púrpura - roxo) 
Bactérias Gram-negativo (apresentam cor vermelha - rosa) 
 
Desta forma, podemos resumir o resultado da coloração de GRAM em duas formas: 
• bactérias GRAM positivas: ficam azuis, pois não permitem a entrada do agente diferenciador. 
• bactérias GRAM negativas: ficam vermelhas, pois permitem entrada do agente diferenciador. 
 
Processo de coloração e as bases quimico-estruturais dos resultados. 
 
Processo da coloração de GRAM: A partir do esfregaço 
a . violeta de Ginciana (mínimo de 1 min) - Lavar com água 
b . lugol (Iodo + Iodeto K) - mínimo 1 min 
c . agente diferenciador: álcool + acetona – 20 segundos – Lavar do água 
d . safranina ou fuccina diluída: contracoloração . 
 
 
Nota - Parede celular: formada por camadas múltiplas externamente à membrana plasmática. Há 
uma camada mais interna que é composta por peptideoglicana envolta por uma camada mais 
externa (varia espessura e composição química). A peptideoglicana confere resistência a meios 
de baixa pressão osmótica como a água, sendo responsável pelo suporte estrutural e também 
mantém a forma característica da bactéria. A peptideoglicana é um açúcar com grupos amina 
sendo uma estrutura estável. 
 
Diferenças entre as paredes das bactérias GRAM positivas e GRAM negativas: 
• GRAM positivas: 
 - camada de peptideoglicana é mais espessa e algumas também possuem uma camada de 
ácido teicóico externa à camada de peptideoglicana. 
 
Nota - ácido teicóico: é uma estrutura anti-gênica importante, reconhecida pelo sistema imune 
(induz formação de anticorpos espécie - específicos). São encontrados na camada externa da 
parede celular de GRAM +. Alguns polímeros de ácido teicóico penetram através da camada de 
peptideoglicana, ligando-se covalentemente aos lipídeos da membrana citoplasmática, sendo 
agora denominada de ácido lipoteicóico, enquanto outros se ligam ao ácido murâmico da 
peptideoglicana. 
• GRAM negativs: 
 - camada externa composta por lipopolissacarídeos, lipopoliproteínas e fosfolipídeos. Há o 
espaço periplasmático - entre membrana citoplasmática e camada de peptideoglicana - que em 
alguma espécies contém B - lactamases (degrada penicilina) e B - lactâmicas. 
 - tem parede mais fina, porém mais complexa. 
 - possui endotoxinas (lipopolissacarídeos). 
 - deixa entrar agente diferenciador porque tem lipídeos. GRAM + não. 
 
Considerações importantes 
• Algumas bactérias são pleomórficas em relação à coloração GRAM, logo se coram 
irregularmente. 
• A lisozima ataca paredes de bactérias GRAM positivas, havendo uma forma involutiva. A 
lisozima se encontra nas lágrimas, suor e saliva e consegue romper o esqueleto da 
peptideoglicana, permitindo que exista uma resistência natural do hospedeiro à infecção 
bacteriana. 
• Estreptococos produzem autolisinas que ficam na sua parede, permitindo a entrada do agente 
diferenciador. Com isso, a bactéria apresenta coloração GRAM negativa devido à forma de 
involução. 
• Propriedade tintorial: é qualificar a bactéria em GRAM positiva ou GRAM negativa. 
• Bactérias GRAM positivas podem se tornar GRAM negativas ao sofrer uma modificação em 
sua membrana. 
• Bactérias tratadas com lisozima perdem sua parede, mas se forem tratadas em um meio à 
mesma pressão osmótica que seu interior ficam arredondadas - esferoplastos e os protoplastos. 
• Bactérias GRAM negativas não pode se tornar GRAM positivas. 
• Forma L: são as GRAM negativas ou GRAM positivas que perdem suas paredes. 
• Bactérias GRAM positivas são mais susceptíveis à penicilina G do que as GRAM negativas. 
Nota: As proteínas porinas têm importante função na regulação do transporte de pequenas 
moléculas hidrofílicas para o interior da célula. Formam trímeros, funcionando como um canal 
inespecífico. 
 
Referências Bibliográficas 
1. Microbiologia; terceira edição; Luis Trabulsi, Flávio Alterthum, Olga Gompertz, José Alberto 
Candeia; editora Atheneu;1999. 386p.