Coloração de Gram

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Coloração de Gram
Somente peptidoglicano; (não possui
membrana externa);
Peptidoglicano espesso;
Ácidos teicóicos (especificidade
antigênica);
Em células álcool-ácido resistentes,
contém ácido micólico;
Mais sensível e menos permeável; 
Gram positiva
Gram negativa
LPS + Peptidoglicano;
Peptidoglicano fino;
Membrana externa (só existe na Gram
negativa): carga negativa e serve como
uma barreira (mais permeável) para
(detergentes, metais pesados, sais
biliares, antibióticos particulares), mais
suscetíveis à quebra;
Porinas - proteínas que fazem canais
que passam água, glicose, nutrientes
para dentro da célula; (é uma forma de
permeabilidade para célula);
Polissacarídeos O – açúcar presente na
membrana externa da Gram negativa;
auxilia na sorologia;
Lipídio A (endotoxina); relacionado ao
processo de febre;
Lipopolissacarídeo LPS – antígeno
relacionado à febre, estimula a resposta
inflamatória;
Importância: antigenicidade (antígeno O);
Virulência (lipídeo A); Hidrofocidade
(estrutura hidrofóbica, tornando a célula
menos permeável); Auxilia na sorologia
(por exemplo, para E.coli, Salmonella).
Essas bactérias que possuem LPS
apresenta hidrofocidade, ou seja, torna a
célula menos permeável. Porém, os
antibióticos ainda passam pelas porinas.
OBS: Lipopolissacarídeo LPS:
Mecanismo da coloração de Gram
Cristais de cristal violeta-iodo formam-se
na célula;
Corante rosa-avermelhado, sofranina;
Álcool desidrata peptidoglycam;
Cristais CV-I não saem.
Álcool dissolve a membrana externa e
deixa buracos em peptidoglycan;
CV-I liberado.
Gram positivo:
Gram negativo:
Coloração de Gram
Coloração de Gram
É um dos mais importantes métodos de
coloração utilizados em laboratórios de
microbiologia e de análises clínicas;
Diferencia as bactérias de acordo a
composição a espessura da camada de
peptidoglicano;
O método consiste em tratar
sucessivamente um esfregaço
bacteriano, fixado pelo calor, com os
reagentes cristal violeta, lugol, etanol-
acetona e fucsina básica;
As bactéricas que adquirem a coloração
azul violeta são chamadas de Gram-
positivas e aquelas que adquirem a
coloração vermelho são chamadas de
Gram-negativas.
1) Coccos gram positivo em cachos; 
2) Bacillus gram negativo; 
3) Cultura mista, coccos em cadeia gram
positivo e bacillus gram negativo.
OBS: Imagens: 
Passos da coloração
Corante primário, o cristal violeta,
seguido de tratamento com um fixador, o
lugol. 
Tanto bactérias Gram-positivas quanto
Gram-negativas absorvem de maneira
idêntica o corante primário e o fixador,
adquirindo uma coloração violeta devido
à formação de um complexo cristal
violeta-iodo, insolúvel, em seus
citoplasmas.
Coloração de Gram
Segue-se um tratamento com um
solvente orgânico, o etanol-acetona. 
O solvente dissolve a porção lipídica das
membranas externas das bactérias
Gram-negativas e o complexo cristal
violeta-iodo é removido, descorando as
células. 
Por outro lado, o solvente desidrata as
espessas paredes celulares das bactérias
Gram-positivas e provoca a contração
dos poros do peptidoglicano, tornando-
as impermeáveis ao complexo; o corante
primário é retido e as células
permanecem coradas. 
A retenção ou não do corante primário é,
portanto, dependente das propriedades
físicas e químicas das paredes celulares
bacterianas tais como espessura,
densidade, porosidade e integridade.
Em seguida, a amostra é tratada com um
corante secundário, a fucsina (safranina)
básica. 
Ao microscópio, as células Gram-
positivas aparecerão coradas em violeta
escuro e as Gram-negativas em rosa. 
Resumo dos passos
1) Fazer esfregaço do microrganismo em
lâmina;
2) Colocar o primeiro corante na lâmina
(violeta cristal);
3) Colocar um mordente (a base de iodo
– forma um complexo com o cristal
violeta);
4) Lavar com solvente (normalmente
álcool ou acetona), dissolve a membrana
externa (gram negativa) e a célula perde
a coloração; Logo, visualizamos a gram
positiva e não a gram negativa;
5) Colocar o segundo corante (safranina
ou fucsina), a membrana externa volta e
conseguimos visualizar a gram negativa
novamente;
6) Lavar com abundante água e secar;
7) Observar ao microscópio ótico com
lente de 100.
Coloração de Gram
Prática
Pincel, lápis dermatográfico, salina,
lâmina (vidro), alça descartável, cepa
bacteriana, lixo para descarte.
Marcar colônias isoladas da cepa
bacteriana; identificar as lâminas no
verso (lado contrário ao esfregaço); 
Colocar a salina (para conseguir espalhar
a cultura bacteriana) na lâmina e
transferir as colônias para a lâmina;
Com a alça descartável, transferir as
colônias para a lâmina e realizar o
esfregaço (esperar um tempo para secá-
lo);
Circular, com o lápis dermatográfico, o
verso da lâmina para visualizar melhor a
colônia;
Materiais:
Etapas:
Fixar lâminas em chama para “grudar” as
células no vidro e para matar as
bactérias;
Apoiar as lâminas em uma base;
Utilizar o corante cristal violeta (roxo) por
1 minuto, para o corante conseguir
entrar na célula – ambas as bactérias
(gram positivas e gram negativas) ficarão
com a coloração roxa;
Após o tempo, lavar a lâmina com água
destilada (retirar o excesso de corante);
Utilizar o lugol por 1 minuto (mordente
que segura o cristal violeta dentro da
célula) - ambas as bactérias (gram
positivas e gram negativas) ficarão com
a coloração roxa, o lugol não interfere na
coloração;
Após o tempo, lavar a lâmina com água
destilada; 
Utilizar o lugol por 1 minuto (mordente
que segura o cristal violeta dentro da
célula) - ambas as bactérias (gram
positivas e gram negativas) ficarão com
a coloração roxa, o lugol não interfere na
coloração;
Coloração:
Coloração de Gram
OBS: É importante lavar com álcool-
acetona por apenas 10 segundos, pois
um tempo maior pode romper a
membrana interna da gram negativa;
Utilizar o corante safranina por 30
segundos – gram positiva continua com
a coloração roxa e a gram negativa com
a coloração rosa-avermelhada; 
Por fim, colocamos o óleo de imersão
(para o aumento de 100) no microscópio
para a visualização das bactérias. 
No caso de inverter a ordem da
utilização dos corantes (fucsina, álcool
diluído, cristal violeta, lugol) ambas as
bactérias (gram positiva e gram
negativa) ficarão roxas. 
Por exemplo, bactéria Staphylococcus
aureus (normalmente grupo dos cocos
gram positivos em roxos) e bactéria
Escherichia coli (normalmente do grupo
dos bacillus gram negativos em rosa-
avermelhado);
Logo, a bactéria Staphylococcus aureus
apresentará a mesma coloração roxa
(gram positiva), mas a Escherichia coli
apresentará coloração roxa (quando sua
coloração deveria ser rosa-avermelhada,
gram negativa).
OBS: Inversão da técnica
Priscila - Nutri/UFES