rtPCR - Biologia molecular

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rtPCR - PCR em tempo real 
BioMolBioMol
O que é?
O que precisa?
Características
Denaturação
É uma técnica que permite ampliar fragmentos codificantes de RNAm.
Técnica de sensibilidade alta, mesmo em concentrações pequenas é
possível ampliação.
Etapas
- Tampão;
- Temperatura: A temperatura é aumentada para 95°C afim de romper as pontes
de hidrogênio e dissociar a dupla fita de DNA, formando 2 fitas simples
Anelamento
Extensão
- Se caso repetirmos esse ciclo de 3 etapas inúmeras vezes, iremos gerar
 várias moléculas de DNA idênticas e o seu aumento será exponencial.
Quem faz isso?
Termociclador com fluorescência:
Responsável por fazer os ajustes de 
 temperatura para que todas as etapas
ocorram e capaz de detectr os sinais de
fluorescência.
- O nível de fluorescência aumenta de maneira proporcional ao aumento do
número de cópias do alvo na reação;
- A temperatura de melting de um fragmento de DNA depende do seu
tamanho (quantidade de bases) e da sua proporção entre G/C e A/T;
- Há duas fases da qPCR que nos interessa mais: fase platô para análises
qualitativas e fase exponencial para análises quantitativas.
- Baixamos a temperatura de 95°C para mais ou menos 60°C, tornando o
 ambiente estável para promover as ligações de hidrogênio;
- Os primers com sequências específicas do fragmento alvo que queremos
 amplificar são adicionados e se anelam as regiões que eles são 
 complementares. 
- Aumenta a temperatura de 60°C para 72°C; 
- A TAC polimerase é uma enzima que é mais resistente a se associa ao primer
para começar a adicionar nucleotídeos a fita de DNA;
- A TAC polimerase só vai adicionar nucleotídeos na fita molde no sentido
 5'-3';
- Após fazer a complementariedade, teremos 2 novas fitas;
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Fluorescência
Agentes fluorescentes
- Após passar pelas 3 etapas as amostras vão ser analisadas a partir de um
 processo de fluorescência;
- A intensidade da fluorescência aumenta de maneira proporcional ao aumento
 do número de cópias do alvo na reação
 - Intercalante da fita de DNA;
 - Inespecífico: Pode se ligar a qualquer DNA fita dupla e não apenas o seu alvo;
 - Mais barato;
 - Necessário adicionar um passo a mais nas análises(curva de dissociação) 
SYBR Green
Como ocorre?
 - Sondas de hidrólise;
 - Oligonucleotídeo de sequência específica;
 - Emite fluorescência em diferentes cores (multiplex);
 - Mais caro
 - Ocorre a desnaturação e, em seguida, a inserção da sonda TacMan que irá 
 se ligar de uma maneira específica no fragmento alvo de uma das fitas de 
 DNA e logo depois os primers são inseridos;
Sondas TacMan
 - Na extremidade 5' terá uma molécula que será o agente fluorescente
 chamada ''reporter'', que vai ser responsável por gerar a fluorescência de
 maneira proporcional a amplificação do fragmento alvo;
 - Na extremidade 3' terá uma molécula chamada ''quencher'' que pode ser
 fluorescente ou não que irá ser responsável por inibir a fluorescência da
 reporter quando esta estiver localizada próxima a ela, fazendo com que a
 fluorescência não vá para o meio;
 - Após isso a DNA polimerase chega e vai fazendo a adição de nucleotídeos;
 - A DNA polimerase quando vai fazer a adição de nucleotídeos na outra fita
 de DNA que contém a sonda, quando ela encontrar a sonda, ela vai quebrá-la
 e, assim, com esse oligonucleotídeo rompido e a molécula reporter longe
 geograficamente da quencher, não terá sua fluorescência inibida e irá
 conseguir emitir o comprimento de luz.
Amplificação do dna
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 - Há um momento da PCR em que ela consegue emitir fluorescência
 exponencialmente de acordo com o número de cópias de DNA que são
 formadas (fase exponencial), mas após algum tempo em que ela vai chegando
 aos seus momentos finais a eficiência diminui e deixa de duplicar a cada ciclo,
 devido as condições desfavoráveis do meio (fase platô).
Análises qualitativas
 - Identificação de patógenos;
 - Identificação de espécies;
 - Detecção de mutação;
 - Genotipagem de SNP;
Análises quantitativas
 - Análise de expressão gênica;
 - Quantificação de carga viral;
 - Quantificação de microRNA
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