Separação e identificação de aminoácidos por cromatografia em papel

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RELATÓRIO DE AULA PRATICA
BIOQUÍMICA 
Separação e identificação de aminoácidos por cromatografia em papel
Nomes: Lorean Rafael 978
 Marcela Queiroz 1553
 Eduardo Reis 2416
Introdução
A separação dos componentes de uma mistura por cromatografia baseia-se na diferença de afinidade desses componentes fases que estão no contato direto. Uma delas movimenta-se (fase móvel), enquanto a outra permanece estacionária (fase estacionária). Durante o processo de cromatografia, a fase móvel desloca-se sobre a fase estacionária. Os componentes da mistura, que inicialmente são aplicados em uma das extremidades da fase estacionária, são distribuídos entre as duas fases de tal forma que cada um terá velocidade de migração diferenciada. Esta depende de sua maior afinidade por uma ou outra fase.
I. Classificações da cromatografia
Cromatografia gasosa: a fase móvel é um gás inerte, sendo nitrogênio, hélio, argônio, hidrogênio e dióxido de carbono os mais utilizados.
Cromatografia líquida: a fase móvel é um líquido, podendo-se utilizar substâncias puras ou misturas.
Cromatografia supercrítica: a fase móvel é um fluido supercrítico, sendo o dióxido de carbono supercrítico um dos mais usados.
II. Mecanismos de separação
Sorção e dessorção: ocorrem quando a fase estacionária é um sólido.
Partição: ocorre quando a fase estacionária é um líquido.
Troca iônica: a fase estacionária é constituída por uma matriz contendo grupos ionizáveis positivos e negativos, e a fase móvel geralmente é uma solução iônica.
Exclusão molecular: a fase estacionária é composta de partículas porosas.
III. Cromatografia em papel
É baseada no mecanismo de partição, em que a separação se faz devido às diferenças de solubilidade dos componentes de uma mistura em duas fases líquidas, levando-se em conta seu coeficiente de partição (a).
a = ([S]E)/([S]M) em que, 
[S]E representa a concentração do soluto na fase estacionária e [S]M, a concentração do soluto na fase móvel. 
Na cromatografia em papel, a fase estacionária é formada pela água ligada à celulose, principalmente por ligação de hidrogênio. O papel atua apenas como suporte. 
A fase móvel, em geral, é um solvente puro ou uma mistura de solvente que apresenta polaridade menor do que a água.
A identificação das substâncias faz-se por meio do fator de retenção (Rf), pelo uso da seguinte expressão.
Rf = distância percorrida pela substância
 distância percorrida pela fase móvel
Em condições experimentais definidas, o Rf é uma constante física própria de cada substância e seu valor de 0 a 1. Assim, a identificação pode ser feita comparando-se o Rf do composto com os valores de Rf dos padrões.
Objetivo Geral
Ao final da prática, entenderemos o processo cromatográfico, e, por meio da cromatografia em papel, separarmos e identificarmos os componentes de uma mistura contendo aminoácidos.
Materiais
 UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA 	
	CAMPUS UFV FLORESTAL
Equipamentos e utensílios:
Papel Whatman n° 1, em retângulo, de 15 x 20 cm
Forro de papel
Cuba cromatogáfica com tampa
Tubos capilares 
Pulverizador
Estufa ajustada para 90-100 °C
Lápis
Régua 
Reagentes
Soluções de aminoácidos 0,1 mol L¯¹ (alanina, ácido aspártico e isoleucina) e duas misturas contendo dois aminoácidos cada.
Solvente misto: n-butanol: ácido fórmico: água (100: 30: 25)
Revelador: solução de ninidrina 0,1% em acetona.
Materiais de Segurança
EPI’ s :
Óculos de proteção,
Jaleco,
Reagentes em capela,
Sapato fechado,
Calça jeans.
Cuidados necessários:
O papel não pôde ser tocado diretamente com as mãos, pois existem aminoácidos na pele que poderiam mascarar o resultado do nosso trabalho. 
Procedimentos:
1. Em uma folha de papel traçada por linhas 2 cm entre si foi escrito o nome das soluções a serem aplicadas.
2. Com o auxílio de um capilar, foram adicionadas as amostras no papel na parte destinada e deixou-se secar a folha.
3. A folha de papel foi introduzida em um pote contendo o solvente previamente saturado, evitando-se que o solvente alcançasse o local onde foram aplicadas as amostras.
4. Foi vedado o pote e deixado até que o solvente subisse por capilaridade a uma altura adequada da folha de papel.
5. Logo depois, o papel foi levado à estufa para que fosse secado à aproximadamente 100ºC.
Com um auxílio de um pulverizador foi aplicado um revelador (ninidrina) sobre toda a área percorrida pelo solvente e levada novamente para a estufa a fim de secar e revelar as manchas deixadas pelas amostras.
Resultados
· Alanina: subiu relativamente pouco sobre a folha de papel (pouca afinidade com o solvente).
· Isoleucina: subiu muito pela folha de papel (teve muita afinidade com o solvente).
· Ácido aspártico: quase não se mexeu na folha de papel (teve pouquíssima afinidade com o solvente).
· Amostra desconhecida 1: uma parte subiu a mesma distância que a alanina e outra parte subiu a mesma distância que a isoleucina. 
· Amostra desconhecida 2: uma parte subiu a mesma distância que o ácido aspártico e outra parte subiu a mesma distância que a isoleucina.
	
Discussão
A cromatografia em papel é uma técnica qualitativa, baseada no mecanismo de partição, em que a separação se faz devido as diferenças de solubilidade dos componentes de uma mistura em duas fases liquidas, levando em conta o seu poder de interação.Para isso montou-se o equipamento necessário para a realização da cromatografia em papel, sendo que usamos três aminoácidos padrão (Alanina, Isoleucina e Acido Aspártico) para termos referencia sobre as duas misturas a quais queríamos identificar M1 e M2.Realizamos os procedimentos indicados mas no final não obtivemos o resultado esperado por motivos variados: ou nosso revelador estivesse muito velho sendo assim com seu poder mais fraco, ou por erro de diluição na hora do preparo do mesmo,mas vendo a provável falha o professor Inácio preparou um revelador mais concentrado e obteve o sucesso no experimento, onde conseguimos observar o deslocamento dos aminoácidos que se dar pela interação entre o aminoácido e o solvente misto no papel observamos que a alanina tem uma interação media com o solvente e a isoleucina tem uma interação bastante forte com o solvente já o acido aspártico não interage quase nada com o solvente, e com base na interação dos aminoácidos primários (alanina, isoleucina e acido aspártico) e o deslocamento realizado por cada amostra em sua “baia” vimos que a mistura 1 (M1) é composta por: Alanina e Isoleucina e a mistura 2 (M2) é composta por: Acido Aspártico e Isoleucina. 
Conclusão
Com o procedimento experimental realizado conclui-se que a partir de uma técnica de cromatografia em papel podemos identificar e separar diferentes aminoácidos tendo base no seu deslocamento e interação com o solvente.
Referências bibliográficas
RIBON, O. B. Andréa – Práticas de Bioquímica – Viçosa, MG; Ed. UFV, 2007;
CLARK JR, J.M. – Bioquímica Experimental 1. Ed. Zaragoza,1966.