Separação e Identificação de Aminoácidos por Cromatografia em papel

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Separação e Identificação de Aminoácidos 
por Cromatografia em papel 
 Conceitos: 
 Cromatografia – deriva do grego 
Chrom – cor 
Graphe – escrever 
 
 Amplamente usada na separação de 
componentes de uma mistura, segundo 
propriedades físicas dos seus 
componentes. 
 
 Usada pela primeira vez por Mikhael S. 
Tswett (1906) 
Experimento: componentes coloridos de 
extratos de folhas e de gema de ovo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Objetivo: 
Separar, identificar e quantificar os 
componentes de uma mistura. 
 
 
 Princípio da técnica 
Diferentes substância – diferentes 
propriedades – diferentes associações 
 Duas fases presentes: 
 Fase móvel – contém o solvente, 
 Fase estacionária – permanece 
imóvel. 
Durante a corrida cromatográfica, a fase 
móvel desloca-se pela fase estacionária. 
A mistura (amostra) desloca-se junto com a 
fase móvel sendo que este deslocamento é 
de acordo com sua afinidade pelas fases. 
 
À medida que a fase móvel se desloca, 
substâncias são separadas na fase 
estacionária. 
 Classificação dos tipos de 
cromatografia: 
 Forma física dos sistemas 
Cromatografia plana, 
Cromatografia em coluna. 
 
 Propriedades da fase móvel e 
estacionária 
Gasosa, 
Líquida, 
Supercrítica. 
 
 Princípio de separação 
Sorção e dessorção, 
Partição, 
Troca iônica, 
Exclusão molecular, 
Afinidade. 
*A cromatografia em coluna é a mais 
utilizada nas indústrias e nas pesquisas. 
 
Introdução 
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Fase estacionária é a água ligada à celulose do 
papel por ligações de hidrogênio. 
A celulose do papel atua apenas como suporte 
(o papel Whatman no1 é o mais usado). 
A fase móvel é um solvente puro ou uma 
mistura de solventes que apresentam 
polaridade menor que da água. (solvente misto: 
n-butanol, água, ácido fórmico; na proporção 
100:25:30) 
A cromatografia em papel é um exemplo típico 
de separação por partição líquido-líquido. 
*Variações da técnica – tipo de papel, 
polaridade da fase móvel (normal ou reversa), 
direção do movimento da fase móvel 
(ascendente e descendente – mono e 
bidirecional). 
 
 
Entender o processo cromatográfico e por 
meio de cromatografia em papel, separar e 
identificar os componentes de uma mistura 
contendo aminoácidos. 
 Preparar um sistema adequado para a 
execução experimental de 
cromatografia de aminoácidos, 
 Executar as operações necessárias à 
cromatografia ascendente, 
 Revelar o cromatograma usando 
ninhidrina, 
 Identificar os aminoácidos no 
cromatograma pelos seus valores de 
Rf, 
 Definir fase móvel, fase estacionária, 
cromatografias mono e bidirecional e 
cromatografia ascendente. 
 
 
 
Aula Teórica 
Objetivo Geral 
Objetivos Específicos 
Material 
Cuidados necessários 
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1. Marcação horizontal com lápis no papel, 
2. Fazer um cilindro com o papel e 
grampear, 
3. Colocar o cilindro em uma cuba 
cromatográfica, 
4. Esperar um tempo (cerca de 1 hora), 
5. Depois desse tempo, secar o papel e 
aplicar ninhidrina. Voltar a secar 
ninhidrina, porque ela vai ser mais 
efetivamente visível quando for aplicado 
calor nela. 
6. Aplicar os valores de Rf e interpretar os 
resultados. 
Quais os valores de Rf calculados para cada 
mancha (mistura e padrões)? 
Quais os aminoácidos encontrados na mistura? 
Inicialmente marca-se o papel cromatográfico 
com um lápis e auxílio de uma régua. 2 cm de 
altura e distância de 5 cm entre os pontos de 
aplicação de amostra. 
Anota-se debaixo de cada ponto de aplicação 
os aminoácidos que serão aplicados como 
amostra. (1°- ácido aspártico, 2°- isoleucina, 3°- 
prolina e 4°- amostra que é uma mistura de 
aminoácios). 
Então já é possível aplicar as amostras no 
papel. Para isso, encosta-se o capilar no líquido 
das amostras e por capilaridade a amostra 
sobe. 
 
Daí encosta-se levemente no papel, no ponto 
marcado, logo a amostra está aplicada. 
Depois dessa etapa, enrola-se o papel em 
formato cilíndrico e grampeia-se as duas 
extremidades. 
Na cabine de exautão, o papel é colocado 
dentro da cuba cromatográfica e espera-se 
por cerca de 1 hora. 
Após esse tempo de espera, retira-se o papel 
da cuba e seca-o na estufa. Então aplica-se 
a ninhidrina e volta com o papel para estufa 
para depois analisar os resultados. 
Delimitou-se as regiões dos aminoácidos. É 
preciso então apontar o centro de cada 
mancha. 
Depois mede-se do ponto até o início da 
corrida. (Ácido Aspártico - 0,9 cm; Isoleucina 
- 5,5 cm; Prolina - 1,0 cm). Na mistura teve-
se (marcação inferior (b) – 1,0 cm, marcação 
superior (a) – 5,5 cm). 
A fase móvel percorreu 9,5 cm em toda 
corrida. 
 
Com esses valores foi possível calcular os 
fatores de retenção das substâncias padrões 
e das amostras problemas. 
 
 
 
 
 
 
Métodos 
2,0 cm 
5,0 cm 
Resultados e Discussão 
Aula Prática 
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Os aminoácidos encontrados na mistura foram 
prolina e isoleucina, pois os valores de Rf em a 
e b foram os mesmos da amostra de isoleucina 
e prolina, podendo ser identificados nessa 
mistura. Assim, aminoácidos podem ser 
encontrados através da cromatografia em 
papel, comparando seus fatores de retenção 
para a identificação e separação de cada 
aminoácido. 
*Prolina tem uma coloração amarelada e as outras uma 
coloração mais roxa/violeta. 
Resultado do experimento: