Gabarito dos exercícios de DNA recombinante

Prévia do material em texto

Gabarito das questões do seminário: Aula de Tecnologia do DNA Recombinante
CAPÍTULO 29 Lehninger
1. Quais os dois tipos de corte da enzima Endonuclease de restrição tipo 2? Os dois
tipos de cortes são corte em extremidade adesivas e corte em extremidades cegas.
No corte em extremidades adesivas, as enzimas de restrição farão cortes coordenados nas duas fitas
do DNA, deixando de dois a quatro nucleotídeos de uma fita sem par em cada extremidade
resultante. Isso porque, haverá a formação de pares de bases entre si ou com extremidades adesivas
complementares de outros fragmentos de DNA.
O corte do tipo extremidades cegas ocorre quando as enzimas clivam ambas as fitas do DNA nas
ligações fosfodiésteres opostas, sem deixar nenhuma base sem par nas extremidades.
2. De 2 exemplos das aplicações de DNA recombinante.
A tecnologia do DNA recombinante tem aplicação em estudos genômicos e de regulação de um
gene ou de um conjunto de genes, no desenvolvimento de vacinas e em terapias gênicas. Por meio
dessa tecnologia, podem ser obtidos organismos transgênicos. Com isso, podem ser criados
vegetais ou animais resistentes a substâncias, podem ser desenvolvidos organismos mais
produtivos e animais e vegetais transgênicos que possam auxiliar na produção de medicamentos
ou vacinas. Também podem ser produzidos hormônios, medicamentos, enzimas e proteínas.
Auxiliam também no diagnóstico médico de doenças genéticas e infecciosas e contribuem na
tecnologia forense para a resolução de crimes e na realização de teste de paternidade.
3. Quais são as características importantes em um vetor de clonagem? E quais são os tipos
existentes destes vetores e em que devemos nos basear para a escolha de um deles?
Os vetores de clonagem possuem locais de reconhecimento para enzimas de restrição, tem uma
origem de replicação, que permite a replicação no hospedeiro, devem possuir tamanho pequeno,
necessitam ser estruturas de fácil isolamento e precisam permitir que a sua multiplicação aconteça
dentro da célula, mesmo com um elevado número de cópias.
Existem alguns tipos de vectores de clonagem, entre eles estão: plasmídeos, bacteriofagos,
cosmídeos, cromossomos artificiais em bactérias (BAC’s), cromossomos artificiais em leveduras
(YAC’s) e vírus. A escolha depende do tamanho do fragmento de interesse que queremos
armazenar.
4. Quais as características importantes de um vetor de expressão? Em que circunstâncias são
utilizados?
Os vetores de expressão são vetores de clonagem que possuem todos os elementos genéticos que
permitem a expressão de proteínas recombinantes. Os vetores de expressão devem possuir regiões
promotoras que possam ser reconhecidas e ativadas pelo hospedeiro para que ocorra a transcrição
do gene de interesse, permitindo que a construção gênica seja expressa pelo organismo hospedeiro.
Devem possuir também um sítio de múltipla clonagem que é a região em que o fragmento a ser
expresso será inserido. O vetor também precisa possuir um marcador permitindo que as células que
foram incorporadas sejam selecionadas e quantificadas.
A escolha do vetor está condicionada a definição da estratégia de clonagem que será realizada e
deve ser baseada no organismo ou célula em que se deseja que a proteína seja expressa.
5.O plasmídeo PBR322, apresentado abaixo, foi muito utilizado na clonagem de fragmentos
de DNA de interesse.
Ele possui resistência tanto à ampicilina quanto à tetraciclina
e vários sítios únicos de clonagem (PstI, EcoRI, BamHI,SalI
e PvuII).
Se um fragmento de DNA foi clonado no sítio de PstI, como
você procederia para identificar os clones recombinantes
após transformação em E.coli?
As colônias deverão ser semeadas em meio de cultura contendo o antimicrobiano ampicilina. As
células que não sobreviverem são células que foram recombinadas. Quando o fragmento exógeno
é inserido na região PstI, o gene ampR não é expresso e com isso a bactéria não irá crescer em um
meio com o antibiótico ampicilina.
6)O cDNA da insulina humana foi clonado no sítio de
BamHI do vetor pUC18 (mapa abaixo) O plasmídeo
recombinante foi inserido em E. coli
competente (transformação) e as colônias recombinantes
foram plaqueadas em meio de cultura sólido contendo
ampicilina, X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D
galactopiranosídeo) e IPTG (isopropiltiogalactosídeo).
Neste caso, como se reconhece os clones recombinantes?
Explique.
Quando adicionamos um fragmento exógeno de DNA ao DNA plasmídeal, o gene que produz a
enzima beta-galactosidase é destruído e com isso ele não é expresso. Sendo assim, as colônias de
bactérias que possuírem o plasmídeo com a enzima beta- galactosidase, intacta em seu interior, irão
produzir colônias de cor azul. Enquanto, as colônias de bactérias que tiveram seu genoma
integrado ao plasmídeo, a enzima beta-galactosidase não será produzida e com isso a enzima não
irá realizar a quebra do composto químico X- GAL presente no meio de cultura. Então, como
resultado da inserção do novo DNA recombinante, as colônias bacterianas terão coloração branca.
7)Quais são as ferramentas disponíveis para a transformação bacteriana? Explique. As
bactérias podem incorporar um DNA exógeno por um mecanismo químico ou pelo método da
eletropuração. Na forma química, as células e o DNA plasmidial são incubados juntos a 0°C em
uma solução de cloreto de cálcio e, em seguida, serão submetidos a um choque térmico, alterando
rapidamente a temperatura para entre 37°C e 43°C. As células bacterianas frequentemente
utilizadas são da espécie E. coli, mas outras espécies bacterianas também podem ser utilizadas
como hospedeiro. Na eletroporacao, as células incubadas com o DNA plasmidial são submetidas a
um pulso elétrico de alta voltagem, tornando a membrana bacteriana temporariamente permeável a
moléculas grandes.
8)Um DNA plasmidial foi cortado com várias enzimas. Infelizmente, a pessoa estava
distraída e não registrou qual enzima foi utilizada em cada mistura de reação (1 a 6). Análise
a eletroforese de agarose, para verificar o mapa de restrição do plasmídeo pVu1, abaixo
desenhado.
BamH1 = 6
Pvu1 = 3
Pvu1/BamH1 = 2
BamH1/Hind3 = 1
Hind3/ Pvu1 = 4
BamH1/Hind3/Pvu1= 5