Aula 7 - Eletroforese

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Tecnologia Genética
Eletroforese
INSTRUTOR: Nathália Delvaux
nathalia.ramos@ibmr.br
ELETROFORESE EM GEL
● Separar partículas por tamanho.
● Migração de uma partícula (proteínas ou ácidos nucléicos) carregada sob influência
de um campo elétrico, permitindo a separação das partículas, determinando as
proporções relativas.
● Sob condições de corrente elétrica constante, a força de deslocamento de uma
partícula é resultado de carga efetiva, da composição do tampão e da resistência do
meio usado como suporte (ágar, gel, poliacrilamida).
● Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. Por essa
razão, a eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseada apenas
no tamanho.
Partículas com + bases nitrogenadas
Partículas com - bases nitrogenadas
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MATRIZ
AGAROSE (NÃO TÓXICA)
● Polissacarídeo extraído de algas marinhas.
● Forma uma rede que separa moléculas com diâmetro ≥ 10nm. (poros grandes)
● Polimerização mais rápida.
Polimerização é o nome do processo químico que resulta na formação de macromoléculas
(moléculas grandes) denominadas de polímeros, mediante a combinação de moléculas
menores, os monômeros.
POLIACRILAMIDA (TÓXICA)
● Acrilamida. (Composto químico (C3H5NO) produzido industrialmente e usado em
produtos como corantes, plásticos, produtos químicos)
● Forma uma rede que separa moléculas com diâmetro < 10nm. (fragmentos
menores) (poros pequenos)
● Usada na análise de proteínas
● Polimerização mais lenta.
● Coloração?
○ Coomassie Brilliant Blue
○ Impregnação pela Prata
INSUMOS
● Tampão de carregamento (loading buffer). (água salina, confere densidade)
● Marcadores (ladder). (referência) (padrão, mostra a quantidade de bn)
● Coloração?
○ SybrSafe
○ Gel Red (Atóxicos)
○ Gel Green
○ Brometo de Etídio (Mutagênico)
■ Intercala-se com a molécula de DNA.
■ Radiação UV estimula essa ligação e é visível no transiluminador.
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AGAROSE EM GEL
PREPARO E APLICAÇÃO
● Concentração do gel de agarose:
1%, 1,5%, 2%, 3%
● 1g de agarose em 100mL de tampão
(solução salina) ⇢ gel 1%
● Amplicon + Tampão de
carregamento
CORRIDA E ANÁLISE
● O corante “separa” as fitas do DNA.
INTERPRETAÇÃO DA ELETROFORESE
● As amostras de DNA são depositadas nos poços (cavidades) localizados numa das
extremidades de um gel, e uma corrente elétrica é aplicada para fazê-las avançar
pelo gel.
● Os fragmentos DNA estão carregados negativamente, então movem-se na direção
do eletrodo positivo.
● Os fragmentos menores atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores.
● Smear: Grande arraste no gel de agarose (erro)
Causas:
Degradação do template
Degradação do amplicon
Erros na PCR
Erros na Eletroforese
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