ESTUDO DIRIGIDO ELETROFORESE (2)

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA
ALUNO: VINÍCIUS DA CRUZ DOS SANTOS
DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA CCS020 (P8)
ESTUDO DIRIGIDO ELETROFORESE
1.A eletroforese em gel de agarose é usada para separar fragmentos de DNA de
tamanhos diferentes :
a. Explique o princípio
A eletroforese em gel de agarose consiste na fragmentação do DNA ou de outras
macromoléculas a partir do transporte gerado pelas cargas elétricas desse gel. Por
conta do tamanho e da carga as moléculas se difundem através do gel em
diferentes direções e velocidades, permitindo que se separem.
b. Como é o procedimento?
A agarose será embebida por um tampão aquecido composto de água e sal. O
objetivo do tampão é manter o pH numa faixa de variação aceitável para que não
haja interferência no DNA. Depois de ser aquecida e deixada para esfriar, a agarose
irá formar um gel sólido, apresentando em um uma extremidade cavidades, onde
serão colocadas as moléculas de DNA. Em seguida coloca-se uma voltagem, o polo
em que está o DNA irá receber o eletrodo negativo e o polo contrário irá receber o
eletrodo positivo. Com a aplicação da voltagem o DNA irá se mover em direção ao
polo com o eletrodo positivo, isto acontece por conta da carga negativa que o DNA
possui quando o pH está em condições fisiológicas, devido aos grupos fosfatos
presentes em sua cadeia principal. Por fim os fragmentos de DNA poderão ser
observados sob luz ultravioleta.
c. Quais são as aplicações?
A eletroforese em gel de agarose pode ser aplicada para realizar teste de
paternidade, para detectar patógenos, para detectar o DNA em locais de crime, etc.
d. Quais são as vantagens?
Dentre as vantagens da aplicação da eletroforese em gel de agarose estão o baixo
custo, facilidade de execução e a precisão nos resultados.
e. Quais são as desvantagens?
A desvantagem da eletroforese é o uso do brometo de etídio, um pigmento aplicado
na solução para que possa ser observado as faixas de DNA. O brometo de etídio é
uma substância mutagênica e oferece riscos para quem manipula o experimento e
todos os que frequentam o laboratório onde está sendo realizado.
f. Após os fragmentos de DNA serem separados por eletroforese em gel, como eles
podem ser visualizados? Explique o princípio.
Após a separação dos fragmentos, pode-se observar o gel com faixas de diferentes
tamanhos. Adiciona-se um pigmento no gel e depois coloca sob luz ultravioleta, para
que o DNA brilhe e possa ser observado em toda a extensão do gel.
2. A eletroforese em gel de poliacrilamida pode ser usada para separar fragmentos
de DNA de tamanhos.
a. Explique o princípio?
O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA é baseado na carga
negatival de uma fita de DNA. Portanto, íons livres , moléculas de DNA ou
fragmentos de DNA em uma solução podem ser separados aplicando–se uma certa
voltagem. Ao final do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao catodo
(positivo), que atrai, devido à polaridade, moléculas de carga negativa. O gel de
poliacrilamida forma uma malha constituída por uma rede de polímeros que permite
a migração de moléculas. .
b. Como é o procedimento?
A variação da porcentagem de poliacrilamida no gel permite alterar o tamanho dos
poros do gel, o que significa que podemos separar diferentes tamanhos de proteína
em diferentes porcentagens das concentrações de géis.Uma vez iniciada a
polimerização, o gel é vertido entre 2 placas de vidro e deixado polimerizar
completamente. A mistura de gel é composta em tampão de eletroforese (Tris-HCl),
que fornece os íons para a formação da corrente na eletroforese. Muitas vezes, o
gel é derramado em 2 partes. A primeira parte é um gel de resolução, com um pH
em torno de 8,8, o que diminui a migração das proteínas. Em cima do gel de
resolução, é derramado um gel de empilhamento, com um pH de 6,8 e, com poros
maiores. Esse gel de empilhamento trabalha para comprimir as amostras de
proteínas em uma frente fina de migração, de modo que todas as proteínas da
amostra cheguem ao gel de resolução ao mesmo tempo, levando a uma migração
relativa precisa. Ao contrário da eletroforese em gel de agarose, em que os géis são
moldados em bandejas e executados horizontalmente, os géis SDS-PAGE são
moldados verticalmente usando o gel caster. Os géis são moldados dessa maneira,
para que ambos os géis, de empilhamento e resolução, formem um gel contínuo, e
permite que uma quantidade muito maior de proteína seja carregada no gel.
A cuba vertical de gel de eletroforese também é dividida em 2 seções. Dependendo
do fabricante, a cuba de eletroforese terá uma câmara superior(interna) e uma
câmara inferior (externa). Essas duas câmeras são ligadas pelo gel de
poliacrilamida para criar um circuito contínuo. Cada câmara contém um eletrodo,
negativo na câmara interna e positivo na câmara externa.
A câmara interna entra em contato com o topo do gel e, quando um campo elétrico
é aplicado, as proteínas se direcionam para o eletrodo positivo na câmara tampão
externa, devido às cargas negativas das moléculas de SDS. Os tampões típicos
para SDS-PAGE são Tris-Glicina para as câmaras tampão e Tris-HCl para o gel.
c. Quais são as aplicações?
Pode ser aplicada em estudos acadêmicos da área da biologia celular e molecular.
d. Quais são as vantagens?
A eletroforese em gel de poliacrilamida é vantajosa pois consegue separar e
visualizar fragmentos de DNA de menores tamanhos, além do gel ser mais
transparente, elástico com uma quantidade de poros controláveis e uma maior
compatibilidade com compostos químicos.
e. Quais são as desvantagens?
Não pode ser utilizada para separar fragmentos de DNA maiores que 1 kilobyte.