Apostila_Micro_práticas

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS 
CURSO DE AGRONOMIA 
DEPARTAMENTO DE SOLOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MICROBIOLOGIA DO 
SOLO 
 
(APOSTILA DIDÁTICA – AULAS PRÁTICAS) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prof. Sandro José Giacomini 
Prof. Celso Aita 
Profª. Zaida Inês Antoniolli 
 
 
 
 2
 
MICROBIOLOGIA DO SOLO 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. NUTRIÇÃO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS ................................................ 3 
2. DISTRIBUIÇÃO DE MICRORGANISMOS ........................................................... 11 
3. ENRIQUECIMENTO, ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DE CULTURAS 
MICROBIANAS ............................................................................................................. 18 
4. COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS PARA MICROSCOPIA ...................................... 22 
5. TESTES BIOQUÍMICOS ...................................................................................... 25 
6. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS ................................. 32 
7. ATIVIDADE MICROBIANA DO SOLO. ................................................................. 40 
8. BIOTRANSFORMAÇÕES DO NITROGÊNIO NO SOLO ..................................... 45 
9. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS ............................................. 49 
10. MICRORGANISMOS E A ESTABILIDADE DE AGREGADOS DO SOLO ........... 52 
11. MICORRIZAS ....................................................................................................... 54 
 
 
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AULA PRÁTICA 1 – Nutrição e Cultivo de Microrganismos 
Assim como todas as formas de vida, os microrganismos requerem certos 
nutrientes e fatores físicos básicos para sustentar a vida. Microrganismos distintos 
requerem diferentes conjuntos de nutrientes, sendo geralmente necessários sob uma 
ou outra forma específica. Entender tais necessidades é fundamental para termos 
sucesso no cultivo dos microrganismos em laboratório. 
 
Necessidades nutricionais 
No laboratório as necessidades nutricionais dos microrganismos são fornecidas através 
de meios de cultura. 
 
O uso de meios de cultura adequados é fundamental para possibilitarmos o 
crescimento e a manutenção de microrganismos em laboratório a fim de realizar o 
estudo desses organismos vivos. 
Para que os microrganismos possam crescer a partir de um meio de cultura, o mesmo 
deve fornecer três categorias fundamentais de nutrientes: 
Fonte de energia 
Fonte de componentes para fabricação de células 
Fatores de crescimento (para alguns micróbios) 
 
Existe uma infinidade de alimentos que podem suprir todos estes requisitos, mas nem 
todos os microrganismos têm as mesmas exigências. A habilidade de um 
microbiologista está na capacidade de seleção dos componentes próprios que farão um 
meio de cultura adequado para um dado microrganismo. 
 
A. FONTES DE ENERGIA: 
• Compostos Orgânicos: açúcares, amido, proteínas, gorduras. 
• Compostos Inorgânicos: NH4+, S, H2S, Fe++, H2 
• Luz. 
 
B. FONTE DE PRECURSORES CELULARES (CHONSP): 
 Formas como são absorvidos: 
• Carbono - CO2 (autotróficos) ou compostos orgânicos (heterotróficos). 
• Hidrogênio e Oxigênio - H2O e O2 do ar. 
• Nitrogênio 
- Orgânico: proteínas, aminoácidos 
- Inorgânico: NH4+, NO3-. 
• Enxofre 
 - Orgânico: aminoácidos (metionina, cisteína) 
- Inorgânico: SO4-- 
• Fósforo - normalmente como fosfato inorgânico (PO4-) 
• Outros: como íons Ca++, Mg++, K+, Fe++. 
 
C. FATORES DE CRESCIMENTO 
São substâncias que alguns microrganismos não conseguem sintetizar a partir de seus 
nutrientes principais. Deverão ser introduzidos no meio de cultura, pois sua ausência limita o 
crescimento de organismos que não conseguem sintetizá-los. Ex: vitaminas Tiamina, Biotina, 
Piridoxina, Cobalamina, Ácido Nicotínico. 
Meio de cultura: 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
______________________________________________ 
User
Nota
em uma grama de solo pode haver de 2000 e 8,3 milhões de baterias 

não há recomendação de aplicação de N na oja ddevido a SIMBIOSE 
assocaçãoda planta com as bacteriass do solo
User
Nota
para o cultivo o microorg precisa :1 nutrientes necessarios disponiveis
2 oxigenios entre outros gases quando necessario
3 umidade
4 ph e temperatura adequado
5 meios livre de compostos que podem interderir
6 ausensia de microorganismos contaaminates
User
Nota
material nutriente / solução nutritica utilizada para promover o cescimento dos microorganismos 

NO SOLO
esses bacterias se alimentam de coisas em decomposição 
 4
 
além das necessidades de nutrientes os microrganismos para crecerem necessitam d 
efonte de energia e elétrons. 
 
Fonte de carbono, energia e elétrons 
Fonte de Carbono Classe nutricional 
CO2 Autotróficos 
Carbono orgânico Heterotróficos 
Fonte de energia 
Luz Fototróficos 
Compostos orgânicos e inorgânicos Quimiotróficos 
Fonte de elétrons 
Compostos inorgânicos Litotróficos 
Compostos orgânicos Organotróficos 
 
 
 
 
TÉCNICAS ASSÉPTICAS: conjunto de procedimentos 
 
Na natureza os microrganismos existem como populações mistas e dentro dessas populações, 
várias formas e tipos fisiológicos podem ser encontrados. Entretanto, para o estudo e 
conhecimento de um microrganismo específico, precisamos trabalhar com CULTURAS PURAS 
(espécie isolada) crescendo em ambientes livres de contaminação de outras formas de vida. 
Somente através de TÉCNICAS ASSÉPTICAS conseguiremos estudar microrganismos 
separadamente. 
- 
 
 
MEDIDAS DE ASSEPSIA (comumente utilizadas): 
 
• Exclusão de propágulos do ar - 
 
• Desinfecção - 
 
• Flambagem - 
 
 
MEIO DE CULTURA: Uma grande variedade de meios de cultura são empregados pelo 
microbiologista para isolamento, crescimento e manutenção de CULTURAS PURAS. 
Microrganismos são cultivados em água à qual nutrientes apropriados tenham sido 
adicionados, normalmente em forma solúvel. A solução aquosa contendo tais nutrientes 
necessários ao desenvolvimento do microrganismo é chamado de Meio de Cultura. 
 
 
 
PRODUTOS COMUMENTE UTILIZADOS NA MONTAGEM DE MEIOS DE CULTURA: 
 
• PEPTONAS: 
 
 
 
 
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• EXTRATOS: 
 
 
 
 
• AGAR: 
 
 
 
 
• ELEMENTOS TRAÇO: 
 
 
 
 
MEIOS DE CULTURA 
 
 Devido à inexistência de um meio de cultura universal, a escolha do meio dependerá do 
organismo com o qual estamos manipulando e do direcionamento do trabalho que estamos 
executando. Existem livros com receitas para a preparação de meios de cultura para vários 
grupos de microrganismos de interesse para a saúde pública, indústria de alimentos, 
contaminação do ambiente, doenças em plantas e animais, etc... 
 
Classificações: 
 Em um primeiro instante dividimos os meios de cultivo em: 
• Definidos- 
 
 
• Indefinidos- 
 
 
 
A partir desta primeira classificação, dividimos os meios de cultura nas seguintes 
categorias, de acordo com sua aplicação ou função: 
 
I. Meios líquidos (sem ágar): 
1. Naturais: (indefinidos): Animais - leite, sangue; Vegetais- suco de frutas, extrato de 
levedura. 
2. Artificiais/sintéticos: a-(definido): meios para nitrificadores, fixadores de nitrogênio, 
Czapec-Pitt para fungos. 
 b- (Indefinido): caldo de carnes, caldo de peptona. 
 
II. Meios sólidos: (com ágar-ágar, sílica-gel, gelatina, etc.) 
 
III. Meios seletivos: A adição de certas substâncias químicas específicas ao ágar-nutritivo 
previne o crescimento de um grupo de microrganismos sem agir sobre os outros. 
Ex: A inclusão de Rosa Bengala ou estreptomicina no meio de cultura usado para os 
fungos irá impedir o crescimento de bactérias. 
Usando Nistatina no meio para bactérias, esta substância irá impedir o crescimento de 
fungos. 
 
IV. Meios diferenciais: A adição de certos reagentes ao meio pode distinguir os tipos de 
bactérias.Por exemplo adicionando-se vermelho congo (substância química), no meio de 
Rhizobium (Manitol Congo Vermelho Agar), as bactérias contaminantes do gênero 
Agrobacterium podem assimilar a cor vermelha e as colônias de Rhizobium não (incolor). 
Desse modo, pode-se estabelecer a distinção entre duas bactérias da mesma família. 
User
Nota
O ágar é um agente solidificante, que é bastante usado para deixar alimentos como sorvetes e geleias mais espessos.
extraido de algas
O ágar se liquefaz a uma temperatura próxima de 80 º C (temperatura de ebulição da água) e ao nível do mar permanece liquido até que a temperatura diminua a cerca de 40 ºC ficando solido.

O ágar possui propriedades muito importantes para microbiologia. Pois poucos microrganismos conseguem degradar o ágar, e, portanto ele permanece sólido quando é adicionado ao meio de cultura (material nutriente que é usado para o crescimento de microrganismos em laboratório).

alguns microorgansmos necessitam ser mantidos a temperaturas maiores e o agar consegue ficar solida nessas temperaturas proximas de 40 graus
User
Nota
O Ágar Nutriente é um meio de cultura relativamente simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de Microbiologia.

Sendo composto geralmente por extratos de carne e levedura, o ágar nutriente é utilizado para cultivo de microrganismos pouco exigentes nutricionalmente, como por exemplo: Escherichia coli e Streptococcus pneumoniae.
User
Nota
a composição quimia não é conhecida
criptona; extrato de carne 

n se conhece quanto tem de nitrogenio ou carbono por xemplo
User
Nota
é aquele no qual todos os constituintes são conhecidos
User
Nota
´´selecionam´´ determinados rupos de microorganismos 
User
Nota
meios redutores 
cresiemnto anaerobios

meio de enriquecimento

para isolar bacqteria em pequno numero q estao juntass com outras em grande quantidades
 6
 
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA: 
 
Exemplo de preparação de um meio comum, para organismos aeróbicos, onde as 
seguintes etapas devem ser seguidas: 
 
1. Cada ingrediente é pesado e dissolvido no volume de água destilada, conforme a receita do 
meio que desejamos preparar. 
2. Determina-se o pH do meio fluido, ajustando-o se for necessário, de acordo com o indicado 
na receita. Pode-se aferir o pH por meio de indicadores ou de um potenciômetro. Para elevar o 
pH ou diminuí-lo , adiciona-se NaOH sol. 1N ou HCl sol. 1N, respectivamente. A reação deve 
ser favorável aos microrganismos em estudo, seja ácida (fungos), básicas ou neutras 
(bactérias, actinomicetos). 
3. O meio é esterilizado em autoclave. Para preparação de meios sólidos, deve ser adicionado 
o ágar, um substrato obtido a partir de algas marinhas (Gelidium spp.). O ágar suporta 
perfeitamente a autoclavagem a 121oC. Os géis permanecem líquidos acima de mais ou 
menos 45oC. 
4. O meio é distribuído em recipientes adequados (tubos, frascos), cujas bocas são fechadas 
com algodão e cobertas com papel. 
5. Caso o meio não seja utilizado no momento, este deve ser armazenado ao abrigo de 
contaminações e à temperatura baixa. 
 
 
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ESTERILIZAÇÃO 
 
Esterilização é o processo de remoção ou morte de todas as formas de vida de um 
material ou ambiente. É essencial em quase todos os trabalhos em microbiologia. O principal 
objetivo na esterilização além de matar as formas de vida é causar o mínimo de danos ao 
material que está sendo esterilizado. (Trocas químicas ou físicas nos componentes do meio ou 
condições abióticas do meio). 
ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um 
material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos. 
 
DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes 
num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou 
local. 
 
ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, 
superfície ou local. 
 
ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por 
exemplo, através do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal. 
 
LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de 
desinfecção ou esterilização. 
 
 
 Processos de esterilização: 
 
1) CALOR - a esterilização pelo calor é utilizada para materiais que não sofrem 
alterações a altas temperaturas. O calor atua sobre os microrganismos coagulando e oxidando 
suas proteínas. 
 
 1.1) CALOR SECO - O processo de oxidação das proteínas dos microrganismos(morte) 
é resultante da condução do calor ao objeto contaminado. O equipamento utilizado para este 
tipo de esterilização é o FORNO DE PASTEUR. Os materiais esterilizáveis são vidrarias 
laboratoriais - PLACAS DE PETRI, TUBOS DE ENSAIO, PIPETAS, e materiais metálicos. 
Placas e vidrarias devem permanecer no forno por 2 - 4 horas a uma temperatura de 160 - 180 
°C. 
 
 1.2) CALOR ÚMIDO E PRESSÃO* - Apresenta maior poder de penetração no material 
que o calor seco, portanto possui maior poder de esterilização. 
 * AUTOCLAVAGEM - O aparelho que usa o vapor de água sob pressão regulada, 
chama-se AUTOCLAVE. Consiste, essencialmente, em uma câmara de vapor com parede 
dupla, equipada com dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor e sua 
manutenção em determinadas temperaturas e pressão por qualquer período de tempo. Em sua 
utilização, é absolutamente necessário que o ar existente na câmara seja completamente 
substituído por vapor saturado. No entanto, não é a pressão que mata os microrganismos e 
sim a temperatura elevada do vapor. 
 A autoclave é utilizada para esterilizar meios de cultura, tubos para diluição, água em 
frascos, soluções, solo + água etc.... Geralmente o autoclave é operado numa pressão de 15 
libras por polegada (1 atmosfera = 121oC ), durante 15 ou 20 minutos. Quando o volume de 
materiala esterilizar for grande devemos aumentar o tempo de esterilização. 
 
2) FILTRAÇÃO - Consiste na passagem de um fluido através de uma substância porosa 
(filtro) com o fim de remover as partículas nele dispersas. Alguns produtos, particularmente os 
LÍQUIDOS BIOLÓGICOS (algumas vitaminas , enzimas, antibióticos) são TERMOLÁBEIS, isto 
é, são destruídos pelo calor. A opção válida, neste caso, é a esterilização por filtração. O 
diâmetro dos poros varia, mas deve ser menor do que 0,45 micra, para evitar a passagem de 
microrganismos. 
 8
 
3) ESTERILIZAÇÃO GASOSA- Utilizada para materiais que não podem ser 
esterilizados pelo calor nem pela filtração. A vantagem do método é a capacidade de 
esterilizar a temperatura ambiente, entretanto apresenta um custo mais alto e requer um maior 
tempo. 
 
4) FLAMBAGEM: 
 
 
 
 
5) IRRADIAÇÃO: 
 
 
 
 
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QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS - AULAS PRÁTICAS 
 
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia deve 
ser capaz de responder as seguintes questões: 
 
1) Um meio chamado “Meio Ágar Nutritivo” contém, entre outras substâncias, o agar 
cuja função é fornecer nutrientes aos microrganismos. Afirmação verdadeira ou 
Falsa? Comente. 
 
2) Diferencie os termos: 
a) esterilização e desinfecção. 
b) bactericida e bacteriostático. 
 
3) ....................................... é um processo que mata todas as formas de vida 
microbiana. 
 
4) Um agente que mata todas as formas vegetativas de microrganismos mas não 
necessariamente as formas esporuladas é denominado .................................... . 
 
5) Afirmação verdadeira ou falsa: 
( ) uma substância ou processo que mata ou inibe o desenvolvimento de 
microrganismos é chamado de agente antimicrobiano. 
( ) o sufixo -cida refere-se aos agentes que matam os microrganismos. 
( ) o sufixo o sufixo –stático refere-se aos agentes que inibem os microrganismos. 
( ) as bactérias na sua forma vegetativa são mais susceptíveis ao calor em relação 
às suas formas esporuladas.( ) o aparelho que utiliza vapor sob pressão é denominado Forno de Pasteur. 
( ) o aparelho que utiliza calor seco é denominado autoclave. 
( ) bactérias do gênero Bacillus são formadoras de endosporos o que lhes confere 
grande resistência ao calor elevado. Células vegetativas deste Bacillus são 
destruídas a 82o C. 
( ) a exposição de materiais contaminados a água fervente é provável que 
possibilite uma desinfecção mas não esterilização. 
( ) a esterilização de pequenos objetos (tubos de ensaio contendo meio de cultura) 
pela autoclavação pode ser realizado a 121oC por 15 minutos. 
 
6) A esterilização de vidrarias de laboratório pelo calor seco requer uma temperatura 
de pelo menos .............. oC por .............. minutos. 
 
7) Qual método de esterilização é apropriado para: 
a) bandeja com morangos? 
b) Meio ágar nutriente? 
c) Vidrarias? 
d) Alça de platina? 
e) Solução de vitaminas sensível ao calor? 
f) Condimentos enlatados? 
 
8) Três culturas bacterianas de Bacillus sp., Pseudomonas sp. e Clostridium foram 
aquecidas em água fervente durante dez minutos. Provavelmente qual dos cultivos 
está esterilizado? Porque para as demais isso é menos provável? 
 
 10
9) Algumas bactérias podem viver com poucas substâncias .................................. 
como seu único requerimento nutricional, enquanto outras bactérias requerem 
substâncias .................................... complexas. (orgânicas/inorgânicas). 
 
10) O crescimento de microrganismos em laboratório é denominado cultivo: 
(a) in vitro; (b) in vivo; (c) in situ; (d) in utero. 
 
11) Os principais elementos químicos para o crescimento celular incluem 
..................................., ..............................., hidrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. 
 
12) Para que tipo de microrganismos os compostos orgânicos servem como uma fonte 
de energia e como uma fonte de carbono na síntese das unidades estruturais? 
(a) Autotróficos; (b) heterotróficos; (c) fixadoras de nitrogênio; (d) bactérias 
halofílicas; (e) bactérias barofílicas. 
 
13) Os ......................................são os organismos que fazem uso de dióxido de carbono 
como sua fonte principal de carbono. (autotróficos / heterotróficos) 
 
14) Qual dos seguintes itens representa mais precisamente a principal fonte de carbono 
usada pelos heterotróficos? 
(a) dióxido de carbono; (b) somente açúcar; (c) somente aminoácidos; (d) 
compostos orgânicos; (e) compostos inorgânicos. 
 
15) Indique se a afirmação é verdadeira ou falsa: 
( ) O processo pelo qual algumas bactérias utilizam nitrogênio gasoso como uma 
fonte de nitrogênio para a célula é chamado de fixação de nitrogênio. 
( ) O processo de fixação de nitrogênio consiste na conversão de N2 a NH3. 
 
16) O nitrogênio é um elemento essencial dos ................................., que são unidades 
estruturais das proteínas. 
 
17) Os ........................................... contam com os compostos químicos para obter 
energia, enquanto os fototróficos dependem de ..................................... para obter 
energia. 
 
18) Se a composição química exata de um meio é conhecido, o meio pode ser descrito 
como: 
(a) complexo; (b) enriquecido; (c) seletivo; (d) quimicamente definido; (e) 
diferencial. 
 
 
 
 
 
11 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
1. DISTRIBUIÇÃO DE MICRORGANISMOS 
 
Embora os microrganismos estejam presentes em todos os locais, não é fácil 
demonstrar a sua presença por observação microscópica direta se estes não se encontrarem 
em grandes números. Se um meio de cultura esterilizado for exposto ao ar ou inoculado com 
amostra de materiais como solo, água e leite, os microrganismos adicionados juntos a estes 
materiais, caso as condições de meio e incubação forem satisfatórias, poderão ser observados 
macroscopicamente, pela formação de COLÔNIAS. 
COLÔNIAS - 
 
 
 Para provar a hipótese de que microrganismos estão presentes em um ambiente 
específico, é necessário que o material e equipamentos, inclusive os meios de cultura, estejam 
esterilizados e também que TÉCNICAS ASSÉPTICAS (evitar contaminação) sejam 
empregadas quando realizamos as inoculações e/ou transferências. O exercício ilustrará a 
ampla distribuição microbiana e introduzirá o aluno aos procedimentos assépticos comuns, mas 
de extrema importância para pessoas ligadas ao ramo microbiológico. 
 
MATERIAL: 
- Meios de cultura esterilizados. (Fórmulas estão no final deste capítulo). 
- Placas de Petri esterilizadas 
- Pipetas esterilizadas 
- Tubo de ensaio com água esterilizados 
- Amostra de solo, água, ar, etc. 
 
PROCEDIMENTO; 
Trabalhar em grupos. Discutir o procedimento entre o grupo, até entenderem o que 
deve ser feito e os objetivos. 
 
1. Desenrolar as placas de Petri. Não abrir para não contaminar. (abrir somente no momento 
certo, ou seja, na hora de derramar o meio de cultura). 
2. Rotular a placa com o nome do grupo, material inoculado, meio (use a placa que vai receber 
o meio, ou seja, a parte de baixo da placa). 
3. Colocar nas placas o material sendo analisado para presença de microrganismos. (use 
técnicas assépticas). Espalhar a amostra para dispersar os micróbios. 
4. Incubar as placas invertidas (de cabeça para baixo para evitar dessecamento). 
5. Os microrganismos que aparecerem nestas placas serão observados na próxima aula. 
 
* Controle: Pegar uma placa com meio de cultura e incubar. Esta placa não pode apresentar 
microrganismos após a incubação, pois não foi colocado inóculo. 
 
Meio de cultura para bactérias: Agar nutritivo 
Composição: 
- Peptona...............................................5g 
- Extrato de carne..................................3g 
- Glicose................................................5g 
- Agar...................................................15g 
- Água destilada.............................1000ml 
 
Meio de cultura para fungos: BDA (batata-dextrose-ágar) 
Composição: 
- Batata...............................................200g 
- Dextrose(açúcar)................................20g 
- Agar....................................................15g 
- Água............................. ...............1000ml 
 12
 
 
 
 Método para preparar um litro de meio de cultura (BDA): 
1) Cozinhar 200g de batata em um litro de água até ponto de maionese; 
2) Filtrar a batata e aproveitar o decoto completando com água até 1000ml; 
3) Em um erlenmeyer de 2 litros colocar 20g de açúcar, 16g de agar e 50 mg de sulfato de 
estreptomicina. 
4) Colocar no erlenmeyer o decoto (água da batata) junto com o açúcar, agar e estreptomicina; 
5) Misturar os componentes; 
6) Esterilizar o meio em autoclave por 20 minutos; 
7) Distribuir o meio autoclavado em placas de Petri previamente esterilizadas na câmara de fluxo. 
Obs.: O meio deve ser distribuído a uma temperatura de aproximadamente 50-60oC. 
 
 
O MUNDO DOS MICRÓBIOS: EXAME MICROSCÓPICO DE INFUSÕES DE FENO 
 O mundo microbiano contém uma vasta variedade de criaturas. O objetivo deste 
experimento é introduzir o estudante à apreciação do tamanho, morfologia e ecologia de algas, 
protozoários, fungos e bactérias. Micróbios são organismos de tamanho muito pequeno, 
quando comparados a organismos visíveis a olho nu. São também em sua maioria 
constituídos por uma só célula (unicelulares), não chegando a formarem tecidos diferenciados, 
o que dificulta a sua observação, sendo a sua visualização somente possível com o uso de 
microscópios. VOCÊ CONSEGUE IMAGINAR UM MICRORGANISMO? Apesar de seu 
pequeno tamanho o observador nunca deve esquecer que micróbios são tridimensionais, ou 
seja, possuem largura, comprimento e altura. As bactérias em forma de coccus, por exemplo, 
são como uma bola de futebol em miniatura, a diferença é que na célula ao contrário do ar na 
bola de futebol, nós temos água, e nesta água, estão dissolvidas muitas proteínas (com 
funções enzimáticas ou não), o material genético (DNA) também está boiando neste líquido,os 
ribossomos e outras estruturas necessárias ao crescimento celular estão todos dispersos neste 
líquido celular. Apesar de seu pequeno tamanho são poderosos, por sintetizarem enzimas em 
seu interior que permitem a decomposição e reciclagem de muitos elementos (C,H,O,N,P,S, e 
muitos outros) que fazem parte de moléculas orgânicas como a celulose e lignina presentes em 
todos os vegetais. Muitos tipos diferentes de microrganismos crescem e se multiplicam na 
natureza quando existe disponibilidade adequada de alimentos e água e quando a temperatura 
é apropriada. 
 Um grande número e tipos diferentes de microrganismos irão se desenvolver em uma 
infusão de feno (grama cortada ou feno, colocados em água e deixando parado por um período 
de tempo, podendo esta infusão ser colocada em presença de luz ou não). Certas bactérias 
podem absorver as substâncias solúveis do feno enquanto outros podem participar na 
decomposição ativa e solubilização das frações não solúveis, tais como proteínas grandes e 
polissacarídeos, celulose e lignina. Conseqüentemente, o número e os tipos de organismos 
presentes podem variar com diferentes infusões e tempo de incubação. A medida que as 
populações de bactérias e leveduras (decompositores primários) aumentam, o número de 
protozoários (consumidores primários) aumenta, pois estes se alimentam de bactérias.
 O tipo de atividade metabólica (aeróbica, facultativa ou anaeróbica) de organismos 
heterotróficos, particularmente de bactérias saprofíticas, continua até que todos os compostos 
orgânicos sejam mineralizados. Neste meio tempo, se a infusão é deixada na luz, organismos 
fotossintéticos, particularmente cianobactérias (“algas-verde-azuladas”) e clorophyta (algas 
verdes) começam a se multiplicar rapidamente. Estes organismos são fotoautotróficos, pois 
utilizam a luz como fonte de energia e usam o gás carbônico (CO2) do ambiente, como fonte de 
carbono para fazer células, ao invés de carbono orgânico, tais como carboidratos e 
aminoácidos. Conseqüentemente eles são considerados como produtores primários 
(convertem CO2 para carbono orgânico). Eventualmente estes morrem e seu “tecido” é 
decomposto, liberando material orgânico celular para bactérias heterotróficas e o ciclo 
continua. Esta imensa e complicada cadeia alimentar, com produtores, decompositores e 
consumidores, é chamado de ECOSSISTEMA. 
 
13 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
 Enquanto alguns micróbios na infusão de feno são imóveis, outros são ativamente 
móveis. Eles possuem controle no seu movimento, facilitado por flagelos, cílios, e alguns 
micróbios se movem por arraste. O flagelo e cílios de protozoários e algas eucarióticas podem 
ser vistos em microscopia, mas os flagelos de bactérias não são visíveis uma vez que o seu 
tamanho está bem abaixo do poder de resolução do microscópio comum. 
 
Para estudar os micróbios presentes em uma infusão de feno é necessário fazer 
montagens de lâminas úmidas. O procedimento para fazer estas preparações é bastante 
simples: 
Ø Use uma pipeta de Pasteur para pegar uma amostra de material das bordas da 
superfície de folhas e talos e também do fundo do vidro com a infusão de feno. 
Coloque uma gota do material coletado em uma lâmina de microscópio. 
Ø Cubra a gota de material com uma lamínula evitando ao máximo deixar bolhas de ar 
sob a lamínula. Se um excesso de fluído escapar pelas bordas da lamínula, este deverá 
ser removido com o auxílio de papel absorvente. A lamínula pode ser selada com cera 
ou vaselina para prevenir a evaporação de água e dessecação; a evaporação desigual 
poderá causar movimentos de massas de células no campo visual durante a 
microscopia. 
Ø Examine a montagem úmida sucessivamente sob baixos e altos aumentos e se 
disponível use a objetiva de imersão com óleo. Compare os tamanhos relativos e 
diferentes formas de bactérias, algas e protozoários, etc... Consulte as ilustrações nas 
páginas seguintes e tente identificar membros dos principais grupos de microrganismos. 
 
Utilize as ilustrações fornecidas abaixo e tente identificar as criaturas que observares: 
• Células grandes, não pigmentadas e com movimentos são normalmente protozoários. 
• Células esverdeadas, com movimentos ou paradas são ou cianobactérias. 
• Células grandes com núcleos visíveis e cloroplastos e flagelos são algas eucarióticas. 
• Cianobactérias procarióticas podem ser verde azuladas, pretas rochas ou vermelhas e 
são menores do que as algas. Muitas espécies de cianobactérias são filamentosas e 
móveis por movimentos de arraste. 
• Bactérias são células pequenas, sem cor, móveis ou estacionárias dependendo da espécie 
e com várias morfologias e agrupamentos celulares. Nos agrupamentos cada célula é um 
organismo independente. 
• Fungos são os micróbios de mais fácil observação em ambientes terrestres embora 
ocasionalmente poderão aparecer hifas e micélios na parte superior da infusão, pois são 
microrganismos que crescem mais próximos à fonte de oxigênio. 
• Organismos sem cor, grandes em tamanho, que exibem um grau de diferenciação em 
tecidos são invertebrados microscópicos que podem aparecer na infusão. Eles 
apresentam sistemas bem desenvolvidos, exemplificando, sistema digestivo, sistema 
excretor e órgãos de reprodução todos em nível microscópico. 
 14
 
FIGURA 1. Morfologia e agrupamento de bactérias. Características morfológicas 
celulares: 
 
1. Célula vegetativa - formas: 
 
2. Agrupamento de células 
 
 
 
3. Esporângio - célula com esporos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Endósporos 
a) forma: 
 
 
 
b) Localização: 
 
 
 
 
 
 
15 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
 
 
 
 16
 
 
17 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS - AULAS PRÁTICAS 
 
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia deve 
ser capaz de responder as seguintes questões: 
 
1) Por que adicionamos cada um dos ingredientes acima no meio? 
 
2) Qual a função de cada componente? 
 
 
3) A massa de células crescendo sobre uma superfície sólida e que se torna visível a 
olho nu é denominada ............................................................ 
 
 
5) Um microrganismo foi isolado de um lago e há uma diferença de opinião entre os 
integrantes do laboratório, se ele deve ser classificado com as algas ou com os 
protozoários. Sabendo que um grupo de organismos apresenta um conjunto de 
características comuns e outras particularidades que o distingue dos demais, como 
você pode justificar os diferentes pontos de vista? 
 
6) No cultivo de microrganismos pela técnica de “Spread Plate” ou placa derramada, o 
meio de cultura previamente dissolvido em forno de microondas, água quente ou 
autoclave deve ser vertido nas placas quando sua temperatura está entre 45 e 
50oC. Por quê? 
 
 18
2. ENRIQUECIMENTO, ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DE 
CULTURAS MICROBIANAS 
 
 Raramente um ambiente natural contém somente um tipo de microrganismo. Na 
maioria dos casos, uma grande variedade de micróbios está presente, e é tarefa do 
microbiologista, desenvolver métodos e procedimentos que irão permitir o isolamento de 
culturas puras de microrganismos de interesse. Nos métodos de enriquecimento de culturas, 
meios apropriados e condições de incubação, são utilizados os quais são seletivos para o 
organismo desejado, e as quais são inibitórias ou contraseletivas, para micróbios indesejados. 
Nos últimos 100 anos, muitos progressos foram feitos e temos uma grande variedade de meios 
e condições de incubação que nos permitem isolar muitas populações de micróbios da 
natureza. Inóculo - é a fonte de onde queremos isolar o microrganismo. Pode ser uma 
amostra de alimento, uma amostra de solo, um tecido necrosado de plantas, um nódulo de 
plantas, uma amostra de água etc. Dependendo do material que estamos trabalhando, e com 
um conhecimento das populações que possivelmente estejam presentes neste habitat, teremos 
uma idéia dos meios e das condições de incubação a seremusadas. 
 
MÉTODO DAS ESTRIAS EM PLACAS 
 
 Para a separação de populações misturadas, em isolados simples ou culturas puras, 
podemos utilizar o método das estrias. O primeiro passo para se ter sucesso, é selecionar o 
meio de cultura mais apropriado para o crescimento do organismo sendo pesquisado. O 
segundo passo, são as condições de incubação, por exemplo, escolha da temperatura correta, 
presença ou ausência de oxigênio, atmosfera em que a placa vai ser incubada. 
 As seguintes etapas são utilizadas neste método: 
1. Escolher, a colônia ou organismo a ser purificado. 
2. Esterilizar a alça de platina na chama, até ficar vermelha. 
3. Esperar alguns segundos para a platina esfriar 
4. Retirar uma amostra da colônia. 
5. Realizar a primeira estria na placa. 
6. Esterilizar a alça de platina na chama até ficar vermelha. 
7. Esperar alguns segundos para a platina esfriar. 
8. Realizar a segunda estria na placa. 
9. Esterilizar a alça de platina na chama até ficar vermelha. 
10. Esperar alguns segundos para a platina esfriar. 
11. Realizar a terceira estria na placa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12. Incubar as placas até o aparecimento de colônias. 
 
 
19 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
13. Uma nova purificação pode ser feita, após esta primeira purificação, para se ter certeza que 
temos uma cultura pura, ou seja, uma cultura onde somente uma espécie de microrganismo 
esteja presente. 
 
MANUTENÇÃO DE CULTURAS PURAS EM LABORATÓRIO E EM BANCOS DE 
CULTURAS 
 
Meio de cultura sólido 
 
 
 
Meio de cultura líquido 
 
 
 
Culturas liofilizadas 
 
 
 
 
 
Congelamento em glicerol (Freezer) 
 
Temperatura (-20 0C) 
Temperatura (-80 0C) 
 
BANCOS DE CULTURAS 
 
AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION (ATCC) 
Maior coleção de isolados microbianos do mundo. 
Inclui bactérias que causam doenças, patogenias de plantas etc... Qualquer bactéria isolada e 
publicada em trabalho científico deve ser enviada uma amostra para este banco de culturas. 
Tem ligação com o Manual de Bergey. 
 
Alemanha 
Comunidade Européia 
 
MIRCEN (Microbial Resource Center) 
Bancos de culturas de Rhizobium, patrocinados pela FAO. 
4 no Mundo. 
Em Porto Alegre, na FEPAGRO, está localizado o Banco para a América Latina. 
 20
QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS 
 
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia 
deve ser capaz de responder as seguintes questões: 
 
1. Qual o princípio do método das estrias? Qual sua utilidade? 
 
2. O que é uma cultura pura? 
 
3. Quais as aplicações ou usos para as seguintes técnicas de cultivo: placa 
derramada (“pour plate”) e placa esparramada (“spread plate”)? 
 
4. Os microrganismos, em ambientes naturais, usualmente ocorrem em culturas 
.............................................. 
 
5. Antes de poder caracterizar e identificar uma espécie de microrganismo, ele 
deve ser isolado como uma ............................................................. 
 
6. Uma cultura de microrganismos na qual todas as células derivaram de uma 
mesma célula parental é denominada cultura 
....................................................................... Como você poderia chegar a uma 
cultura de células de bactérias fixadoras de N a partir de uma amostra de solo? 
 
7. Qual a vantagem da forma de manutenção de microrganismos em meio de 
cultura sólido em relação ao meio líquido? 
 
8. Quais os problemas potenciais decorrentes da manutenção de microrganismos 
na forma de meio de cultura líquido? 
 
9. Um processo para manutenção de culturas que envolvem congelamento e 
secagem da cultura é chamado de 
........................................................................... 
 
10. As culturas liofilizadas perdem gradativamente a viabilidade? 
 
11. Quais as três condições do meio liofilizado que permitem a conservação da 
viabilidade das células por longo período? 
 
12. Qual a condição ambiente do meio de cultura de manutenção sólido e líquido 
que permite a sobrevivência das células por 1 a 8 meses? 
 
13. Qual a forma de manutenção de microrganismos adotada pelo ATCC? É esta 
uma forma adequada para manutenção das características genéticas do 
organismo? 
 
14. Marque V ou F, e corrija se falsa: 
(__) ATTC é uma organização com fins lucrativos que mantém uma coleção de 
culturas de microrganismos apenas. 
(__) ATTC é o maior banco de culturas de microrganismos no mundo. 
(__) MIRCEN, instituição ligada a UNESCO, congrega vários centros de 
conservação de microrganismos, inclusive a MIRCEN da FEPAGRO(Porto 
Alegre) que abriga uma coleção de culturas de Rhizobium. 
 
 
21 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
15. A liofilização é um método para caracterização dos microrganismos: 
verdadeiro(v) ou falso(f)? 
 
16. O que determina a escolha do método de manutenção de algum microrganismo? 
 
17. Como se pode definir um meio de manutenção ideal? 
 
18. Cite aplicações práticas dos cultivos de enriquecimento. 
 
 22
3. COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS PARA MICROSCOPIA 
As técnicas de microscopia permitem a visualização de células microbianas a partir de 
uma amostra ambiental ou de uma cultura de microrganismos. Normalmente faz-se necessária 
a aplicação de um corante às células para que estas possam ser visualizadas ao microscópio 
óptico. A microscopia óptica é amplamente utilizada na pesquisa e ensino, possibilitando 
grande diversidade de técnicas de observação, onde podemos destacar as de fluorescência, 
bem como de campo escuro, contraste de fase, ultravioleta, etc.. 
 
PREPARO DO ESFREGAÇO PARA COLORAÇÃO 
Preparações de bactérias para coloração são mais satisfatórias quando a amostra do 
material é obtida do crescimento de organismos provenientes de superfícies de placas de Agar, 
tubos ou de culturas líquidas emulsificadas até uma turbidez leve em água destilada ou água 
de torneira esparramadas, em uma lâmina livre de gorduras. 
 
PROCEDIMENTO: 
Ø Coloque uma gota de água em uma lâmina limpa (livre de graxa). Com uma alça de platina 
esterilizada transfira uma pequena amostra do crescimento para a gota de água e esfregue 
a alça com a cultura em movimentos circulares até o material formar uma suspensão turva 
homogênea. 
Ø Espere até este filme microbiano secar naturalmente e fixe-o na lâmina por calor. Passe a 
lâmina sobre um bico de bunsen várias vezes por 1 a 2 segundos (cuide para não aquecer 
demais). Fixação deficiente (quando a cultura é lavada da superfície da lâmina, se 
colocada sob torneira pingante). Fixação excessiva (as células romperão ou ficarão 
distorcidas) não permite uma fácil observação. A seguir, deixe a lâmina esfriar e aplique o 
corante. 
 
 
COLORAÇÃO SIMPLES 
 
 O esfregaço é corado com solução de somente um corante (Ex: solução cristal violeta 
1%; solução de azul de metileno 1%; solução de safranina, 0,5%, etc.) onde todas as células 
adquirem a mesma coloração e não há diferenciação entre tipos de células ou estruturas 
celulares. 
 
TÉCNICA: 
 1. Prepare e fixe um esfregaço do organismo a ser corado (orientação anterior). 
 2. Cubra o esfregaço com solução corante e permita reagir por 1-2 minutos. 
 3. Lave o excesso da tintura com água pingante de torneira e seque em mata-borrão 
(entre folhas de papel jornal). 
 4. Observe em microscópio (sem uso da lamínula). 
 5. Para usar a objetiva de 100X coloque uma gota de óleo de imersão sobre o material. 
IMPORTANTE: Somente a objetiva de 100X foi fabricada para ser usada com óleo. Não 
coloque óleo quando estiver usando as outras objetivas. 
 
 
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
 A coloração de Gram é uma das mais úteis colorações diferenciais em bacteriologia. O 
efeito diferencial causado por esta coloração é acreditado ser causado por diferenças 
fundamentais existentes na estrutura e composição química das paredes celulares bacterianas. 
A cultura a ser corada por este princípio deve ser preferencialmente jovem (12-18 horas) e 
obtida de crescimento em meio livre de açúcares (pode ser usado o meio Agar nutritivo). 
Solução I: soluçãoaquosa 1% cristal violeta. 
Solução II: solução aquosa 2% iodina (Lugol). 
Solução III: 2% acetona e álcool 95%. 
 
23 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
Solução IV: 2,5% safranina em etanol (uma parte) e água (9 partes). 
 
 
PROCEDIMENTO: 
Ø Prepare e fixe um esfregaço de uma cultura jovem (12-18 horas), (de acordo com a 
orientação anterior). 
Ø Cubra o esfregaço com cristal violeta (solução I). Deixe a tintura reagir por 1 minuto. Lave o 
excesso de tintura sob torneira pingante com uma quantidade mínima de água. 
Ø Cubra o filme com iodina (Lugol) (solução II). Deixe reagir por 1 minuto. Lave o excesso de 
tintura sob torneira pingante com uma quantidade mínima de água. 
Ø As células bacterianas devem ser descoloridas com álcool (solução III) inclinando a lâmina 
sobre a pia e pingando a solução III sobre o esfregaço até que os pingos saiam sem cor de 
corante. Lave com água pingante de torneira. 
Ø Cubra o esfregaço com safranina (solução IV) por 1 minuto (pode ser usada Fucsina no 
lugar de safranina). Lave sob torneira e seque em mata-borrão (entre folhas de jornal). 
Examine sob imersão (objetiva 100), sem o uso de lamínula com luz máxima para distinguir 
cores. Células Gram positivas têm coloração azul e Gram negativas têm coloração 
vermelha ou rosada. Resultados "confiáveis" podem ser obtidos durante o crescimento 
ativo das culturas bacterianas (culturas jovens). Culturas velhas podem resultar em 
dificuldades para quem estiver observando-as. 
 
E Cada aluno poderá fazer uma lâmina e os outros (do grupo) utilizarem o mesmo material 
para observação. Procurem fazer coloração com colônias que tenham características 
diferentes. Observem a forma da bactéria e a sua coloração de Gram. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS 
 
 
 
 
 
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia 
deve ser capaz de responder as seguintes questões: 
 
1. Qual a finalidade (objetivo) de corar microrganismos? 
 
2. Qual o princípio da técnica da coloração de gram? 
 
3. Na técnica de coloração de gram, por que algumas bactérias se coram de vermelho e outras de azul? 
 
Forma da bactéria: 
(_) bastonete 
(_) coccus 
(_) espirilo 
(_) vibrio 
 
Reação de gram: 
(_) gram + 
(_) gram - 
 
Forma da bactéria: 
(_) bastonete 
(_) coccus 
(_) espirilo 
(_) vibrio 
 
Reação de gram: 
(_) gram + 
(_) gram - 
 
 24
4. Qual é a função do álcool e acetona como reagentes na técnica da coloração de gram? 
 
25 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
4. TESTES BIOQUÍMICOS 
 Em bacteriologia, quando se deseja identificar uma bactéria isolada e de classificação 
desconhecida, os seguintes procedimentos podem ser empregados: 
Ø Caso o meio seja seletivo para um gênero específico, este pode ser isolado pela 
seletividade da fonte de energia. Tomando-se como exemplo as bactérias nitrificadoras, 
elas poderão ser isoladas utilizando-se um meio de cultura contendo somente NH4+ e uma 
solução de sais. Já os fixadores assimbióticos de nitrogênio poderão ser isolados pelo 
enriquecimento do meio com um composto carbonado (açúcar) e ausência completa de 
qualquer fonte de nitrogênio. 
Ø Quando vários grupos de bactérias podem crescer no meio sendo utilizado, a 
caracterização de gêneros específicos pode ser efetuada, após o isolamento em cultura 
pura, através de TESTES BIOQUÍMICOS. Estes testes avaliam respostas fisiológicas 
características a cada grupo de bactérias. 
 
TESTE DA CATALASE 
 
 A enzima catalase, presente em aeróbicos e anaeróbicos facultativos (exceto os ditos 
aerotolerantes), catalisa a liberação de O2 a partir de peróxido de hidrogênio (H2O2). A 
atividade desta enzima pode ser detectada adicionando-se pequenas quantidades de H2O2 à 
cultura e observando a formação de bolhas de gás, indicativo da liberação de O2. A cultura 
deve ser crescida em um TAI (tubo de agar inclinado) o qual tenha sido fortemente inoculado, 
para que uma densa massa seja obtida. Coloque o tubo em ângulo inclinado e derrame 1 ml de 
peróxido de hidrogênio a 3% sobre a massa de células. Observe a imediata formação de 
bolhas de gás. A enzima está presente dentro das células em qualquer fase do crescimento e 
não é uma enzima de função catabólica-anabólica, mas sim de proteção. 
 Um procedimento alternativo pode ser usado para testar catalase a partir de colônias 
simples isoladas em placas de agar: 
Ø Coloque uma gota de H2O2 a 30% sobre uma lâmina de microscópio limpa. 
Ø Com uma alça de platina colete a massa celular da colônia a ser testada e emulsifique 
na H2O2. 
A formação imediata de bolhas é indicativo da presença da catalase. 
 
TESTE PARA REDUÇÃO DE NITRATO (formação de nitrito e N2) - Respiração anaeróbica 
 
 Algumas bactérias (e somente bactérias) têm a habilidade de utilizar compostos 
diferentes do oxigênio molecular como aceptor final de elétrons durante o metabolismo 
oxidativo. Algumas espécies utilizam o nitrato (NO3-) reduzindo-o a nitrito (NO2-) ou a nitrogênio 
molecular (N2), dependendo da espécie bacteriana. 
 Um meio (meio 4) contendo uma pequena quantidade de nitrato de potássio e um tubo 
de Durham é inoculado com a bactéria teste. Após a incubação (24 - 48 horas), o teste para 
nitrito é efetuado adicionando-se 5 gotas do reagente ácido acético sulfanílico e uma mesma 
quantidade de gotas do reagente alfa naftilamina à cultura. Se nitrito estiver presente, uma cor 
rosa-avermelhada aparecerá imediatamente. A presença de nitrogênio gasoso pode ser 
detectada examinando-se o tubo de Durham. 
 A reação específica para a formação da cor (presença de nitrito) é a seguinte: 
 26
 
 
 Testes negativos sempre devem ser confirmados adicionando-se pequenas 
quantidades de zinco em pó aos tubos. O zinco irá reduzir o nitrato a nitrito e a cor vermelha 
aparecerá. Se isto não acontecer (ausência de cor vermelha), provavelmente todo o nitrato foi 
reduzido a gás nitrogênio. 
 
Reagentes: 
a. Reagente ácido acético sulfanílico 
 Ácido sulfanílico 8 g 
 Ácido acético glacial 286 g 
 Água destilada . 714 ml 
b. Reagente Alfa naftilamina 
 Alfa naftilamina 6,3 g 
H2SO4 concentrado 10 ml 
Água destilada 1.250 ml 
 
Σ CUIDADO: Alfa Naftilamina é carcinogênica 
 
TESTE DE VOGES-PROSKAUER 
 
Testa a produção de acetoína ou 2-3-butanediol 
 Durante o processo metabólico de degradação da glicose, certas espécies bacterianas 
convertem produtos ácidos em produtos neutros como 2-3-butanediol ou acetoína (acetil-metil-
carbinol). 
 
 
 A determinação destes produtos finais neutros de fermentação é importante para 
diferenciar espécies produtoras de ácido (aquelas que produzem muito ácido e aquelas que 
produzem pouco ácido). 
 Um meio contendo glicose + peptona (meio 3, MR - VP) é inoculado com a bactéria 
teste até um bom crescimento ser obtido (no mínimo dois dias). Uma sub-amostra de 2,5 ml da 
cultura é tratada com 0,6 ml de alfa naftol e 0,2 ml de KOH. Agitar para aeração. Se acetoína 
ou 2-3-butanediol forem produzidos pela cultura bacteriana, a aeração na presença de álcali irá 
produzir um diacetil o qual por sua vez reagirá com a peptona para produzir uma cor rosa-
avermelhada. O alfa naftol é adicionado para melhorar o aparecimento da cor. Espere pelo 
menos 15 a 20 minutos antes de tomar a decisão quanto ao resultado do teste. 
 
Reagentes: 
NH2 
SO3
Hácido sulfanílico 
NO2- + + 
NH2 
α-naftilamina 
N = N 
SO3H NH2 
p-sulfobenzeno-azo-α-naftilamina 
(vermelho) 
C6H12O6 C = O 
COOH 
CH3 
HCOH 
COOH 
CH3 
C = O 
CH3 
HCOH 
CO2 
H2 
CH3COOH 
CH3 
Piruvat Lactato 
Aceteil metil carbim 
(Acetoína) 
NAD+ 
NADH 
NADH 
NAD+ 
a) alfa naftol: 
alfa naftol 50 g 
etanol (95%) 1000 ml ml 
b) KOH 
KOH 400g 
Água destilada 1000 
 
As reações que resultam no desenvolvimento da cor rosa avermelhada são esquematizadas 
abaixo:TESTE DO VERMELHO DE METILA 
 O mesmo meio de glicose + peptona (MR - VP) usado para o teste de Voges-Proskauer 
pode ser usado para esse teste. O tubo é inoculado com a bactéria teste e incubado por no 
mínimo dois dias. Após este período, 5 gotas de vermelho de metila são adicionadas a uma 
alíquota de 2,5 ml da cultura. Não misture. Organismos produtores de alta acidez (pH inferior a 
4,4) farão com que o vermelho de metila torne-se vermelho. Organismos que produzem 
produtos neutros (como por exemplo acetoína) tornam o meio menos ácido, resultando num 
teste negativo, de coloração alaranjada ou amarela. Esse teste deve ser lido após 20 minutos. 
 
Reagentes: 
Vermelho de Metila 
 Vermelho de metila 0.1 g 
 Etanol a 57% 500 ml 
 
TESTES PARA ENZIMAS EXTRACELULARES (EXOENZIMAS) 
 
 Exoenzimas são liberadas por microrganismos nos meios de cultura e são 
responsáveis pela conversão de compostos orgânicos com alto peso molecular (tais como 
proteínas, amido e graxas) em pequenas unidades as quais podem ser transportadas para o 
interior das células. Exoenzimas são hidrolíticas pelo fato de utilizarem água para quebrarem 
compostos orgânicos complexos em subunidades pequenas. 
 
HCOH 
CH3 
HCOH 
CH3 
2-3 butanediol 
C = O 
CH3 
HCOH 
CH3 
acetoína 
C = O 
CH3 
C = O 
CH3 
diacetil 
+ peptona + α naftol 
 (cor rosa avermelhada) 
ar (agitação) 
 28
 
 
 Para detectar a presença de enzimas extracelulares, uma placa de meio de cultura 
contendo compostos orgânicos complexos é inoculada com uma estria simples central 
usando a bactéria teste. Após o período de incubação, reagentes apropriados são adicionados 
na placa para detectar o desaparecimento do composto orgânico na área circunvizinha ao 
crescimento bacteriano. Um procedimento alternativo consiste em procurar pelo aparecimento 
de certos subprodutos resultantes da quebra enzimática. 
 
 
TESTE DA AMILASE (digestão do amido) 
 
 Após o período de incubação, as placas são inundadas com a iodina de Gram, a qual 
reagirá com o amido não atacado desenvolvendo uma coloração azul. Bactérias amilase 
positiva, apresentarão uma zona incolor próxima ao crescimento bacteriano nas placas. 
 
 
TESTE DA CASEINASE (digestão da caseína) 
 
 Após o período de incubação, as placas são inundadas com HCl 1% o qual precipitará 
qualquer caseína remanescente, deixando uma zona clara ao redor do crescimento bacteriano, 
se caseinase for produzida. 
 
 
TESTE DA GELATINASE (digestão da gelatina) 
 
 Após a incubação as placas são inundadas com uma solução constituída de 15 g de 
HgCl2 + 20 ml de HCl conc. em 100 ml de H2O. A gelatina não hidrolisada irá formar um 
precipitado. Gelatina hidrolisada ao redor do crescimento bacteriano formará uma zona clara. 
 Um procedimento alternativo envolve a inoculação em tubo com gelatina nutriente. Após 
a incubação, o tubo é resfriado em um banho de gelo para solidificar a gelatina não hidrolisada. 
Qualquer grau de liquefação notado após o resfriamento (um tubo não inoculado pode servir 
como controle) é evidência de hidrólise da gelatina. 
 
 
RELAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS NOS DIFERENTES TESTES 
BIOQUÍMICOS 
 
Meio 1: Agar nutritivo (Catalase) 
 Peptona 
5 g 
 Extrato de carne 
3 g 
 Agar 
15 g 
 Água destilada 1000 
ml 
* Ajustar o pH em 6,8 
 
Meio 2: Nutritivo com amido-Agar 
(Amilase) 
 Peptona 
3 g 
 Extrato de levedura 
3 g 
Amido solúvel 
2 g 
Agar 
16 g 
Água destilada 1000 
ml 
 
29 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
 
Meio 3: MR - MP 
(Vermelho de metila - Vogues 
Proskauer) 
Peptona 
5 g 
Glicose 
5 g 
NaCl 
5 g 
Água destilada 1000 
ml 
Σ Para bactérias que não pertençam ao 
gênero Bacillus trocar o NaCl pelo 
K2HPO4. Ajustar o pH do meio em 6.9 . 
Esterilizar a 1210C durante 10 minutos. 
 
 
 
Meio 4: Caldo - nitrato (Redução de 
nitrato) 
Triptona 
10 g 
 Extrato de levedura 
5 g 
KNO3 
1 g 
 Água destilada 
1000 ml 
 Agar 
1,7 g 
Meio 5: Agar caseinato de sódio 
(Caseinase) 
Caseinato de sódio 
2 g 
 Extrato de levedura 
2 g 
Glicose 
1 g 
K2HPO4 
0,2 g 
MgSO4 
0,2 g 
FeSO4 
traços 
Agar 
15 g 
 Água destilada 
1000 ml
 
QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS 
 
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da 
Agronomia deve ser capaz de responder as seguintes questões: 
1) Relacione rotas catabólicas x organismos: 
A) Glicólise, Ciclo de Krebs/Cadeia Respiratória com resp. aeróbica. 
B)Glicólise, Ciclo de Krebs/Cadeia Respiratória com resp. anaeróbica. 
C) Glicólise 
( ) Microrganismos, plantas e animais. 
( ) Algumas bactérias e fungos. 
( ) Algumas bactérias. 
2) Se um solo for submetido a uma condição de anaerobiose (imagine uma lavoura de arroz que 
foi submetida a alagamento) que tipo de metabolismo irá predominar: respiração aeróbica, 
anaeróbica ou fermentação? Justifique. 
 
3) O tipo de metabolismo é determinado pelos fatores ambientais (presença/ausência de oxigênio 
ou outros compostos oxidados) e pelas particularidades da espécie de microrganismo (fator 
genético) que estiver no meio. Num meio livre de oxigênio, quando ocorre fermentação e 
quando ocorre respiração anaeróbica? 
 
4) Qual a diferença entre um microrganismo que faz respiração anaeróbica e outro que faz 
fermentação quanto às rotas? Quais são os produtos finais? Qual das rotas é mais energética e 
por quê? 
 
5) Você aprendeu que o teste da catalase não é eficiente para diferenciar microrganismos que 
cresceram nas placas de Petri, pois todos tinham a habilidade de crescer em meio aeróbico 
(caso contrário não haveria crescimento). Você observou também que Pseudomonas 
aeruginosa e Escherichia coli diferiram notadamente em termos de produção da enzima 
catalase, sendo que a segunda produziu menos. Qual é a particularidade do metabolismo (fator 
genético) desta espécie que possivelmente seja a causa desse comportamento? 
 
6) Nas rotas de catabolismo (degradação) o O2, cuja presença no meio é indispensável para que 
se processe a cadeia respiratória (aceptor final de e-), é também aceptor intermediário de e- 
levando à formação de compostos tóxicos (e letais) à própria célula. Pergunta-se: 
- Se microrganismos anaeróbios facultativos estiverem crescendo em meio aeróbico (com 
oxigênio) haverá formação de produtos tóxicos derivados do oxigênio? E se estiverem 
crescendo em um meio completamente anaeróbio (como as metanogênicas em um 
biodigestor)? 
- Fermentadores estritos como as bactérias metanogênicas não toleram a presença de 
oxigênio no meio. Porque as bactérias do ácido láctico(fermentadoras) podem crescer em 
meio com O2? Há um fator genético envolvido? 
- Os aeróbicos e anaeróbicos facultativos produzem as seguintes enzimas detoxificantes: 
...........................e ............................ . 
- As bactérias do ácido láctico produzem as enzimas......................... e ....................... . 
- Os anaeróbicos obrigatórios não possuem nenhuma enzima de proteção para os compostos 
tóxicos derivados do oxigênio. Por quê? 
 
7) Oteste de Vermelho de Metila – Voges Proskauer é um teste típico para avaliar organismos 
fermentadores. Que particularidade do metabolismo destes microrganismos que é avaliado 
neste teste? 
 
8) Somente bactérias apresentam a capacidade de fazer respiração anaeróbica. Nesse tipo de 
metabolismo ao invés de o aceptor final de e- ser o O2, a célula bacteriana usa íons como NO3- 
(nitrato), SO4-- (sulfato) ou Fe+++ (ferro oxidado) como aceptor. Se o aceptor for o nitrato ele será 
reduzido a formas não assimiláveis pela planta. Pergunta-se: 
- Qual é a importância agrícola e ambiental desse processo chamado denitrificação? 
- As formas nitrogenadas de adubo mais comuns, são uréia ( CO(NH2)2 ), sulfato de 
amônio, nitrato de potássio, nitrato de amônio, aquamônia e o “uran” (mistura de uréia, 
nitrato de amônio e água). Qual destas formas você não pode recomendar para uma 
lavoura de arroz irrigado por inundação, ou qualquer outra cultura que vegete em solo com 
sítios de anaerobiose? Por quê? 
 
 
31 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
9) Porque todos os microrganismos precisam produzir exoenzimas? Que enzimas são necessárias 
degradar amido, celulose, lignina (alguns componentes de vegetais) e caseína? 
 
 32
 
5. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS 
Praticamente qualquer trabalho em microbiologia requer métodos que avaliem o número 
de microrganismos. Pode-se medir números de microrganismos ou massa celular. Os métodos 
que medem número de microrganismos são mais úteis para organismos unicelulares como 
bactérias e leveduras. Os métodos que medem massa celular podem ser empregados para 
todos os tipos microbianos incluindo organismos filamentosos longos como fungos os quais 
são difíceis de enumerarmos medindo-se número de células, embora a técnica que vamos 
executar possa ser empregada. 
 
O método mais comum para medirmos número de células é o Método das Placas de 
Contagem ou Contagem de Colônias: Este método é baseado na relação teórica de que uma 
célula bacteriana originará uma colônia (UFC) e pressupõe-se que o número de colônias que 
desenvolveram na placa de Agar corresponderá a contagem original de bactérias. 
Este método pode ser empregado para enumerar microrganismos presentes no leite, 
águas poluídas, solo, alimentos em geral, etc. Utilizando-se técnicas assépticas, diluições 
quantitativas do material sendo examinado, são realizadas em tubos de diluição esterilizados e 
uma quantidade conhecida de cada diluição é colocada em placa de Petri com o meio de 
cultura. A diluição preparada e colocada na placa depende do número esperado de 
microrganismos na amostra e deve assegurar que uma das placas finais apresentará entre 30 
e 300 colônias. O número de colônias nesta faixa dará uma aproximação mais correta da 
população microbiana. 
 
Após a incubação das placas e aparecimento das colônias, as colônias serão contadas 
e será feita a média a qual será multiplicada pelo fator de diluição para obter-se o número de 
microrganismos no material original diluído. 
O meio de cultura pode ser adicionado na forma líquida após a adição da diluição ou em 
placas de petri pré-solidificadas com o meio de cultura. As diluições podem ser realizadas em 
água ou em uma solução salina esterilizada. 
 
 
 
PROCEDIMENTO PARA A DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS 
EM AMOSTRAS 
 
Discutir o procedimento entre o grupo até entenderem o que deve ser feito. 
1. Desenrolar as placas de petri. Não abrir para não contaminar. 
2. Rotular as placas com o meio e o tipo de inóculo sendo usados, bem como a diluição que 
será colocada na placa. 
3. Pipetar 1 ml da diluição correspondente na placa, evitando ao máximo contaminação 
pelo ar. 
4. Colocar o meio correspondente, derretido em banho-maria, mas evite colocar quando 
muito quente. Ideal 45 - 50 °C. 
5. Girar as placas com o meio, lentamente em movimentos circulares para misturar a 
amostra com o meio de cultura da melhor maneira possível. 
6. Espere o Agar solidificar completamente, e incube as placas invertidas para evitar a 
dessecação do meio e também auxiliar evitando contaminação pelo ar. Incubador a 30 °C. 
 
 
33 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS 
MEIO PARA ACTINOMICETOS - AMIDO - CASEINA AGAR 
(Kuster e Williams, 1964) 
Amido 
.............................................................................. 
10,00 g 
Caseína (difco - livre de vitaminas)............................ 
0,30 g 
KNO3 
............................................................................... 
2,00 g 
NaCl 
................................................................................. 
2,00 g 
K2HPO4 
............................................................................. 
2,00 g 
MgSO4 . 7 H2O 
................................................................. 0,05 g 
CaCO3 
............................................................................. 
0,02 g 
FeSO4 . 7 H2O 
............................................................... 0,01 g 
Agar 
.................................................................................. 
16,00 g 
H2O destilada ................................................................ 
1.000 ml 
Nistatina ...................................... 50 microgramas/ml 
(anti-fúngico) 
pH = 7,0 - 7,2 Ajustar antes da esterilização. A nistatina é adicionada antes de verter o 
meio nas placas e é indispensável quando se trabalhar com solos onde a população de 
fungos é alta e pode comprometer a avaliação. 
 
MEIO PARA FUNGOS 
Martin's - Bengala Agar (Martin, 1950) 
Glicose ............................................... 
............................ 10,00 g 
Peptona 
............................................................................. 5,00 
g 
KH2PO4 
............................................................................. 1,00 
g 
Rosa Bengala 
(1%)............................................................ 3,3 ml 
Agar 
................................................................................ 
16,00 g 
H2O destilada ............................................................... 
1.000 ml 
 34
Estreptomicina .......... 30,0 mg ou 0,3 ml p/ cada 100 
ml do meio. 
 
 Todos os reagentes, exceto Rosa Bengala e Estreptomicina são dissolvidos em 
água. A mistura é aquecida agitando até iniciar a fervura. A mistura é removida do 
aquecedor e Rosa Bengala é adicionada. Após a autoclavagem e antes de colocar o 
meio de cultura nas placas (+ ou - 48 °C) é adicionada a estreptomicina. 
* Dissolver 1 g de sulfato de estreptomicina em 100 ml de água esterilizada e adicionar 
0,3 ml para cada 100 ml do Meio Rosa Bengala antes de adicionar o meio às placas (+ 
ou - 48 C). 
 
MEIO PARA BACTÉRIA 
Hutchinson's Agar modificado (Bhat e Shetty, 1949) 
Agar 
............................................................................... 
18,00 g 
Glicose 
........................................................................... 
10,00 g 
K2HPO4 
............................................................................ 0,5 
g 
MgSO4 . 7 H2O 
.............................................................. 0,2 g 
Peptona 
.......................................................................... 0,05 
g 
KNO3 
.............................................................................. 
0,05 g 
H2O destilada ............................................................ 
1000 ml 
DICAS PARA RESOLVER PROBLEMAS EM DILUIÇÕES 
1. Desenhe diagramas, eles ajudarão consideravelmente. 
2. Respostas sempre devem ser dadas em bactérias, fungos e actinomicetes, por grama ou 
mililitro do material sendo analisado. Ajuste os resultados se microrganismos por mais de uma 
grama ou Mililitro estiver sendo requerido no problema. 
ASSUMA QUE 1 ml de ÁGUA = 1 GRAMA. 
3. Use as placas para contagem com número de colônias entre 30 e 300. 
4. Com as repetições de placas da mesmadiluição tome a média da contagem e coloque na 
fórmula a seguir. 
5. Use as duas fórmulas e nunca ocorrerão erros: 
Ø FD= diluição inicial x diluição(ões) subseqüente(s) x quantidade colocada na placa 
( FD = fator de diluição) 
Ø Número de microrganismos por grama ou mililitro da amostra= 1/FD X número de 
colônias contadas 
 
35 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
PROBLEMAS 
1. Análise da contaminação do leite. 10 mililitros de leite foram adicionados a 90 mililitros de 
água esterilizada. Esta mistura foi posteriormente diluída por duas vezes 1:100. 0,1 ml da 
diluição final foi colocada na placa e após a incubação 160 colônias apareceram na placa. 
Qual a contagem de bactérias por mililitro de leite? 
2. Você cultivou uma cultura bacteriana e queria saber quantas células de bactérias por 
mililitro de meio cresceram no seu meio de cultura. 1 mililitro desta cultura bacteriana foi 
pipetada para um tubo de ensaio contendo 9 ml de água esterilizada. 1 ml desta diluição foi 
pipetado para um segundo tubo de ensaio contendo 9 ml de água esterilizada, e deste 0,1 ml 
foi colocado numa placa. 30 ml de meio de cultura foram adicionados na placa e esta foi 
incubada, sendo que 219 colônias apareceram após a incubação. Quantas bactérias por 
mililitro estavam presentes na cultura original ? 
3. Análise da contaminação de amostras de carne. 5 gramas de carne foram adicionadas a 
45 ml de água esterilizada. Uma diluição adicional de 1:100 foi realizada e 0,1 ml desta foi 
colocada na placa. Após a incubação 46 colônias foram contadas. Calcule o número de 
bactérias por grama de carne. 
4. Análise de alimentos. 2 gramas de salada de batatas foram colocadas em um liquidificador 
contendo 18 ml de água esterilizada. 10 ml desta mistura foram então adicionados a 90 ml de 
água esterilizada que estavam em um erlenmeyer. 0,1 ml desta mistura foi adicionado a 9,9 ml 
de água esterilizada em um tubo de ensaio, e 0,1 ml desta diluição final colocou-se em uma 
placa. Após a incubação 78 colônias foram contadas. Quantas bactérias estavam presentes 
nas 2 gramas da amostra de salada de batatas ? 
5. Análise de microrganismos do solo. 5 gramas de solo foram misturadas a 15 ml de 
diluente. Quatro diluições sucessivas de 1:10 foram realizadas. 1 ml da amostra original e das 
diluições subsequentes foram colocadas em placas de Petri individuais e o meio de cultura 
adicionado. Após a incubação o seguinte dados foram obtidos: 
1 ml da Amostra Número de colônias 
Diluição inicial Muitas colônias (MC) ( + de 300) 
Primeira diluição 1:10 MC 
Segunda diluição 1:10 235 
Terceira diluição 24 
Quarta diluição 0 
 Calcule o número de bactérias por grama de solo. 
6. Análise da microbiologia de um poluente ambiental. 9 gramas de esterco foram 
misturados em um liqüidificador com 891 ml de água esterilizada. Três diluições sucessivas de 
1:10 foram realizadas. Amostras triplicadas de 0,1 ml foram colocadas em diferentes placas. 
Foram utilizadas todas as diluições para colocar nas placas. Após incubação foram obtidos os 
seguintes resultados: 
0,1 ml da amostra Número de colônias 
 Suspensão inicial MC 
Primeira diluição 1:10 410/385/412 
Segunda diluição 1:10 165/188/179 
Terceira diluição 1:10 29/27/28 
 Calcule o número de bactérias por grama de esterco ? 
 
7. Análise da microbiologia de alimentos. 8 gramas de salada de batatas foram maceradas 
e diluídas em um liquidificador com 500 ml de água esterilizada. Três diluições sucessivas de 
1:10 foram realizada. Amostras triplicadas de 0,01 ml de todas as diluições foram colocadas 
em placas de petri e mostraram os seguintes resultados após a incubação: 
Primeira diluição (inicial) MC (muitas colônias) 
 36
Segunda diluição MC 
Terceira diluição 190/210/240 
Quarta diluição 17/14/28 
 Calcule o número de bactérias que você ingeriria caso tivesse comido 130 gramas de 
salada de batatas ? 
8. 2 gramas de solo foram diluídas em 898 ml de água esterilizada. Três diluições sucessivas 
de 1:100 foram realizadas e 0,01 ml da última diluição foi colocada em três diferentes placas de 
Petri, sendo que 40 ml do meio de cultura foi adicionado em cada placa. Após a incubação 
observou-se a presença de 38, 45, 53 em cada uma das placas, respectivamente. Qual o 
número de bactérias na amostra ? 
 
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS PELA TÉCNICA DO NÚMERO 
MAIS PROVÁVEL (NMP) 
DESENHO EXPERIMENTAL PARA DETERMINAÇÕES PELO NMP
NPM ( NÚMERO MAIS PROVÁVEL) usando-se tabelas pré estabelecidas
ou contagem direta pelo número de colônias que aparecem nas placas.
AMOSTRA COLETADA E DILUIDA EXEMPLO: 10 gramas de solo em 90 ml de solução salina.
Diluições em série 10 ml em 90 ml de solução salina
1ml
101 10 2 103 10 4 105 10 6 107 108 109
10 -1
 
 
37 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
 
TABELA PARA O NMP, PARA USO EM DILUIÇÕES DECIMAIS E CINCO TUBOS 
POR DILUIÇÃO 
 
 
 
Como exemplo considere uma diluição em série de 1/10, com 5 tubos incubados por 
diluição dando os seguintes resultados positivos após a incubação: 5 na diluição 10-5, 5 na 
diluição 10-6, 3 na diluição 10-7, 1 na diluição 10-8, 0 na diluição 10-9. Nesta série p1=5, p2=3, 
p3=1. A tabela nos dá um valor de 1,1 na quantidade de inóculo aplicada na diluição 10-7. O 
número de microrganismos da amostra original é de 11 milhões. 
 
PROBLEMAS: 
 
1. Você realizou uma determinação do NPM em amostras de carne de frango pelo método dos 
tubos para avaliar a presença de coliformes fecais totais. O resultado foi o seguinte: 
5 positivos na diluição 10 -4 
4 positivos na diluição 10 -5 
1 positivos na diluição 10 -6 
 
0 positivos na diluição 10 -7 
 Qual o número mais provável de coliformes totais na amostra? 
 
2. Você realizou uma determinação do NPM em amostras de solo pelo método dos tubos para 
avaliar a presença de bactérias denitrificadoras totais . O resultado foi o seguinte: 
5 positivos na diluição 10 -4 
3 positivos na diluição 10 -5 
2 positivos na diluição 10 -6 
1 positivos na diluição 10 –7 
0 positivos na diluição 10 –8 
Qual o número mais provável de bactérias denitrificadoras totais na amostra? 
 38
QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS 
 
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia 
deve ser capaz de responder as seguintes questões: 
 
1. Resultados da avaliação do número de coliformes fecais em uma amostra de 
alimento pelo “método das placas de contagem”, mostraram alto grau de 
contaminação (358.000 células/g de amostra). Considerando os problemas 
envolvidos na técnica utilizada faça considerações com relação à confiabilidade 
dos resultados. O método poderia estar superestimando o número deste grupo 
de bactérias na amostra? 
 
2. Você foi solicitado a fazer uma avaliação do número de fungos filamentosos 
presentes em uma amostra de solo. O método das placas de contagem poderia 
ser utilizado? Qual o grau de confiabilidade que se poderia ter a partir dos 
resultados? 
 
3. Considerando-se que no “método das placas de contagem” as estimativas de 
recuperação de organismos de amostras ambientais giram em torno de 0,1 a 
10% apenas, qual a aplicação prática do método e estudos na área agronômica? 
 
4. Você como técnico contratado de uma empresa produtora de inoculantes é 
designado a fazer uma avaliação do número de células viáveis no inoculante 
produzido pela empresa. Partindo do conhecimentode que o número de células 
de rizóbio presente gira em torno de 100 milhões por grama de inoculante, 
esquematize o procedimento para a avaliação e calcule o número de diluições 
necessárias para a avaliação pelo método das placas de contagem. 
 
5. Quais as formas de se avaliar parâmetros ecológicos microbianos? (cite os três 
comentados em aula). 
 
6. Entre as formas de se avaliar número de microrganismos têm-se os métodos da 
contagem direta ao microscópio e o método das placas de contagem. Discuta 
suas principais limitações. 
 
7. O princípio do método das placas de contagem é o de que uma colônia de 
bactérias que se visualiza na placa de Petri foi originada de 
................................................... presente no inóculo. 
 
8. O método de contagem em placas é adequado para avaliar a ecologia de 
microrganismos de áreas distintas? Justifique. 
 
9. O método citado acima é adequado para determinar o número total de 
microrganismos que ocorrem em um solo? Justifique. 
 
10. Qual o procedimento que você adotou para limitar o crescimento de bactérias em 
um meio para fungos e vice-versa? 
 
 
RESULTADOS DOS CÁLCULOS: 
Resolva todos os exercícios da apostila. Lembre-se sempre que o resultado 
deve ser dado em no de propágulos (microrganismo em questão) por ml de inóculo ou 
 
39 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
amostra. Use as duas fórmulas propostas para facilitar os cálculos, mas saiba 
interpretá-las. 
1) 1,6x108 ou 160 milhões/ml. 2) 219 mil células/ml. 3) 460.000 células/g. 4) 15,6x106 
células na amostra. 5) 9,4x104 células/ml. 6) 1,7733x107 células/g de esterco. 7) 
1,73x1010 células na amostra. 8) 4,06x1012 células na amostra. 
 
 
 40
6. ATIVIDADE MICROBIANA DO SOLO. 
 A atividade microbiana (decomposição de resíduos e crescimento microbiano) no solo é 
dependente de várias propriedades como pH, umidade, temperatura e suprimento de oxigênio. 
Para os organismos heterotróficos depende do suprimento e disponibilidade de compostos 
orgânicos. Se todos estes fatores estiverem em condições ótimas, mas a única fonte de 
alimento for o húmus, a atividade microbiana será mínima (embora não seja zero), e muitos 
organismos estarão em nível de subsistência, talvez dormentes ou em formas esporuladas. 
Húmus é um material de difícil decomposição, onde não existem mais compostos que sejam 
fáceis de serem degradados para fornecimento de energia, mas pode suportar a sobrevivência 
de alguns grupos de microrganismos no solo. Quando resíduos orgânicos frescos são 
adicionados ao solo, fornecendo uma fonte prontamente utilizável de carbono e energia o 
número de micróbios, bem como sua atividade aumenta rapidamente. A ação no solo pode 
ser medida pela quantidade de dióxido de carbono (CO2) produzido pela respiração microbiana 
(metabolismo respiratório, dissimilação respiratória). Em laboratório o CO2 evoluído pode ser 
preso e medido. Soluções de álcali, tais como: NaOH, podem prontamente absorver CO2 gás, 
fornecendo uma maneira conveniente, simples e barata de realizarmos uma avaliação 
quantitativa da atividade microbiana. 
 O CO2 reage com o NaOH formando Na2CO3. Se uma quantidade conhecida de NaOH 
for usada, a quantidade de hidróxido que não reagir pode ser determinada e teremos uma 
quantificação da atividade microbiana. 
 As reações podem ser resumidas da seguinte maneira: 
 
(1) M.O. (resíduos orgânicos) + O2 + Micróbios CO2 (g) + outros produtos 
+ Micróbios 
 
(2) CO2(g) + H2O (líquida) H2CO3 
 
(3) H2CO3 + 2NaOH Na2CO3 + 2H2 O ( l ) 
 
 g= gás l= líquido. 
 
 O NaOH que não reagir pode ser medido por titulação com uma solução de HCl de 
concentração conhecida. Entretanto, o Na2CO3 interfere nesta titulação (ou seja, não é um 
composto estável) e precisa ser eliminado. Se adicionarmos BaCl2, este reagirá com o Na2CO3 
formando um composto insolúvel, BaCO3, o qual precipita. 
 
(4) Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2NaCl 
 
 Lembrem-se que se outro aceptor de elétrons estiver disponível (como por exemplo o 
nitrato), poderemos ter oxidação completa de resíduos orgânicos mesmo na ausência de 
oxigênio. 
 
 
Efeitos da composição do material em decomposição, no teor de nitrogênio mineral do 
solo. 
 
 O balanço do nitrogênio no solo, ao qual matéria orgânica fresca tenha sido adicionada, 
será afetado em maior ou menor grau dependendo da composição da matéria orgânica e da 
sua relação C/N. Alta relação C/N no material orgânico sendo adicionado, e uma constituição 
química de fácil decomposição resultará na imobilização do nitrogênio (incorporação nos 
"tecidos" nitrogenados dos microrganismos, principalmente proteínas e aminoácidos), enquanto 
que a mineralização seria uma conseqüência de uma baixa relação C/N e rápida taxa de 
decomposição dos compostos (resíduos) sendo adicionados. 
O curso destes eventos também pode ser influenciado pelo teor de umidade do solo. A 
umidade do solo pode determinar se condições aeróbicas ou anaeróbicas irão prevalecer, e 
 
41 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 
com isto o tipo de metabolismo energético a ser utilizado pelos microrganismos. Anaerobiose 
pode ser dita limitar a atividade microbiana (pois quase exclusivamente bactérias fermentam e 
exclusivamente bactérias realizam respiração anaeróbica) e pode também resultar em 
denitrificação se nitrato estiver no ambiente. Neste exercício, tipos diferentes de material 
orgânico, bem como a influência do teor de oxigênio serão analisados. 
 Várias fontes orgânicas - glicose, palha de gramíneas, palha de leguminosas que 
variam na relação C/N e na facilidade de decomposição serão usadas. A umidade será variada 
para controlar a disponibilidade de oxigênio. 
 Este tipo de experimento é utilizado quando se deseja estudar o efeito de diferentes 
aditivos (ou resíduos) na atividade microbiana do solo ou deseja-se conhecer a taxa de 
decomposição do aditivo. 
 
 
Exemplos de unidades experimentais utilizadas neste tipo de experimento: 
 
1. UNIDADE A - COM SUPRIMENTO CONTÍNUO DE O2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. UNIDADE B - SEM SUPRIMENTO DE O2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIAL 
1. Frascos 
2. Solo Unidade de Mapeamento São Pedro 
3. Aditivos Orgânicos: esterco, palha e restos de resíduos orgânicos, glicose, peptona etc. 
 
PROCEDIMENTO: 
1. Pesar 100 gramas de solo seco ao ar e colocar na unidade experimental (frasco 500 ml) 
2. Colocar o aditivo orgânico (tratamento) no frasco e misturar bem com uma espátula. 
3. Adicionar a quantidade de H2O equivalente ao tratamento ( capacidade de campo ou 
alagado). 
4. Preparar o frasco receptor de CO2 (becker de 50 ml) com 10 ml de NaOH 1 mol L-1 e 
colocar dentro da unidade experimental 
5. Vedar o frasco hermeticamente (verificar se a borracha está vedando bem a tampa para não 
perdermos gás carbônico, às vezes a borracha torce, cuidado). 
 
 Não esquecer de identificar a unidade experimental, com nome, turma e tratamento. 
 
 
 
 42
 
TRATAMENTOS: 
 
T1. Solo seco ao ar. 
T2. Solo úmido (80% da capacidade de campo) 
T3. Solo saturado 
T4. Solo úmido + 125 mg de glicose. 
T5. Solo úmido + 120 mg palha de leguminosa 
T6. Solo úmido + 120 mg de palha de gramínea 
T7. Solo seco ao ar + 120 mg de palha de gramínea 
T8. Solo saturado + 120 mg de palha de gramínea. 
T9. Solo saturado + 120 mg de palha de gramínea + 50 mg de N-NO3- 
T10. Prova em branco (sem solo) 
Composição de alguns substratos orgânicos 
SUBSTRATO Fórmula química % C %N RELAÇÃO C/N 
Glicose C6H12O6 40 0 
Palha de gramínea C53H80O40N (97%)+ 
inorg. 
42 1 42 
Palha de leguminosa C17,5H25012,5 N 
(97%)+inorg 
42 3 14 
Bactéria C4H7O1,5N (96%)+ 
inorg. 
50 14 4 
 
A quantidade de carbono adicionada com a glicose, a gramínea e a leguminosa é 
aproximadamente a mesma. 
 
INCUBAÇÃO E ANÁLISE: Os frascos permanecerão incubados a 25 oC durante uma semana. 
Ao final