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ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS, PARASITÁRIAS E AUTOIMUNES PROFA. DRA. MARIANA APARECIDA LOPES ORTIZ Reitor: Prof. Me. Ricardo Benedito de Oliveira Pró-Reitoria Acadêmica Maria Albertina Ferreira do Nascimento Diretoria EAD: Prof.a Dra. Gisele Caroline Novakowski PRODUÇÃO DE MATERIAIS Diagramação: Thiago Bruno Peraro Revisão Textual: Camila Cristiane Moreschi Danielly de Oliveira Nascimento Fernando Sachetti Bomfim Patrícia Garcia Costa Renata Rafaela de Oliveira Produção Audiovisual: Adriano Vieira Marques Márcio Alexandre Júnior Lara Osmar da Conceição Calisto Gestão de Produção: Cristiane Alves © Direitos reservados à UNINGÁ - Reprodução Proibida. - Rodovia PR 317 (Av. Morangueira), n° 6114 Prezado (a) Acadêmico (a), bem-vindo (a) à UNINGÁ – Centro Universitário Ingá. Primeiramente, deixo uma frase de Sócrates para reflexão: “a vida sem desafios não vale a pena ser vivida.” Cada um de nós tem uma grande responsabilidade sobre as escolhas que fazemos, e essas nos guiarão por toda a vida acadêmica e profissional, refletindo diretamente em nossa vida pessoal e em nossas relações com a sociedade. Hoje em dia, essa sociedade é exigente e busca por tecnologia, informação e conhecimento advindos de profissionais que possuam novas habilidades para liderança e sobrevivência no mercado de trabalho. De fato, a tecnologia e a comunicação têm nos aproximado cada vez mais de pessoas, diminuindo distâncias, rompendo fronteiras e nos proporcionando momentos inesquecíveis. Assim, a UNINGÁ se dispõe, através do Ensino a Distância, a proporcionar um ensino de qualidade, capaz de formar cidadãos integrantes de uma sociedade justa, preparados para o mercado de trabalho, como planejadores e líderes atuantes. Que esta nova caminhada lhes traga muita experiência, conhecimento e sucesso. Prof. Me. Ricardo Benedito de Oliveira REITOR 33WWW.UNINGA.BR U N I D A D E 01 SUMÁRIO DA UNIDADE INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................................5 1. FUNÇÃO RENAL ........................................................................................................................................................6 1.1 ANATOMIA RENAL ..................................................................................................................................................6 1.2 FISIOLOGIA RENAL ................................................................................................................................................ 7 1.2.1 FLUXO SANGUÍNEO RENAL ................................................................................................................................ 7 1.2.2 FILTRAÇÃO GLOMERULAR ................................................................................................................................8 1.2.3 FUNÇÃO TUBULAR .............................................................................................................................................8 2. TESTES PARA AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO RENAL. ...................................................................................................9 2.1 URINÁLISE ..............................................................................................................................................................9 2.2 UREIA .....................................................................................................................................................................9 URINÁLISE PROFA. DRA. MARIANA APARECIDA LOPES ORTIZ ENSINO A DISTÂNCIA DISCIPLINA: ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS, PARASITÁRIAS E AUTOIMUNES 4WWW.UNINGA.BR 2.3 CREATININA ...........................................................................................................................................................9 2.4 DEPURAÇÃO DE CREATININA ..............................................................................................................................9 3. URINÁLISE ............................................................................................................................................................... 10 3.1 COLETA DA AMOSTRA ........................................................................................................................................... 10 3.2 EXAME FÍSICO DA URINA .................................................................................................................................... 11 3.2.1 COR ....................................................................................................................................................................... 11 3.2.2 ASPECTO............................................................................................................................................................. 13 3.2.3 DENSIDADE ........................................................................................................................................................ 13 3.2.4 EXAME QUÍMICO DA URINA ............................................................................................................................. 14 3.2.5 PH ...................................................................................................................................................................... 14 3.2.6 PROTEÍNAS ....................................................................................................................................................... 14 3.2.7 GLICOSE ............................................................................................................................................................. 15 3.2.8 CORPOS CETÔNICOS ........................................................................................................................................ 15 3.2.9 BILIRRUBINA .................................................................................................................................................... 16 3.2.10 UROBILINOGÊNIO ............................................................................................................................................ 16 3.2.11 SANGUE .............................................................................................................................................................. 16 3.2.12 NITRITO ............................................................................................................................................................ 17 3.2.13 LEUCÓCITOS .................................................................................................................................................... 17 3.3 EXAME MICROSCÓPICO ..................................................................................................................................... 17 3.3.1 HEMÁCIAS ........................................................................................................................................................... 18 3.3.2 LEUCÓCITOS ..................................................................................................................................................... 19 3.3.3 CÉLULAS EPITELIAIS ....................................................................................................................................... 19 3.4.4 CILINDROS .........................................................................................................................................................20 3.4.5 CRISTAIS ............................................................................................................................................................22 3.4.6 MUCO .................................................................................................................................................................233.4.7 BACTÉRIAS .........................................................................................................................................................23 3.4.8 OUTROS ELEMENTOS ......................................................................................................................................23 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...........................................................................................................................................24 5WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA INTRODUÇÃO Sejam bem-vindos à disciplina de Análises Microbiológicas, Parasitárias e Autoimunes. Durante as quatro unidades abordaremos diversas áreas do diagnóstico laboratorial, perpassando pela urinálise, culturas microbiológicas, exames parasitológicos de fezes e sangue e diagnóstico imunológico. Na Unidade 1, iniciaremos abordando um dos líquidos biológicos mais utilizados para o diagnóstico de doenças e disfunções, a urina. A urina é considerada o início da medicina laboratorial, e antigamente, muitas vezes era o único parâmetro utilizado para o diagnóstico. A urina apresenta diversas características que a tornam uma amostra ideal, como o fato de ser de fácil obtenção, coleta não dolorosa ou incômoda na maioria das vezes e nela são encontradas informações sobre diversas funções metabólicas. Sua análise é um método barato e que pode servir não apenas para descobrir principais distúrbios renais, mas também distúrbios metabólicos e hepáticos. Assim, nesta unidade, abordaremos as principais características relativas à função renal e detalharemos a urinálise que é o principal exame utilizado para avaliar a função renal e de outros órgãos. 6WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 1. FUNÇÃO RENAL Para conseguirmos entender as avaliações realizadas na urinálise, precisamos inicialmente relembrar a estrutura, função e fisiologia dos rins. De forma geral, os rins apresentam como funções: a) eliminar resíduos metabólicos e substâncias químicas que são ureia, creatinina, ácido úrico, bilirrubina, medicamentos, toxinas, entre outros; b) reter nutrientes e substâncias que serão reutilizadas pelo organismo como as proteínas, aminoácidos, água, glicose, cálcio, entre outros; c) regular o equilíbrio ácido básico e hidroeletrolítico; d) regular a pressão arterial; e) sintetizar hormônios: destacam-se eritropoetina, renina, 1,25-hidroxicolecalciferol, prostaglandinas. 1.1 Anatomia Renal Figura 1- Estrutura do rim. Fonte: Anatomia do corpo (2021). Os rins são órgãos que apresentam um formato parecido com um grão de feijão e que apresentam peso aproximado de 150g em um homem adulto. Após um corte longitudinal é possível verificar duas regiões, uma camada externa (córtex) e uma camada interna (medula), como vemos na Figura 1. 7WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Figura 2 - Estrutura do néfron. Fonte: Info Escola (2021). O néfron é a unidade básica do funcionamento dos rins, sendo que cada rim apresenta aproximadamente um milhão de néfrons, os quais são responsáveis pelos processos que envolvem a fisiologia dos rins. Cada néfron é composto pelas seguintes unidades básicas: glomérulo, túbulos contorcidos proximais (TCP), alça de Henle (AH), túbulos contorcidos distais (TCD) e tubo coletor (TC) (Figura 2). No córtex são encontrados os glomérulos, os túbulos contorcidos proximais e distais. Já na medula encontram-se alças de Henle e os tubos coletores. Esses últimos drenam o líquido através das pirâmides da pelve renal para os cálices, em seguida, a urina é drenada para o ureter e dos ureteres chega até a bexiga a estrutura. 1.2 Fisiologia Renal O processo de formação da urina envolve quatro processos: fluxo sanguíneo renal, filtração glomerular, reabsorção tubular e secreção tubular. 1.2.1 Fluxo sanguíneo renal O sangue chega aos rins através da artéria renal e através das arteríolas aferentes atinge os néfrons para ser filtrado nos glomérulos. A saída do glomérulo acontece através das arteríolas eferentes. A variação entre o tamanho das arteríolas aferentes e eferentes é o que gera a pressão hidrostática necessária para que a filtração glomerular aconteça. Depois de sair pelas arteríolas eferentes, o sangue circula através dos capilares peritubulares e nos vasos retos, passando muito perto dos túbulos proximais e distais, o que faz com que seja possível a troca de substâncias, seja para reabsorção ou secreção. Já os vasos retos são adjacentes às alças de Henle, local de ocorrência da maioria das trocas de água e sais entre o sangue e a medula renal. 8WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 1.2.2 Filtração glomerular A primeira etapa de filtração do sangue inicia nos glomérulos, grosseiramente falando, os glomérulos funcionam como uma peneira na qual substâncias com peso molecular maior que 60.000 ficam retidas e as menores conseguem passar. Como dito anteriormente, a diferença de pressão entre as arteríolas aferentes e eferentes favorece a filtração glomerular. Além disso, a membrana dos glomérulos é carregada negativamente, ou seja, irá repelir moléculas que também têm carga negativa como as proteínas. O sistema renina-angiotensina-aldosterona também contribui para a filtração glomerular. Ele é ativado quando ocorrem alterações na pressão sanguínea e nos níveis plasmáticos de sódio. Quando os níveis de sódio plasmáticos estão baixos, ocorre a redução da retenção de água, diminuindo, assim, o volume sanguíneo e consequentemente a pressão sanguínea. O filtrado glomerular é quase idêntico ao plasma, com a diferença de conter quantidade diminuída de proteínas. A sua composição vai mudando conforme os mecanismos de reabsorção e secreção acontecem. 1.2.3 Função tubular Os túbulos são responsáveis tanto pela reabsorção de substâncias que foram filtradas no glomérulo, ou seja, passaram pela membrana semipermeável, quanto pela secreção de substâncias que não passaram pelo filtrado. O túbulo contorcido proximal recebe o filtrado glomerular que contém muitas substâncias essenciais ao organismo, além de metabólitos e resíduos tóxicos. Dessa forma, os TCP são responsáveis pela reabsorção de: cerca de 25% da água, sódio e cloretos filtrados; toda glicose filtrada até o limiar de reabsorção; quase todos os aminoácidos, vitaminas e proteínas; quantidades variáveis de íons diversos (cálcio, magnésio, potássio); 98 a 100% do ácido úrico. A água, a ureia e os cloretos são reabsorvidos de forma passiva (sem gasto de energia), já outras substâncias são reabsorvidas ativamente, ou seja, com gasto de energia. Nos TCP também são secretados íons hidrogênio, histamina e medicamentos como a penicilina. E principalmente na alça de Henle e no TC acontecerá a regulação do equilíbrio ácido básico com a secreção de íons hidrogênio e de água. O limiar renal é a concentração plasmática de uma substância no qual o transporte ativo para reabsorção tubular para. Dessa forma, quando a concentração de uma substância atinge níveis anormalmente altos no plasma, a capacidade de reabsorção dos túbulos é ultrapassada e essa substância aparece na urina. O limiar da glicose, por exemplo, é de 160 a 180 mg/dL, ou seja, quando as concentrações de glicose sanguínea ultrapassam esses valores, ela passa a ser eliminada na urina, podendo servir de indícios de Diabetes. 9WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 2. TESTES PARA AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO RENAL. Diversos testes podem ser utilizadospara avaliação da função renal, sabendo que cada um apresenta um objetivo específico será abordado os principais testes com breves descrições, em relação a urinálise, esta será abordada com mais detalhes. 2.1 Urinálise É um exame de rotina, não invasivo, também conhecido como parcial de urina, ou urina I. Ele fornece diversas informações gerais a respeito do funcionamento dos rins e do trato urinário inferior. 2.2 Ureia A ureia é o principal composto nitrogenado (não proteico) encontrado no sangue. Ela é filtrada pelos glomérulos nos rins, e sobre reabsorção passiva nos túbulos (até 70%). A dosagem de ureia no sangue pode fornecer muitas informações a respeito do funcionamento renal. A ureia quando em valores aumentados são chamados de azotemias e podem estar relacionados, entre outros fatores, às doenças como insuficiência renal aguda ou crônica, glomerulonefrite, ou até obstruções do trato urinário. 2.3 Creatinina A creatinina é excretada pelos rins, em velocidade constante e em valores proporcionais à massa muscular da pessoa, uma vez que ela é formada nos músculos a partir da creatina. A creatinina é filtrada pelos glomérulos e normalmente não é reabsorvida nos túbulos. Valores altos de creatinina no sangue estão sempre associados com uma função renal anormal, especialmente na filtração glomerular. 2.4 Depuração de Creatinina A depuração ou “clearance”, corresponde ao volume de plasma que é filtrado nos glomérulos por minuto no que tange a substância que é totalmente excretada e não é reabsorvida. Sendo assim, essa dosagem é utilizada para avaliar a filtração glomerular. Essa dosagem apresenta diversas vantagens, uma vez que a creatinina tem produção constante e não sofre influência da dieta, sendo, portanto, filtrada e não reabsorvida. É normalmente utilizado a urina de 24 horas para isso. Uma abordagem simples a respeito da insuficiência renal e do exame de creatinina pode ser vista no vídeo: Saiba de seus rins estão doentes. Disponível em: https://youtu.be/jOIcaY8-Vcc. Acesso em 10 jan. 2021 10WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 3. URINÁLISE 3.1 Coleta da Amostra A coleta da amostra é uma das etapas mais importantes para que os resultados da urinálise sejam fiéis e confiáveis. O recipiente para a coleta deve ser limpo, seco e de boca larga. Lembrando que os frascos devem ser corretamente identificados com o nome do paciente, data e hora da coleta. Para a coleta da amostra o paciente deve ser instruído a realizar a higienização da região genital, no ato de urinar é preciso desprezar o primeiro e último jato de urina, coletando o jato médio. Esse procedimento é importante, pois o primeiro jato de urina normalmente é contaminado com muitas células e algumas bactérias da microbiota. Normalmente, é utilizada a coleta da primeira urina da manhã, uma vez que ela é mais concentrada e pode refletir melhor o funcionamento dos rins. Em relação a pacientes hospitalizados ou com dificuldades para realizar a micção espontânea para a coleta podem ser utilizados cateteres que cheguem até a bexiga passando pela uretra. Em se tratando de recém-nascidos e crianças com pouca idade são utilizados coletores de plástico com adesivos que se fixam à região genital da criança. Para minimizar as chances de contaminação da amostra, o coletor deve ser trocado a cada trinta minutos, e realizada uma nova higienização local, caso a criança não tenha urinado. Se a indicação do exame for para a coleta de urina de 24 horas, esta terá o intuito de analisar o volume e a concentração de determinados analitos e consiste na coleta de toda a urina eliminada nesse período. A urina que for sendo coletada durante o dia deve ser mantida sob refrigeração para que se preserve as características da amostra. Caso a necessidade seja de uma amostra que represente exatamente o que está acontecendo na bexiga, sem que haja contaminação pelas vias urinárias, a coleta é ideal é a punção suprapúbica. Esta consiste na inserção de uma agulha que atinja a bexiga, por ser uma técnica totalmente estéril, todos os microrganismos, caso sejam visualizados, estavam realmente dentro da bexiga. A amostra de urina deve ser entregue ao laboratório o mais rápido possível e deve ser analisada dentro de no máximo uma ou duas horas. Caso não seja possível analisá-la neste prazo, a amostra deve ser armazenada sob refrigeração e se a mesma amostra de urina for utilizada para a cultura microbiológica, ela deve ser refrigerada até o momento do cultivo. Quando houver necessidade de uso de conservante, ele deve ser capaz de inibir o crescimento microbiano, preservar os elementos urinários e não interferir nos testes químicos. 11WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA A urina não preservada pode apresentar diversas alterações que foram resumidas no Quadro 1. Analito Alteração Causa Cor Modificada/escurecida Oxidação ou redução de metabólitos Aspecto Turva Crescimento bacteriano e precipitação de material amorfo Odor Aumentado Multiplicação bacteriana ou metabolização da ureia para amônia pH Aumentado Metabolização da ureia para amônia por bactérias produtoras de uréase/ perda de CO2 Glicose Reduzida Glicólise e consumo bacteriano Cetonas Reduzidas Volatilização e metabolismo bacteriano Bilirrubina Reduzida Foto-oxidação Urobilinogênio Reduzido Oxidação Nitritos Aumentados Multiplicação de bactérias redutoras de ni-trato Eritrócitos, leucócitos e cilindros Reduzidos Desintegração Bactérias Aumentadas Multiplicação Quadro 1- Alterações na urina não preservadas. Fonte: A autora. 3.2 Exame Físico da Urina O exame físico da urina inclui a determinação da cor, aspecto e gravidade específica ou densidade. 3.2.1 Cor Normalmente, a urina tem cor amarela, isso acontece devido a excreção de três pigmentos: o urocromo (amarelo), uroeritirina (vermelho) e urobilina (laranja). A intensidade da cor está relacionada diretamente com a concentração da amostra, ou seja, quanto maior a ingestão de líquidos mais clara é a urina, quanto menor a ingestão de líquidos mais escura é a cor da urina. A coloração da urina também pode ser influenciada por substâncias ingeridas como corantes alimentares ou medicamentos. Além disso, outras colorações diferentes do amarelo podem indicar algumas patologias. Uma descrição das principais alterações de cor pode ser visualizada no Quadro 2. 12WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Cor Causa Correlação Clínico/Laboratorial Incolor Ingestão recente de fluídos Comumente observada com amostras aleatórias Amarela pálida Poliúria ou diabetes insípidus Diabetes mellitus Amostra aleatória diluída Volume de 24 horas elevado. Elevada gravidade específica e resultado positivo para glicose Consumo recente de fluídos Amarela escura Amostra concentrada Pode ser normal após exercício extenuante ou na primeira amostra da manhã Desidratação pela febre ou queimadura Âmbar/Laranja Bilirrubina Acriflavone Fenazopiridina (Pyridium) Nitrofurantoína Espuma amarela, quando agitada, e resultado positivo para bilirrubina Teste negativo para bile é possível fluorescência verde Drogas comumente usadas para infecções urinárias Pode ter espuma laranja e pigmento laranja denso que podem interferir com as leituras das tiras reagentes Amarela-verde Bilirrubina oxidada Espuma colorida na urina ácida e resultados falso-negativos para bilirrubina Verde Infecção por Pseudomonas Urocultura positiva Azul-verde Amitriptilina/Metocarbamol Medicamentos Rosa/Vermelha Eritrócitos Hemoglobina Mioglobina Porfirinas Beterraba Rifampicina Contaminação menstrual Urina turva com resultados positivos da análise química de hemoglobina e eritrócitosvisíveis microscopicamente Urina límpida com resultados positivos de hemoglobina, hemólise intravascular Lesão muscular Negativo para hemoglobina Detectada sob luz ultravioleta Alimentos Medicamentos Amostra turva com eritrócitos, muco e coágulos Marrom/Preta Hemoglobina oxidada/ metemoglobina Derivados do fenol/Argirol/ Metildopa ou levodopa/ Metronidazol Visto em urinas ácidas um tempo após a coleta; resultado positivo da análise química para hemoglobina Medicamentos/antissépticos Quadro 2 - Coloração da urina, possíveis correlações clínico-laboratoriais. Fonte: A autora. 13WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 3.2.2 Aspecto A urina recém-emitida deve apresentar-se clara e transparente. Com o passar do tempo ela começa a ficar turva, devido a presença de muco e precipitação de cristais. Em situações anormais, a urina pode estar turva devido a presença de leucócitos, bactérias, hemácia, cilindros, cristais, entre outras substâncias. No Quadro 3 é possível observar situações patológicas de turvação da urina e no Quadro 4 situações não patológicas. Eritrócitos Leucócitos Bactérias Fungos Células epiteliais não escamosas Cristais anormais Linfa Lipídeos Quadro 3 - Causas patológicas de turvação na urina. Fonte: A autora (2021). Células epiteliais escamosas Muco Fosfatos, carbonatos e uratos amorfos Sêmen, espermatozoides Contaminação fecal Meio de contraste radiográfico Cremes vaginais Talco Quadro 4 - Causas não patológicas de turvação na urina. Fonte: A autora (2021). 3.2.3 Densidade A densidade normal da urina varia de 1,010 a 1,030 e ela indica a concentração de sólidos que estão solubilizados na urina. A densidade é um bom marcador para avaliar a concentração da urina e consequentemente o estado de hidratação do paciente. A densidade pode ser dosada através das tiras reativas (método químico que será descrito nos próximos tópicos) ou através de um densitômetro ou refratômetro. 14WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 3.2.4 Exame químico da urina O exame químico da urina é realizado através de tiras reagentes, se trata de um método simples e rápido. Para a realização dessa parte do exame é necessário que a amostra de urina atinja temperatura ambiente para que não ocorram interferências. O método consiste, basicamente, em mergulhar uma tira reativa colorida na urina e comparar as cores que se formam ao misturar-se com as cores de referência. O kit, que pode ser comprado, poderá ser visualizado na Figura 3 e a descrição dos parâmetros avaliados pelo exame químico estes serão descritos abaixo: Figura 3 - Exame químico da urina. Fonte: MD Saúde (2021). 3.2.5 pH A avaliação do pH irá mostrar a capacidade dos rins em manter a concentração dos íons hidrogênio. O pH normal da urina recém eliminada é em torno de 6,0. Sabe se que a determinação do pH também é útil para identificação de cristais que serão visualizados no exame microscópico do sedimento urinário. Alguns cristais normalmente são encontrados em urina ácida e alguns em urinas alcalinas. Em caso de urinas muito ácidas o indicativo pode ser dentre eles: dieta rica em proteínas e algumas frutas, Diabetes mellitus, doenças respiratórias e o uso de alguns medicamentos. Em situação de urinas alcalinas estas podem indicar alcalose metabólica, vômitos excessivos ou uma dieta rica em verduras. 3.2.6 Proteínas As proteínas estão presentes na urina, porém em quantidades pequenas, o equivalente a 150 mg/24 horas ou 10 mg/dL. Essa pequena quantidade de proteínas que, normalmente, é eliminada na urina corresponde basicamente à proteína Tamm-Horsfall. Em relação às proteínas com peso menor que 60.000 daltons estas são filtradas pelos glomérulos, mas são quase totalmente reabsorvidas pelos túbulos. A albumina possui 67.000 daltons de peso molecular, e parte dela chega até o filtrado glomerular e a maior parte reabsorvida nos túbulos. 15WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Dessa forma, o fato de as proteínas aparecerem aumentadas na urina pode ser indicativo de estar havendo aumento da permeabilidade da membrana do glomérulo ou diminuição da reabsorção tubular. A eliminação de quantidades aumentadas de proteínas na urina recebe o nome de proteinúria. A identificação química, normalmente, se dá através da identificação de albumina na urina, uma vez que ela é a proteína que mais é eliminada na urina nesses casos. A proteinúria pode ser classificada como: Proteinúria pré-renal: a eliminação de proteínas em excesso não apresenta relação com os rins. Ela pode estar relacionada à produção excessiva de proteínas de baixo peso molecular, que passarão pelo glomérulo, como por exemplo a proteínas de Bence Jones, no mieloma múltiplo; ou devido ao aumento da pressão hidrostática, que força a passagem de substâncias pela membrana do glomérulo, o que pode estar acontecendo em pessoas com hipertensão arterial ou insuficiência cardíaca congestiva, por exemplo. b) Proteinúria glomerular: decorrente de doenças glomerulares, como glomerulonefrite e síndrome nefrótica. Nesse caso, quanto maior a lesão renal, maior será a perda de proteínas. c) Proteinúria tubular: em doenças como pielonefrite, necrose tubular, em casos de intoxicação por metais pesados, entre outros, ocorre lesão dos túbulos, fazendo com que eles não sejam capazes de reabsorver completamente as proteínas filtradas. d) Proteinúria pós renal: é o tipo de proteinúria decorrente de problemas nas vias urinárias baixas, como em infecções/inflamações de bexiga (cistite) ou uretrites. Nesses casos ocorrem aumento da mobilização de proteínas devido ao exsudato inflamatório. Resultados falso-positivos podem ser observados em urinas muito alcalinas (pH acima de 9,0) ou com amostra contaminadas com detergentes e alcaloides em geral. Já resultados falso- negativos estão relacionados com proteinúria de Bence-Jones, presença de outras proteínas que não sejam albumina e grande concentração de sais. 3.2.7 Glicose A glicose, como já relatado, é uma substância que é filtrada pelos glomérulos e é reabsorvida totalmente pelos túbulos até atingir o limiar renal. A glicosúria é o aparecimento de glicose na urina e acontecerá em casos em que a glicose sanguínea ultrapasse o limiar. Essa dosagem passa a ser, especialmente, útil para monitorar paciente diabéticos. Além disso, a glicosúria também pode acontecer em casos de lesões renais que comprometam a reabsorção tubular com o uso de alguns medicamentos, como os corticoides, entre outras situações. É importante ressaltar que resultados falso-negativos podem acontecer na presença de altas concentrações de vitamina C (ácido ascórbico), aspirina, corpos cetônicos, ou até quando existir falha na conservação da urina, o que favorecerá o consumo da glicose por bactérias. 3.2.8 Corpos cetônicos São produtos do metabolismo de lipídios que compreendem aos ácidos acetoacético, betahidroxibutírico e a acetona. A cetonúria está muito relacionada com o diabetes na qual, muitas vezes, existe lipólise e também pode acontecer em inanição, dietas, após exercícios físicos intensos, entre outros. Entre as possíveis interferências, resultados falso-positivos podem aparecer com o uso de determinados medicamentos, como L-dopa e fenolftaleína; já resultados falso-negativos acontecem devido à má conservação da urina, uma vez que os corpos cetônicos são substâncias voláteis. 16WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 3.2.9 Bilirrubina A bilirrubina normalmente aparecerá na urina quando sua concentração plasmática ultrapassar o limiar renal e nãofor mais reabsorvida. Nesse caso, estamos falando de bilirrubina direta, que foi conjugada e tornou-se hidrossolúvel, sendo capaz de chegar até os rins. Esse aumento pode ser decorrente de hepatites, colestases e cirrose. A presença de bilirrubina na urina, ou bilirrubinúria = confere à urina uma cor amarela intensa ou âmbar. Entre as interferências, resultados falso-positivos podem acontecer devido a utilização de outras substâncias coradas; já os resultados falso-negativos também são decorrentes da má conservação da urina, uma vez que a bilirrubina é fotossensível, e se degrada com a exposição à luz, além disso, a presença de quantidades elevadas de ácido ascórbico e bactérias que decomponham a bilirrubina também podem causar resultados falso-negativos. 3.2.10 Urobilinogênio O urobilinogênio também está relacionado com a bilirrubina. Ele é um pigmento biliar formado pela ação de bactérias sobre a bilirrubina direta. Uma parte desse pigmento chega nos rins é filtrado pelos glomérulos e eliminado na urina com concentrações próximas a 1,0 mg/ dL. Em distúrbios que aumentem a quantidade de bilirrubina, como doenças hemolíticas, entre outras, são responsáveis pelo aumento da eliminação de urobilinogênio. Entre as possíveis interferências, também podemos citar como falso-positivos o uso de substâncias coloridas e falsos-negativos podem acontecer com altas concentrações de ácido ascórbico, de bactérias e principalmente a má conservação, uma vez que o urobilinogênio, assim como a bilirrubina, é degradado pela luz. 3.2.11 Sangue O sangue pode aparecer na urina de duas formas: na forma de hemácias íntegras, o que recebe o nome de hematúria, ou de hemoglobina cujo o nome será hemoglobinúria. A hematúria pode estar relacionada aos cálculos renais, glomerulonefrite, tumores, traumatismos, pielonefrite, entre outras situações que façam com que hemácias íntegras sejam liberadas no trato urinário. Já a hemoglobinúria está relacionada a situações de lise de hemácias, seja no trato urinário ou não. A diferenciação entre a presença ou não de hemácias íntegras acontecerá no exame microscópico do sedimento urinário, que será abordado na sequência desse material. Entre as interferências que podem causar resultados falso-positivos temos a contaminação menstrual, detergente oxidantes nos frascos de coleta e peroxidases (vegetais ou microbianas) e também níveis elevados de ácido ascórbico e infecções graves do trato urinário podem levar a resultados falso-negativos. 17WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 3.2.12 Nitrito A pesquisa de nitrito tem por função principal a detecção precoce de infecções do trato urinário. Diversas bactérias, especialmente as Gram negativas, tem capacidade de reduzir nitrato em nitrito. Dessa forma, resultados de nitrito positivos, podem indicar a presença de tais bactérias. Como interferências, amostras mal conservadas podem apresentar resultados falso- positivos, uma vez que bactérias contaminantes da amostra podem proliferar-se. Já resultados falso-negativos podem acontecer quando uma infecção é causada por leveduras ou bactérias Gram positivas, as quais normalmente não transformam nitrato em nitrito. Poderá também ser em urinas com pH abaixo de 6,0, ou ainda com o consumo de grandes quantidades de ácido ascórbico. 3.2.13 Leucócitos A pesquisa de leucócito é extremamente útil para diagnosticar infecções e processos inflamatórios no trato urinário. Assim como a pesquisa de hemácias, os leucócitos, caso presentes, poderão ser vistos no exame microscópico do sedimento urinário. Porém, o exame químico é capaz até de identificar leucócitos que possam ter sido degradados. Resultados falso-positivos podem acontecer devido a contaminação com agentes oxidantes fortes e falso-negativos na presença de grandes quantidades de glicose e proteínas na amostra. 3.3 Exame Microscópico O exame microscópico do sedimento urinário é realizado com a finalidade de detectar e identificar os elementos insolúveis que possam estar presentes na urina. Ele é realizado após a centrifugação da amostra de urina utilizando o sedimento. 18WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 3.3.1 Hemácias As hemácias normalmente não atravessam os néfrons íntegros, como já dito anteriormente, elas aparecerão na urina em casos de lesões, traumatismos, infecções, entre outras situações. No exame microscópico elas aparecerão como discos incolores (Figura 4). É considerado normal o aparecimento de até 1000 hemácias/mL de urina. As Hemácias, no exame microscópico, aparecem como pequenos discos incolores, como pode ser visto nas setas Figura 4 - Hemácias no exame microscópico. Fonte: Biomedicina Padrão (2021). [A forma como as hemácias são vistas no exame microscópicos também é muito importante para o diagnóstico de diversas doenças renais. Maiores informações e detalhes sore esse assunto podem ser encontrados no texto de MEHL, L.S., GREGÓRIO, P.C., MACIEL, R.A.P.: A importância do diagnóstico de dimorfismo eritrocitário na hematúria. Anais do EVINCI-UniBrasil, v. 1, n.4, p. 120-131, 2016. Disponível em: http://portaldeperiodicos.unibrasil.com.br/index.php/anaisevinci/article/ viewFile/860/836. 19WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 3.3.2 Leucócitos Como já descrito anteriormente, os leucócitos estarão presentes em processos inflamatórios e infecciosos. Esses leucócitos aparecem no exame microscópico como células arredondadas, maiores que as hemácias, que possuem grânulos citoplasmáticos e núcleos lobulados (Figura 5). Os valores de referência podem variar entre alguns laboratórios, mas normalmente aceita-se que sejam visualizados até 7.000 ou 10.000 leucócitos/mL de urina. Figura 5 - Leucócitos no exame microscópico de sedimento urinário. Fonte: Atlas de Urinálise (2021). 3.3.3 Células epiteliais Alguns tipos de células epiteliais podem aparecer normalmente no sedimento urinário. Três tipos de células podem ser encontrados, sendo elas: epiteliais escamosas, epiteliais transicionais e células dos túbulos renais. As células epiteliais escamosas são as mais frequentes, sua presença é pouco significativa. São células provenientes da vagina ou uretra, e muitas vezes aparecem na urina por contaminação de uma coleta malfeita, por não ter sido feita uma boa higienização prévia ou não foi desprezado o primeiro jato de urina. Essas células apresentam formato retangular ou arredondado e núcleo central (Figura 6). É considerado normal o aparecimento de até 10.000 células/mL. Figura 6 - Células epiteliais escamosas em exame de sedimento urinário. Fonte: Atlas de Urinálise (2021). 20WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA As células epiteliais transicionais, também chamadas de caudadas, são originárias da pelve renal, do cálice, do ureter e da bexiga. São menores, esféricas, caudadas ou poliédricas, com núcleo central (Figura 7). Quantidades pequenas dessas células podem ser encontradas na urina em condições normais e podem estar aumentadas em casos de cauterização ou cicatrização. As células do epitélio renal também podem estar presentes em quantidades pequenas no sedimento urinário normal decorrente da descamação de células velhas e em quantidades aumentadas, normalmente indicam doença renal ativa ou lesão tubular. Elas se apresentam como células arredondadas, com núcleo redondo e excêntrico (Figura 7). Figura 7 - Células da pelve renal (à direita) e células do epitélio renal (à esquerda) em exame de sedimento urinário. Fonte: Aprendendo Saúde (2021). 3.4.4 Cilindros Os cilindros são os únicos elementosexclusivamente renais encontrados no sedimento urinário. Eles formam-se na luz do TCD, possibilitando assim, uma visão microscópica do que acontece no interior dos néfrons. Dessa forma, os cilindros tomam forma daquilo que está presente no filtrado no momento da sua formação, podendo ser hemácias, leucócitos, células, bactérias, entre outros elementos (Figuras 9 e 10). O componente básico dos cilindros é a glicoproteínas de Tamm-Horsfall que é secretada pelas células tubulares. Algumas situações fisiológicas podem favorecer o aparecimento de cilindros no sedimento urinário, como exercícios físicos intensos, aumento da acidez urinária, entre outros, porém de forma geral os cilindros não devem aparecer na urina. 21WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA O Quadro 5 mostra os principais tipos de cilindros e as situações em que eles podem ser encontrados na urina. Tipo de cilindro Características Origem e significado clínico Hialinos Incolores e pouco refringentes Os mais frequentes, constituídos principalmente por proteína de Tamm-Horsfall. Elevado em exercício físico intenso, desidratação e estresse emocional. Em número elevado glomerulonefrite, pielonefrite, doença renal crônica. Hemáticos Refringentes, cor amarelo- marrom. Podem conter hemácias integras Indicam sangramento proveniente do interior do néfron. Sua presença relaciona-se principalmente com glomerulonefrite. Leucocitários Refringentes, contém grânulos e núcleos multilobulados. Significa infecção ou inflamação no interior dos néfrons. Aparecem na pielonefrite, glomerulonefrite. Epiteliais Contém células tubulares com núcleo redondo. Formados de células epiteliais tubulares sem muita matriz proteica. Em presença de lesão tubular, as células tubulares onde as fibrilas da proteína Tamm-Horsfall se prendem soltam-se com o cilindro. Pielonefrite e glomerulonefrite. Granulosos Possuem grânulos. Aparecem após estresse e exercício físico vigoroso. Nos processos patológicos, os grânulos podem representar desintegração de cilindros celulares ou leucocitários devido à estase urinária. Céreos Refringentes, com textura rígida, largo, com fendas laterais, amarelados e opacos. Indicam extrema estase urinária devido a processo tubular grave. Resultante da degeneração proteica em túbulos que permaneceram longo tempo sem funcionar. A água vai sendo reabsorvida e o cilindro transforma-se numa massa desidratada, como cera. Gorduroso Refringentes, contendo gotículas gordurosas marrom-amareladas. Formados pela agregação de gotículas lipídicas livres à matriz proteica. Encontrados juntamente com corpos adiposos ovais na síndrome nefrótica. Quadro 5 - Tipos de cilindros, características, origem e significado clínico. Fonte: A autora (2021). Figura 9 - Cilindro hemático a direita e leucocitário a esquerda. Fonte: Atlas de Urinálise (2021). 22WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Figura 10 - Cilindros em exame de sedimento urinário. A - Hialino; B – Hialino com gordura; Hialino/Granular; D – Celular; E – Celular/Granular; F – Granular; G – Celular fino; H – Celular/céreo; I – Céreo. Fonte: Biomedicina Padrão (2021). 3.4.5 Cristais Os cristais são elementos bastante comuns na urina. Sua identificação é muito importante para avaliar se representam ou não anormalidades. Eles são formados pela precipitação de sais da urina quando submetidos a alterações de pH, de temperatura ou concentração, tornando-os insolúveis. A determinação do pH urinário é muito importante, pois auxilia na identificação das substâncias que estão precipitadas. Entre os cristais normais de urina ácida destacam-se: uratos, oxalato de cálcio, ácido úrico. Entre os cristais normais de urina alcalina encontram-se: fosfatos, biurato de amônio, carbonato de cálcio. Já entre os cristais anormais, podemos citar os de origem medicamentosa e os de origem metabólica (cistina, tirosina, leucina, colesterol e bilirrubina). É importante ressaltar que os cristais anormais, ou patológicos são em sua maioria cristais de urina ácida. O Quadro 6 mostra as situações em que esses cristais anormais podem estar presentes, e na Figura 11 é possível ver alguns cristais em exames microscópicos do sedimento urinário da esquerda para a direita teremos os cristais de ácido úrico, cristal de fosfato triplo e cristal de bilirrubina Cristal Correlação clínico-laboratorial Medicamentosos Sulfadiazina, sulfametoxasol, ampicilina, aspirina, contraste radiológico, etc. É importante que sejam identificados. Caso não seja possível, relatar a presença de substância não identificada e sugerir que seja um medicamento. Cistina Urina ácida. Indicam um defeito metabólico no transporte tubular de aminoácidos. Pacientes apresentam tendência para a formação de cálculos. Tirosina Quando presentes podem indicar doença hepática grave. Leucina Urina ácida. Podem indicar doenças hepáticas e defeitos do metabolismo de aminoácidos. Colesterol Sua presença pode ser indicativa de síndrome nefrótica Bilirrubina Doenças hepáticas onde o nível de bilirrubina plasmática está alto. Quadro 6 - Cristais anormais e principais correlações clínico laboratoriais. Fonte: A autora. 23WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Fígura 11- Cristais na urina. Fonte: Lacvet UFRGS (2021). 3.4.6 Muco É o material proteico produzido por células do sistema urogenital e não é considerado clinicamente significativo. No microscópio são visualizados como estruturas filamentosas com baixo índice de refração. 3.4.7 Bactérias A urina quando está normal não deve apresentar bactérias. A presença das bactérias pode indicar contaminação com material da própria microbiota ou uma infecção. Após a visualização de bactérias, a bacterioscopia através da coloração de Gram pode ser realizada para classificar essa bactéria de acordo com as suas afinidades morfotintoriais. 3.4.8 Outros elementos Outros elementos podem ser visualizados na urina, como leveduras, parasitas, espermatozoides, e até alguns artefatos que podem ser encontrados devido condições inadequadas de coleta, como pelos, tecidos, etc. O encontro de espermatozoides em urinas de mulheres não deve ser relatado, uma vez que é algo antiético. Já em urinas masculinas, depende do procedimento padrão de cada laboratório, mas pode ser importante relatar, visto que em algumas situações pode indicar distúrbios ejaculatórios. 24WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 1 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA CONSIDERAÇÕES FINAIS Encerramos aqui a unidade I com o estudo de um dos exames mais realizados em todos os laboratórios de análises clínicas, a urinálise. Foi possível entender quais são as fases que compõem esse exame tão simples, mas tão rico em resultados, e que pode auxiliar no diagnóstico de diversas patologias. 2525WWW.UNINGA.BR U N I D A D E 02 SUMÁRIO DA UNIDADE INTRODUÇÃO ...............................................................................................................................................................27 1. IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA ...............................................................................................................................28 2. IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE ...............................28 2.1 SISTEMA R/B .........................................................................................................................................................29 2.1.1 PROVA DA OXIDASE .............................................................................................................................................302.1.2 TRÍPLICE AÇÚCAR FERRO (TSI): .....................................................................................................................30 3. IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES DE GLICOSE ...............................32 3.1 PRIMEIROS INDÍCIOS DE QUE UM ISOLADO DESCONHECIDO É UM NÃO-FERMENTADOR .......................32 3.1.1 IDENTIFICAÇÃO PRELIMINAR ............................................................................................................................32 4. IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS ...................................................................................................34 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS PROFA. DRA. MARIANA APARECIDA LOPES ORTIZ ENSINO A DISTÂNCIA DISCIPLINA: ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS, PARASITÁRIAS E AUTOIMUNES 26WWW.UNINGA.BR 5. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE INFECÇÕES BACTERIANAS DO TRATO URINÁRIO ..................................35 5.1 TÉCNICA DE CULTURA PARA CONTAGEM DE COLÔNIAS ................................................................................35 5.1.1 TÉCNICA DA INOCULAÇÃO COM PIPETA (TÉCNICA POR DILUIÇÕES) .........................................................36 5.1.2 TÉCNICA DE “POUR PLATE” ..............................................................................................................................36 5.1.3 TÉCNICA DA ALÇA CALIBRADA .........................................................................................................................36 5.1.4 ESCOLHA DO VOLUME DA ALÇA CALIBRADA ..................................................................................................37 5.2 MEIO DE CULTURA E CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO .........................................................................................37 5.3 INCUBAÇÃO ...........................................................................................................................................................38 5.4 INTERPRETAÇÃO ..................................................................................................................................................38 5.5 REPORTE DE RESULTADOS .................................................................................................................................38 6. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS POR DISCO-DIFUSÃO ...................................................39 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...........................................................................................................................................40 27WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA INTRODUÇÃO O diagnóstico microbiológico pode ser utilizado para as mais diversas amostras, uma vez que seu objetivo é diagnosticar a presença ou não de uma bactéria que possa estar causando infecção. Dentro deste contexto, cada amostra ou material pode apresentar suas particularidades dentro no cultivo e interpretação dos resultados. Nessa unidade abordaremos a identificação das principais famílias de bactérias, a detecção de microrganismos em amostra de urina, que é um dos exames de cultura mais utilizados e realizados por todos os laboratórios clínicos e abordaremos também um pouco sobre o antibiograma por disco difusão. É importante ressaltar muitos laboratórios utilizam metodologias automatizadas para a identificação das espécies de microrganismos, porém é necessário conhecer as particularidades da identificação das principais famílias e do cultivo das principais amostras para que se possa compreender e interpretar os possíveis resultados. 28WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 1. IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA Entre as bactérias mais comumente relacionadas com patologias humanas, a grande maioria pode ser classificada em Gram positiva ou Gram negativa de acordo com as características da sua parede celular. Dessa forma, uma das primeiras técnicas empregadas é a coloração de Gram, pois dessa forma, já é possível classificar a bactéria pelas suas características morfotintoriais, ou seja, saber se ela é um bacilo, coco, cocobacilo etc., e se é Gram positiva ou Gram negativa. Conhecer essas características é fundamental para direcionar a identificação da família, gênero ou espécie bacteriana. A coloração de Gram consiste em cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto, escorrer o corante, cobrir com lugol por 1 minuto, lavar em água corrente de baixa pressão, descorar com álcool-cetona (tempo delicado) por 5 a 10 segundos, lavar em água corrente de baixa pressão, corar com fucsina por 30 segundos, lavar em água corrente de baixa pressão, deixar secar ao ar e realizar a leitura em microscópio em objetiva de imersão. Interpretação: As bactérias Gram positivas aparecem coradas em azul-escuro e as Gram negativas em rosa. 2. IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE Os bacilos Gram negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae são microrganismos frequentemente isolados de amostras clínicas enviadas aos laboratórios de microbiologia. Atualmente, dispomos de vários esquemas para a identificação das enterobactérias podendo estes ser fornecidos aos laboratórios clínicos em kits comerciais. Anteriormente, a identificação das espécies de Enterobacteriaceae era realizada com a utilização de fluxogramas, entretanto, não estão sendo utilizados com frequência, pois sistemas compactos numéricos de perfis e dados de referência computadorizados foram bastante difundidos. Com o emprego dos sistemas de identificação tornou-se possível definir “biotipos” no qual muitas espécies bacterianas conhecidas podem ser subagrupadas. Os números de biotipos estão baseados em dados obtidos a partir da análise de milhares de reações bioquímicas e a biotipificação é uma valiosa ajuda para reconhecer grupos bacterianos, pois durante uma investigação epidemiológica ou quando se estuda a fonte de infecções cruzadas nos hospitais. A análise dos biotipos de algumas espécies bacterianas pode levar a uma melhor interpretação acerca de como a variação das características de identificação pode estar relacionada com diferenças conhecidas quanto a virulência de diferentes cepas. Para relembrar como é feita e como funciona a coloração de Gram, você pode acessar o vídeo: “Coloração de Gram”. Disponível em: , https://www.youtube.com/watch?v=mF3jAU6Dy4I. 29WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA No comércio brasileiro, existem sistemas computadorizados de identificação baseada em combinações de provas bioquímicas organizadas em kits compactos de utilização direta de substrato (BAC-TRAY, API-20, BBL-CRYSTAL), como também, kits que empregam meios de cultura (LABORCLIN, BIOPROV, PROBAC, NEWPROV). Existem ainda os sistemas automatizados (MICROSCAN, VITEK, PHOENIX). Em todos os casos os parâmetros usados são muito semelhantes. Assim sendo, a escolha de um deles é uma questão de preferência pessoal. É importante lembrar que um bom diagnóstico microbiológico não depende somente de uma série de características diferenciais e que o sistema de identificação não é um dispositivo infalível. O microbiologista deve integrar os dados bioquímicos às características coloniais (cor, tamanho, textura, odor, reações hemolíticas), à coloração de Gram, aos caracteres morfológicos e, se disponíveis, às reações sorológicas, para então efetuar uma identificação final de forma confiável. O microbiologista deve conhecer os princípios das provas bioquímicas empregadas no laboratório a fim de que qualquer inconsistência bioquímica, problemas com culturas mistas ou técnicas errôneas possam ser rapidamente conhecidas e corrigidas. Nesta unidade estão apresentadasas provas bioquímicas básicas de um sistema de identificação conhecido como R/b, utilizado para a identificação de bacilos Gram negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae. O mecanismo bioquímico aqui apresentado será sempre o mesmo, independente do sistema utilizado. As características comuns da família Enterobacteriaceae são: a) São bacilos Gram negativos; b) Crescem bem em meios comuns de cultura, como ágar MacConkey; c) São oxidase negativa (Exceção: Plesiomonas shigelloides); d) Fermentam a glicose com ou sem produção de gás. 2.1 Sistema R/b A identificação de enterobactérias por esse método utiliza um sistema de identificação bioquímica (R/b) que é composto por 6 tubos. Estas provas, quando positivas, devem ser consideradas numericamente pelo valor a elas expresso e depois de somadas, estas resultam em um número de 4 algarismos que corresponde ao biótipo o qual deve ser procurado num catálogo para a determinação do provável micro-organismo isolado. Nem todos os biotipos sugerem uma identificação precisa e simples, alguns requerem provas complementares. Pode-se liberar um resultado, com confiança, quando a chance do micro-organismo em questão for acima de 95 %. Figura 1 - Esquema de leitura e definição de espécies da família Fonte: Enterobacteriaceae (2021). 30WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 2.1.1 Prova da oxidase Esta prova tem por objetivo determinar a presença da enzima oxidase (citocromo oxidase). É uma etapa determinante da identificação dessa família, uma vez que a grande maioria das bactérias dessa família são oxidase negativa. Assim, quando essa prova é negativa, o diagnóstico é direcionado para as próximas provas de identificação. O mecanismo dessa reação é baseado no fato de que os citocromos são hemeproteínas que agem como o último elo na cadeia da respiração aeróbia, por transferir elétrons (Hidrogênio) para o oxigênio, com a formação de água. O sistema citocromo ocorre em organismos aeróbios, microaerofílicos e em anaeróbios facultativos, podendo estar associado nestes casos à enzima oxidase. A prova da oxidase é empregada para investigar aqueles microrganismos que apresentam ou não essa enzima ou que são anaeróbios obrigatórios (sem enzima). O teste utiliza certos reagentes (corantes) tais como o dicloridrato de tetrametil-fenilenodiamino, que substituindo o oxigênio atua como aceptor artificial de elétrons. O corante no estado reduzido é incolor, contudo, na presença da proteína citocromo oxidase e do oxigênio atmosférico é oxidado tomando uma coloração escura. A prova é positiva quando ocorre o desenvolvimento de coloração púrpura e negativa quando não há o desenvolvimento de cor. 2.1.2 Tríplice açúcar ferro (TSI): Assim como a oxidase a tríplice açúcar ferro é uma prova determinante na identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae. Ela tem por função determinar a habilidade de um micro-organismo em utilizar glicose e ou lactose e sacarose com ou sem a produção de gás; evidenciar, ainda, a produção de gás sulfídrico (H2S) incorporados a um meio basal. O meio de TSI é empregado comumente em bacteriologia para a identificação preliminar (triagem) das enterobactérias. Todas as bactérias da família Enterobacteriaceae devem fermentar glicose. A utilização dos açúcares presentes no meio de TSI pode ocorrer aerobicamente na superfície ou anaerobicamente em profundidade, ou até mesmo simultaneamente, dependendo do potencial enzimático do micro-organismo em questão. Basicamente, encontramos no meio de TSI os três modelos de fermentação abaixo apresentados: Apenas a fermentação da glicose (básico/ácido). A superfície alcalina (vermelha) indica a ocorrência da degradação oxidativa da glicose. Após aproximadamente 18 horas de incubação, a glicose é totalmente consumida devido a sua baixa concentração (0,1%) e o micro-organismo começa então a utilizar as peptonas, presentes no meio, para o seu crescimento. O catabolismo das peptonas resulta na liberação da amônia (NH3), responsável pela alcalinização da superfície do meio de cultura. A profundidade do meio permanece amarela devido a prévia fermentação da glicose com produção de ácidos relativamente estáveis. Portanto, o pH da base se torna mais ácido que o da superfície do meio onde ocorreu a oxidação do açúcar. Fermentação da lactose, sacarose e glicose (ácido/ácido). Alguns microorganismos têm a capacidade de usar todos os açúcares presentes, resultando na acidificação da superfície e da base. Tanto a lactose como a sacarose estão presentes em concentrações 10 vezes maiores do que a glicose; portanto, após 18 horas de incubação a glicose é consumida, mas existem ainda grandes quantidades dos outros dois açúcares. Dependendo do tempo de incubação, a superfície pode se apresentar alcalina devido a depleção da lactose e sacarose com consequente utilização das peptonas presentes no meio. 31WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA A não fermentação da lactose, sacarose ou glicose (básico/básico). Certas bactérias, principalmente bacilos Gram negativos não entéricos, são incapazes de fermentar os açúcares presentes no TSI. O desenvolvimento destes micro-organismos ocorre devido a degradação das peptonas. A reação básico/básico é resultado da degradação tanto aeróbica quanto anaeróbica das peptonas. Os gases produzidos no meio de TSI são CO2 e H2 e as bactérias produtoras são chamadas aerogênicas. No caso da não formação de gases são chamadas anaerogênicas. O meio de TSI evidencia a presença de bactérias produtoras de gás sulfídrico (H2S) que são resultantes da reação em duas etapas: a) Primeira etapa: a bactéria num ambiente ácido degrada o tiossulfato de sódio (substrato) com a produção de gás sulfídrico que é um gás incolor e invisível. b) Segunda etapa: o H2S reage com o sulfato ferroso existente no meio (revelador) formando o sulfeto ferroso que é um composto insolúvel, responsável pela coloração negra que aparece no meio de TSI. É importante observar que a produção de H2S implica na produção de ácido mesmo que a coloração amarela não possa ser observada. MIO (motilidade/indol/ornitina): tem por finalidade determinar se um microrganismo é móvel ou imóvel, se tem habilidade de produzir indol a partir da molécula de triptofano e se tem ou não a habilidade de descarboxilar o aminoácido ornitina (o mesmo vale para o aminoácido lisina) com a consequente alcalinização do meio de cultivo pela formação da amina correspondente. Para a motilidade, é considerada positiva quando o microrganismo móvel, se difunde ao redor da linha da picada apresentando um aspecto de uma nuvem difusa. Já no resultado negativo, o microrganismo imóvel cresce apenas ao longo da linha de semeadura. Para o indol, ele é considerado positivo quando após a adição do reativo de Kovacs, na superfície do meio, ocorre formação de um anel vermelho e será negativo, quando não há desenvolvimento de cor. Para a ornitina/lisina, o resultado positivo é caracterizado pela coloração púrpura e negativo pela coloração amarela. Citrato de Simons: Tem por objetivo determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono. O resultado é considerado positivo quando ocorre crescimento bacteriano (com ou sem alteração da cor do meio para azul) e negativo quando há ausência de crescimento bacteriano. Fermentação de açúcares: Determina a habilidade de um microrganismo em fermentar um carboidrato específico. Normalmente utiliza-se uma base neutra (Exemplo: MBA) e adiciona- se o açúcar a ser testado. Um dos mais utilizados é a rhamnose. O resultado é caracterizado com positivo se houver fermentação e consequente acidificação do meio (coloração amarela) e negativo quando não houver fermentação e o meio ficar alcalino (coloraçãovermelha). Fenilalanina: Determina a habilidade do microrganismo em desaminar a fenilalanina com a consequente modificação do meio de cultura e formação de ácido fenilpirúvico. Para a interpretação deve ser adicionada solução de cloreto férrico diretamente no tubo inoculado, desta forma, desenvolvimento de coloração verde escura é considerado positivo e a ausência de desenvolvimento de cor será o negativo. 32WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 3. IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES DE GLICOSE Bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose (BGN-NF) vêm gradativamente adquirindo importância na bacteriologia clínica, representando importantes agentes de infecções, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Entretanto, a identificação bioquímica deste grupo de micro-organismos é bastante complexa, principalmente devido às dificuldades taxonômicas. O principal problema inerente ao uso de muitos dos sistemas compactos para a identificação de não fermentadores é a tendência desses micro-organismos apresentarem atividade bioquímica fraca ou tardia, o que produz reações falso-negativas. O microbiologista deve ter uma experiência considerável para interpretar certas reações incompletas ou fracas, que podem ocorrer durante o uso desses sistemas. Existem também os sistemas automatizados capazes de identificar bacilos não entéricos em concordância variando de 71% a 92% com os métodos convencionais. 3.1 Primeiros Indícios de que um Isolado Desconhecido É um Não- Fermentador Pode-se suspeitar que um BGN desconhecido pertença ao grupo de não-fermentadores quando se observa uma ou mais das seguintes características: a) Ausência de evidências de fermentação de glicose - Reação básica/básica (ápice e base alcalinos) em TSI ou ágar ferro de Kligler; b) Reação de citocromo oxidase- positiva - Os Não Fermentadores podem ser oxidase + ou -. Se a bactéria for oxidase + podemos excluir a família Enterobacteriaceae (exceção do gênero Plesiomonas spp). c) Dificuldade de desenvolver-se em meio de Mac Conkey (Não Fermentadores podem crescer ou não em meio de Mac Conkey., entretanto, se não houver crescimento neste meio podemos excluir a família Enterobacteriaceae). 3.1.1 Identificação preliminar Baseia-se em: morfologia celular, utilização da glicose, atividade de citocromo-oxidase e motilidade. a) Morfologia Celular: Confeccionar esfregaços a partir da colônia isolada, corar pela técnica de Gram e observar a morfologia: Bacilo, Coco ou Cocobacilo. b) Prova da Utilização da Glicose: Semear em 2 tubos de meio OF (Hugh e Leifson) glicose ou MEVAG glicose vedando um dos tubos com vaselina estéril. As tampas de rosca devem ficar levemente fechadas. Incubar a 30 - 35º C por 24 - 48 horas. c) Atividade do citocromo - oxidase: Utilizando alça de platina colocar a bactéria sobre um papel de filtro. Gotejar o reativo de tetrametil-p-fenileno-diamina HCl 1%, ou utilizar tiras de oxidase comercial. O aparecimento de cor azul dentro de 10 segundos indica prova positiva. d) Motilidade: Exame direto (gota pendente): uma alçada da suspensão bacteriana, obtida de cultivo com crescimento ativo em caldo a 25º C durante 6 a 24 horas, é colocada no centro de uma lamínula que será invertida sobre a concavidade de uma placa escavada. 33WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Examinar com objetiva de 40 X a motilidade deve ser diferenciada do movimento browniano e das correntezas de fluido causadas pela pressão da lâmina. Na verdadeira motilidade os organismos trocam de posição em relação a eles mesmos, enquanto no movimento browniano e nas correntezas de fluido eles podem parecer ativos, porém estão sempre na mesma posição em relação aos outros organismos. e) Inoculação em meio de cultura: Usa-se um meio semissólido de ágar com teor de ágar não superior a 0,3%, para não impedir a difusão, depois inocular os 4 mm superiores do meio e incubar à temperatura ambiente ou 25ºC. Realizar leitura inicial dentro de 4 a 6 horas e outra leitura após 24-48 horas a fim de detectar cepas móveis de crescimento lento. Se a motilidade é o único critério para identificar uma espécie, torna-se necessário a coloração flagelar. Os principais gêneros de bactérias, não fermentadoras da glicose e causadores de patologias em humanos, podem ser classificados, preliminarmente, baseados nas provas acima, como pode ser observado no Quadro 1, abaixo, onde: V – variável: Gênero Morfologia celular Oxidase Motilidade Oxidação de glicose Pseudomonas Bacilar + + V Burkholderia Bacilar + + + Stenotrophomonas Bacilar - + V Brevundimonas Bacilar + + + Comamonas Bacilar + + V Alcaligenes Bacilar + + - Acinetobacter Cocobacilar - - V Moraxella Cocobacilar + - - Quadro 1 - Classificação preliminar de bactérias não fermentadoras da glicose, baseada em morfologia celular, oxidase, motilidade e oxidação de glicose. Fonte: A autora. Para identificação bioquímica de bactérias não fermentadoras de glicose, em nível de espécies, deve ser seguidos fluxogramas de identificação baseados na morfologia observada na coloração de Gram. Conforme o Quadro 1, é possível observar que tanto o gênero Stenotrophomonas quanto Acinetobacter são oxidase negativa, característica marcante das bactérias da família Enterobacteriaceae. Dessa forma, muitas vezes ao se deparar com um desses gêneros, é comum o diagnóstico ser direcionado para o sistema R/b (Enterobactérias), porém ao realizar o teste do tubo de TSI, elas não fermentariam a glicose (característica fundamental para ser da família Enterobacteriaceae) e dessa forma, o diagnóstico deveria ser então direcionado para o das bactérias não fermentadoras. 34WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 4. IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS Os cocos Gram positivos (CGP) estão disseminados na natureza e podem ser isolados do ambiente ou como habitantes comensais da pele, das mucosas e de outras partes do corpo dos seres humanos e animais. A ubiquidade dessas bactérias na natureza dificulta, em certas ocasiões, a interpretação de seu isolamento de amostras de pacientes, a não ser que existam manifestações clínicas aparentes de processo infeccioso. O isolamento desses micro-organismos a partir de amostras deve ser sempre correlacionado com o quadro clínico do paciente antes que se possa estabelecer o seu papel no processo infeccioso. A maioria dos cocos Gram positivos recuperados de culturas aeróbias pode ser diferenciados com as provas bioquímicas diferenciadas de dois fluxogramas. Desta forma, para facilitar a identificação dos principais cocos Gram positivos aeróbios envolvidos em infecções humanas, podemos didaticamente dividi-los em: catalase positiva, representados principalmente pelos Staphylococcus spp. e, em catalase negativa, representados principalmente pelos Streptococcus spp. e Enterococcus spp. Assim como a oxidase é uma prova chave para os bacilos Gram negativos e a catalase a prova chave para os cocos Gram positivos. A prova bioquímica tem por objetivo verificar a presença da enzima catalase que está presente na grande maioria das bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas e que contém o complexo citocromo. Usualmente, os microrganismos que não contém citocromos também não possuem catalase. Grande parte das bactérias anaeróbias possuem peroxidase em vez de catalase. Na decomposição da molécula de água oxigenada “in vitro” uma molécula atua como substrato reduzido e a outra como um doador. O substrato reduzido pelos átomos de hidrogênio cedidos pelo doador dá como resultado um substrato reduzido (H20) e um doador oxidado (gás). A técnica consiste em colocar uma porção do cultivo bacterianoem uma lâmina limpa e desengordurada e em seguida adicionar uma gota de água oxigenada a 3%, e o resultado positivo será evidenciado pela formação imediata de bolhas de gás e o negativo pela ausência de bolhas de gás. Após o resultado da prova da catalase, é possível direcionar para qual fluxograma será utilizado na identificação, se para os catalases positiva ou negativa. [Para conhecer os fluxogramas e as provas bioquímicas para a diferenciação entre as espécies de cocos Gram positivos, é possível acessar: http://www.ifcursos.com.br/sistema/admin/ arquivos/06-41-02-esquemadeidentificaca0bacteriana1.pdf Acesso em : Jan 2021] 35WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 5. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE INFECÇÕES BACTERIANAS DO TRATO URINÁRIO De acordo com o CUMITECH-2B de 1998, a decisão de como a amostra de urina seria cultivada depende do modo de coleta e dos sinais e sintomas clínicos do paciente, mostrando a necessidade de comunicação entre o clínico e o laboratório. Para decidir qual é a melhor técnica a ser empregada para a cultura é importante definir em qual categoria a urina a ser processada se enquadra se rotina, vigilância ou especial. Para estas categorias temos a seguintes observações: a) Na Rotina: casos de infecções do trato urinário não complicadas, em adultos capazes de colher urina por micção espontânea. b) Vigilância: em idosos e pacientes com cateter de demora. c) Especial: cultura anterior falha, tratamento incompleto ou ineficaz ou ainda na suspeita de patógenos não usuais, pode ser usada coleta por punção supra púbica. Apesar de algumas bactérias causarem a maioria das infecções do trato urinário (ITU), muitos outros e diferentes organismos são possíveis patógenos do trato urinário. Alguns destes gêneros podem ser encontrados normalmente colonizando a pele do trato gênito-urinário e as células epiteliais da parede da uretra. A estratégia para um protocolo efetivo de cultura de urina permite isolamento dos patógenos mais prováveis e distingue estes de micro-organismos de colonização, entretanto protocolos para laboratórios individuais devem ser estabelecidos baseados em cooperação mútua entre médico e microbiologista. Tipo de cultura Inóculo e meio de cultura Crescimento UFC/mL Interpretação Rotina 0,001mL (1µL) AS e MC (CLED) Um isolado ≥ 104 Dois ou mais isolados ≥ 105 Identificação e antibiograma Vigilância 0,001mL (1µL) AS e MC (CLED) Um isolado ≥ 104 Dois ou mais isolados ≥ 105 Identificação e antibiograma Especial 0,001mL (1µL) e 0,01 mL (10µL) AS e MC (CLED) Se necessário incubar mais de 2 dias Um ou dois isolados – a partir de 102 Identificação e antibiograma Quadro 2 - Diretrizes, indicações e métodos para cultura dos vários tipos de urina segundo o Cumitech-2B. Fonte: A autora. 5.1 Técnica de Cultura para Contagem de Colônias A contagem de colônias deve ser feita através de técnicas de espalhamento em superfície (Inoculação com pipeta ou alça calibrada) ou “pour plate”. Em todos os métodos a urina deve ser bem homogeneizada antes de ser semeada nos meios adequados. 36WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 5.1.1 Técnica da inoculação com pipeta (técnica por diluições) Inocular 0,1 mL de uma diluição de urina em água destilada estéril a 1:100 na superfície de uma placa de Petri contendo meio de cultura para então distribuir este inoculo uniformemente, com auxílio de uma alça estéril (Alça de Drigalski) ou bastão de vidro, sobre a superfície total do meio contido na placa. Esta técnica pode dar separações inadequadas de colônias em contagens muito superiores a 100.000 bactérias por mL. Incubar as placas em estufa a 35 - 37ºC por 18 - 24 horas. Se houver crescimento, conta-se as colônias da placa e multiplica-se por 1000 expressando o resultado em número de colônias por mL de urina. 5.1.2 Técnica de “Pour Plate” Esta é considerada a técnica clássica para cultura de urina. Quando bem realizada fornece resultados confiáveis. No processo de realização desta técnica deve-se preparar diluições de urina 1:100 e 1:1000 em água destilada estéril, acrescentar 1,0 mL de cada uma dessas diluições em tubos contendo 20 mL de ágar simples fundido e resfriado à aproximadamente 50ºC, agitando suavemente para assegurar a homogeneização e imediatamente após essas ações os conteúdos dos tubos devem ser envasados para duas placas de Petri estéreis, feito isso, deixa-se solidificar o ágar das placas e incubar em estufa bacteriológica a 35 - 37ºC por 18 - 24 horas. Se houver crescimento, multiplicar o número de colônias da primeira placa por 100 e da segunda placa por 1000 para que se obtenha o número de colônias por mL de urina. 5.1.3 Técnica da alça calibrada Essa técnica é bastante utilizada por conseguir resultados satisfatórios, além de ser prática e econômica. Consiste na utilização da alça calibrada as que carreiam 0,001 mL (1µL) e 0,01 mL (10µL) que são as mais empregadas. A alça adequada, quando flambada e resfriada, é mantida verticalmente e imersa logo abaixo da superfície da urina homogeneizada; logo após a alça é movimentada para cima e para baixo, então a alçada de urina é depositada na superfície do meio de cultivo (CLED, ágar sangue, meios seletivos diferenciais) fazendo uma estria de um lado a outro da placa, a seguir o material é espalhado por toda a placa em apenas uma direção. Todos esses procedimentos proporcionam uma separação que permite a contagem de colônias na faixa de importância clínica e a seleção de colônias isoladas para estudos taxonômicos subsequentes. Se houver desenvolvimento de colônias, observar o tipo de colônia e o número e fazer a contagem multiplicando por 1000 se a alça utilizada para a semeadura foi de 1µL e por 100 se a alça foi de 10µL. O volume dispensado pelas alças calibradas pode mudar com o uso repetido devido a deformação, corrosão ou acúmulo de material incinerado. As alças devem ser regularmente inspecionadas para confirmar se ainda são circulares e se os anéis estão íntegros. As alças calibradas não devem ser usadas para semeadura de rotina ou para outros espécimes a não ser que seja necessária uma quantificação (Alça calibrada não deve ser passada pelo álcool-areia). 37WWW.UNINGA.BR AN ÁL IS ES M IC RO BI OL ÓG IC AS , P AR AS IT ÁR IA S E AU TO IM UN ES | U NI DA DE 2 EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA 5.1.4 Escolha do volume da alça calibrada A definição de qual alça utilizar se 1µL ou 10µL deve ser norteada conforme Quadro 2. Entretanto, em nossa realidade diária nem sempre obtemos as informações necessárias para seguir o protocolo contido nesse quadro (CUMITECH realidade americana), então podemos definir o volume da alça calibrada por uma triagem realizada através da coloração de Gram da gota de urina não centrifugada. Para a realização desta triagem, uma gota de 10µL da amostra de urina homogeneizada será depositada sobre uma lâmina utilizando-se uma alça calibrada de 10µL, após a secagem a lâmina será corada pelo Gram e analisada. Se >1 bactéria/ campo de imersão em óleo for observada, a alça calibrada escolhida será de 1µL e se ao contrário a <1 bactéria/campo de imersão em óleo for observada, então a alça será de 10µL. A realização desta triagem auxilia, também, na escolha do meio de cultura a ser empregado através da morfologia e reação ao Gram do microrganismo presente. 5.2 Meio de Cultura e Condições de Incubação Infelizmente não existe uma melhor maneira de fazer cultura de todos os tipos de urina, então o ideal seria que a técnica e o meio fossem selecionados com base na população de pacientes e suspeita clínica (tabela 1). O ágar CLED (Cistina-Lactose-Eletrólitos Deficiente) é o mais utilizado por favorecer o crescimento de bacilos Gram negativos e de cocos Gram positivos, além de
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