Marcadores moleculares

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Marcadores moleculares
Conceitos básicos
● Fenótipo
○ Propriedades observáveis de um indivíduo, que se desenvolveram sob
a influência de
■ Genótipo do indivíduo
■ Fatores ambientais
● Genótipo
○ Constituição genética de um organismo como revelada pela análise
genética e molecular, ou seja, o conjunto completo de genes, tanto
dominantes e recessivos
● Diplóide: constituído por duas cópias homólogas de cada cromossomo
● Alelo: as formas alternativas de um caráter genético encontrado em um
determinado locus de um cromossomo
● Homozigoto: um organismo diploide com alelos idênticos de um determinado
gene em ambos os cromossomos homólogos
● Heterozigoto: um organismo diploide com alelos diferentes de um
determinado gene em ambos os cromossomos homólogos
Marcadores
● Qualquer característica morfológica ou molecular que diferencia indivíduos,
e que seja facilmente identificável
● Marcadores morfológicos
○ É um fenótipo de fácil identificação, normalmente determinado por um
único alelo
○ Características fenotípicas de fácil identificação visual são uados
como marcadores morfológicos desde os tempos de Mendel
● Marcadores moleculares (de DNA)
○ Polimorfismo detectado na sequencia/tamanho do DNA
○ Vantagens:
■ Não é objeto de influências ambientais
■ Praticamente ilimitado em número
○ A maior desvantagem é a necessidade de técnicas e equipamentos
mais complexos
○ Características importantes:
■ Reprodutibilidade
■ Amplamente distribuído através do genoma
■ Poder de discriminação
■ Ausência de influências ambientai s
■ Baixo custo
■ Fácil de mensurar
● Tipos de marcadores:
● Herança Mendeliana
○ Herança: refere-se ao modo como os marcadores são expressos nos
indivíduos (por codominância ou dominância dos alelos)
● RAPD - Random Amplified Polymorphism DNA (polimorfismo de DNA
amplificado ao acaso)
○ Representa regiões codificadoras ou não do genoma, de distribuição
aleatória
○ Dominante: apenas presença ou ausência de banda (não identifica
heterozigotos
○ Base genética:
■ Amplificação via PCR
■ Utiliza apenas um primer curto e aleatório
■ Primer se anela em diversas partes do genoma
■ Polimorfismo se origina da mutação no sítio de anelamento do
primer
● AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism - polimorfismo de tamanho
de fragmento amplificado
○ Na maioria, representam regiões não expressas do genoma
○ Dominante:
■ Apenas ausência e presença da banda (não identifica
heterozigotos)
○ Base genética:
■ Clivagem do DNA por enzimas de restrição
■ Ligação de adaptadores
■ Amplificação seletiva dos fragmentos
■ Análise dos fragmentos em gel de poliacrilamida
● Microssatélites ou SSR - Simple Sequence Repeats - sequência simples
repetidas
○ Pequenas sequências de DNA (1 a 6 nucleotídeos) repetidos em tandem
○ Codominante
■ Indivíduos heterozigotos são detectados
○ Multialélicos e amplamente distribuído no genoma
○ Base genética:
■ Amplificação de locus específicos de sequências repetitivas
■ Baseados em PCR com primers específicos
■ Primers específicos (ca 20 pb)
■ Diferentes números de elementos simples repetidos
■ Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa
um alelo diferente no mesmo locus
● SNPs - Single Nucleotide Polymorphism, ou snip
○ Pequena mudança, ou variação. Que pode ocorrer em um único
nucleotídeo em uma sequência de DNA em um porção significativa
(mais de 1%) de uma população
○ SNPs são as mais frequentes formas de variações genéticas
○ 90% das variações genéticas humanas vem de SNPs
○ SNPs tem se tornado marcadores de preferência pela sua grande
abundância e pelo desenvolvimento de tecnologias de genotipagem
em larga escala
○ SNPs são encontrados em menor quantidade de genes do que em
regiões não-codificantes
○ Menor quantidade de SNPs nos cromossomos sexuais (humano)
○ Dentro de um único cromossomo, SNPs podem se concentrar em uma
região específica, geralmente implicando uma região de interesse ou
pesquisa
○ Em média, ocorrem a cada 300-600 nucleotídeos (humanos)
● Genotipagem
● O PCR
○ Síntese in vitro de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA
polimerase, a mesma que participa da replicação do material genético
das células
○ 1º etapa é a desnaturação da molécula de DNA - a quebra das pontes
de hidrogênio entre as fitas (94°C)
○ 2º etapa envolve Anelamento dos iniciadores nas fitas separadas -
cada marcador tem uma temperatura específica (depende da
quantidade de C e G)
○ 3° etapa processo de extensão TAC adicionando novos fragmentos
(70-72°C)
○ Quanto mais ciclos mais cópias
● Eletroforese
○ É uma técnica usada para separar moléculas carregadas, como o DNA,
RNA e proteínas, de acordo com o seu tamanho
○ As moléculas se movem através de um gel quando uma corrente
elétrica é a aplicada
○ O DNA tem carga negativa, portanto quando uma corrente elétrica é
aplicada ao gel, o DNA irá migrar para o eletrodo carregado
positivamente